鄭 恬，徐修禮，白 露，陳 瀟，劉家云，郝曉柯

（空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，西安 710032）

0 引言

隨著電子科技和通信技術(shù)的進(jìn)步以及成像技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用[1-2]，臨床微生物檢驗(yàn)自動(dòng)化得到蓬勃的發(fā)展，微生物檢驗(yàn)傳統(tǒng)的手工接種方式發(fā)生了質(zhì)的飛躍，為微生物檢驗(yàn)發(fā)展創(chuàng)造了有利條件[3]。全自動(dòng)微生物前處理系統(tǒng)在臨床中的應(yīng)用既降低了差錯(cuò)率，保證了生物安全，又提供了樣本接種流程標(biāo)準(zhǔn)化的操作平臺(tái)，降低了微生物檢驗(yàn)人員的工作強(qiáng)度，使其擺脫重復(fù)、煩瑣的操作，精于檢驗(yàn)后流程的質(zhì)量控制，確保結(jié)果數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性及其可靠性[4-6]。當(dāng)前，國(guó)內(nèi)外研發(fā)了一批全自動(dòng)微生物前處理系統(tǒng)，如意大利Copan公司的WASP、法國(guó)bioMerieux公司的PREVI?Isola、美國(guó)BD公司的Innova以及中國(guó)武漢迪艾斯科技有限公司的Diascie ProBact等[7-8]，為臨床微生物檢驗(yàn)自動(dòng)化奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)[9]。我科于2014年在國(guó)內(nèi)率先引進(jìn)了Copan WASP全自動(dòng)微生物前處理系統(tǒng)，經(jīng)對(duì)系統(tǒng)參數(shù)的探討、分析，設(shè)置優(yōu)化樣本處理方案，聯(lián)接實(shí)驗(yàn)室信息系統(tǒng)（laboratory information system，LIS），利用條碼識(shí)別對(duì)臨床樣本自動(dòng)化接種，大大地提高了工作效率。然而，在臨床應(yīng)用中，如何正確使用儀器，以及如何應(yīng)對(duì)ISO 15189對(duì)儀器性能評(píng)估的要求[10]，目前報(bào)道較少。本文就我科使用的Copan WASP全自動(dòng)微生物前處理系統(tǒng)的主要儀器的工作性能進(jìn)行評(píng)估，并對(duì)臨床樣本分離培養(yǎng)效果與手工法（Manual）進(jìn)行比較，探討其在臨床中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來(lái)源

痰和中段尿標(biāo)本各50份均采集自我院各病區(qū)?；撴溓蚓鶤TCC19615、銅綠假單胞菌ATCC27853、金黃色葡萄球菌ATCC25923和大腸埃希菌ATCC 25922標(biāo)準(zhǔn)菌株購(gòu)自衛(wèi)生健康委員會(huì)臨床檢驗(yàn)中心。

1.1.2 儀器設(shè)備

Copan WASP全自動(dòng)微生物前處理系統(tǒng)由意大利Copan公司生產(chǎn)，微生物鑒定分析系統(tǒng)Vitek-MS購(gòu)自法國(guó)bioMerieux公司。

1.1.3 試劑耗材

痰消化劑Sputasol購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司，Copan12無(wú)菌痰管及挑痰棒購(gòu)自意大利Copan公司，Vitek-MS基質(zhì)液及靶板購(gòu)自法國(guó)bio-Merieux公司，血瓊脂平板、含萬(wàn)古霉素巧克力平板和麥康凱平板購(gòu)自鄭州安圖生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 混合菌懸液配制

將化膿鏈球菌ATCC19615、銅綠假單胞菌ATCC27853、金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸埃希菌ATCC25922 4種標(biāo)準(zhǔn)菌株用無(wú)菌生理鹽水配置為0.5標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)蠞岫葐尉鷳乙海?.5×108cfu/ml），并分別稀釋成 1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104和 1.0×103cfu/ml系列單菌懸液，再按 1∶1、1∶1∶1 或 1∶1∶1∶1比例將單菌懸液配制為含2、3、4種菌株的不同濃度的混合菌懸液共16份，以評(píng)估前處理系統(tǒng)的性能。混合菌懸液配制方案見(jiàn)表1。

表1 混合菌懸液配制方案cfu/ml

1.2.2 樣本處理、接種與培養(yǎng)

1.2.2.1 樣本處理

使用挑痰棒挑取痰標(biāo)本可疑部分，置于含1 ml痰消化劑的Copan12無(wú)菌痰管中，35～37℃孵育90 min，使痰液均質(zhì)化，制成痰標(biāo)本懸液；中段尿標(biāo)本則倒入特定的無(wú)菌尿杯中，粘貼條碼備用。

1.2.2.2 樣本接種

儀器接種：痰標(biāo)本采用4 Quadrants type 1模式四區(qū)劃線(xiàn)；尿標(biāo)本采用Single streak type 2模式連續(xù)劃線(xiàn)；混合菌懸液采用4 Quadrants type 1模式四區(qū)劃線(xiàn)。

手工接種：由同一位具有豐富工作經(jīng)驗(yàn)、操作熟練的檢驗(yàn)人員嚴(yán)格按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》（第4版）接種步驟操作[11]。痰標(biāo)本懸液使用無(wú)菌棉簽蘸取并涂布于平板的第一區(qū)，再以接種環(huán)進(jìn)行四區(qū)劃線(xiàn)。痰標(biāo)本接種于血瓊脂平板、含萬(wàn)古霉素巧克力平板和麥康凱平板，尿液標(biāo)本接種于血瓊脂平板和麥康凱平板，混合菌懸液接種于單一的血瓊脂平板，一式3份，且均使用1 μl接種環(huán)。

1.2.2.3 細(xì)菌培養(yǎng)

Copan WASP全自動(dòng)微生物前處理系統(tǒng)由WASP接種劃線(xiàn)模塊和WASPLab孵育及鏡像系統(tǒng)模塊組成，兩者通過(guò)軌道連接，經(jīng)WASP接種劃線(xiàn)模塊接種完畢的平板直接運(yùn)送入WASPLab孵育及鏡像系統(tǒng)模塊中進(jìn)行培養(yǎng)、拍照。系統(tǒng)參數(shù)設(shè)置：痰標(biāo)本和混合菌懸液的孵育環(huán)境為35℃、含5%CO2的二氧化碳孵箱，中段尿標(biāo)本的孵育環(huán)境為35℃普通孵箱。手工法的培養(yǎng)環(huán)境同儀器法。

1.2.3 菌落鑒定

所有平板培養(yǎng)24 h后進(jìn)行拍攝和菌落觀(guān)察，當(dāng)肉眼可見(jiàn)菌落生長(zhǎng)時(shí)，挑取單個(gè)菌落均勻涂布于微生物鑒定系統(tǒng)Vitek-MS專(zhuān)用靶板，然后采用該儀器對(duì)菌落進(jìn)行鑒定，并記錄最終鑒定結(jié)果。

1.2.4 判讀標(biāo)準(zhǔn)

中段尿及痰標(biāo)本分別依定量方式與半定量方式判讀。中段尿標(biāo)本結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)：菌落生長(zhǎng)個(gè)數(shù)≤100，記為菌落個(gè)數(shù) 1.0×103cfu/ml；菌落生長(zhǎng)個(gè)數(shù)＞100，記為菌落個(gè)數(shù)＞1.0×105cfu/ml。痰標(biāo)本結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)：一區(qū)生長(zhǎng)≤10個(gè)菌落，記為菌落個(gè)數(shù)≤1.0×104cfu/ml；一區(qū)生長(zhǎng)＞10個(gè)菌落且二區(qū)生長(zhǎng)≤5個(gè)菌落，記為菌落個(gè)數(shù)1.0×105cfu/ml；一區(qū)生長(zhǎng)＞10個(gè)菌落、二區(qū)生長(zhǎng)＞5個(gè)菌落且三區(qū)生長(zhǎng)≤5個(gè)菌落，記為菌落個(gè)數(shù)1.0×106cfu/ml；一區(qū)生長(zhǎng)＞10個(gè)菌落、二區(qū)生長(zhǎng)＞5個(gè)菌落且三區(qū)生長(zhǎng)＞5個(gè)菌落，記為菌落個(gè)數(shù)≥1.0×107cfu/ml。

1.2.5 性能評(píng)估

1.2.5.1 重現(xiàn)性

使用1 μl接種環(huán)連續(xù)接種1.0×104cfu/ml濃度的大腸埃希菌懸液于10個(gè)血瓊脂平板，根據(jù)單個(gè)菌落計(jì)數(shù)評(píng)估儀器的重現(xiàn)性。

1.2.5.2 交叉污染

采用1.0×105cfu/ml濃度大腸埃希菌懸液和無(wú)菌生理鹽水3個(gè)循環(huán)交替采樣（即懸液—生理鹽水—懸液—生理鹽水—懸液—生理鹽水），并按連續(xù)劃線(xiàn)模式接種于血瓊脂平板，同等孵育條件下（35℃普通孵箱）培養(yǎng)后觀(guān)察結(jié)果，根據(jù)無(wú)菌生理鹽水在平板上有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)評(píng)定儀器是否存在交叉污染。如果接種無(wú)菌生理鹽水的平板上有細(xì)菌生長(zhǎng)，且為前一個(gè)標(biāo)本中的細(xì)菌則為交叉污染試驗(yàn)陽(yáng)性；如均無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，則為交叉污染試驗(yàn)陰性。

1.2.5.3 方法學(xué)一致性

16種混合菌懸液經(jīng)手工法與儀器法劃線(xiàn)，每種一式3份，接種于血瓊脂平板，培養(yǎng)后，通過(guò)對(duì)生長(zhǎng)的菌種數(shù)量、菌落計(jì)數(shù)的比較分析2種方法是否存在差異性。

1.2.5.4 臨床應(yīng)用評(píng)價(jià)

分別比較臨床50份痰標(biāo)本150塊平板（血瓊脂平板、含萬(wàn)古霉素巧克力平板和麥康凱平板各50塊）及50份中段尿標(biāo)本100塊平板（血瓊脂平板和麥康凱平板各50塊）儀器法與手工法兩者間的菌種數(shù)量、菌落計(jì)數(shù)及其單個(gè)菌落數(shù)量差異性，評(píng)價(jià)Copan WASP全自動(dòng)微生物前處理系統(tǒng)在臨床應(yīng)用的可行性。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

分別收集16份混合菌懸液及50份痰標(biāo)本、50份中段尿標(biāo)本在培養(yǎng)平板中的分離菌種數(shù)量、菌落計(jì)數(shù)以及單個(gè)菌落的數(shù)量，保存平板菌落分離效果圖像。單個(gè)菌落數(shù)量以±s表示。采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件Mann-Whitney U非參數(shù)秩和檢驗(yàn)分析儀器與手工劃線(xiàn)接種方法在菌種數(shù)量、菌落計(jì)數(shù)的一致性，單個(gè)樣本t檢驗(yàn)分析10個(gè)連續(xù)接種平板的菌落計(jì)數(shù)均值與理論值的一致性，ANOVA單因素方差檢驗(yàn)對(duì)2種不同方法的單個(gè)菌落數(shù)量進(jìn)行比較，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重現(xiàn)性

以1 μl接種環(huán)連續(xù)接種1.0×104cfu/ml濃度的大腸埃希菌懸液于10個(gè)血瓊脂平板，培養(yǎng)后，菌落計(jì)數(shù)為8.0×103～1.4×104cfu/ml[（1.07±0.21）×104cfu/ml]，與理論值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.322＞0.05），儀器具有高度的重現(xiàn)性。

2.2 交叉污染

采用1.0×105cfu/ml濃度大腸埃希菌懸液與無(wú)菌生理鹽水交替采樣并以連續(xù)劃線(xiàn)模式接種于血平板，無(wú)菌生理鹽水平板上均無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。

2.3 方法學(xué)一致性

16個(gè)不同濃度混合菌懸液接種48塊平板（16×3）共 147（49×3）種菌株，培養(yǎng)后其回收的菌株和菌落計(jì)數(shù)結(jié)果分別如圖1和表2、3所示。在48塊平板（共含147種菌株）中，儀器法和手工法均可回收混合菌懸液中所有菌株的平板數(shù)量分別為17和22塊（如圖1所示），分離的菌株數(shù)量分別為114和106種，未能回收的菌株數(shù)量分別為33和41種（見(jiàn)表2）。儀器法與手工法差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.251＞0.05），但儀器法仍可回收更多的菌株，其菌落分離能力較手工法提高了7.55%。同時(shí)，16個(gè)不同濃度混合菌懸液在48塊平板中生長(zhǎng)的菌落計(jì)數(shù)亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.492＞0.05）。

圖1 48塊平板混合菌懸液2種接種方法不同菌種的平板回收情況

表2 混合菌懸液2種接種方法分離出不同種類(lèi)菌株數(shù)量的未能回收情況（n=147）種

表3 混合菌懸液2種接種方法不同菌落計(jì)數(shù)的平板回收情況（n=48）塊

2.4 臨床應(yīng)用評(píng)價(jià)

2.4.1 分離菌種數(shù)量

痰標(biāo)本接種于血瓊脂平板、含萬(wàn)古霉素的巧克力平板和麥康凱平板（共150塊平板），而尿標(biāo)本接種于血瓊脂平板和麥康凱平板（共100塊平板），培養(yǎng)后分離的菌種數(shù)量分布見(jiàn)表4。痰標(biāo)本：儀器法和手工法分離出0種（無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)）、1種、2種及≥3種菌株的平板數(shù)量分別為 8、11、60、71 及 11、16、58、65 塊，2種方法間不同菌株種類(lèi)數(shù)量采用Mann-Whitney U非參數(shù)秩和檢驗(yàn)進(jìn)行比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.549＞0.05）。尿標(biāo)本：儀器法和手工法分離出0種（無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)）、1種、2種及≥3種菌株的平板數(shù)量分別為 26、34、28、12 及 28、36、24、12 塊，2 種方法間不同菌株種類(lèi)數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.639＞0.05）。

表4 50份痰及中段尿標(biāo)本2種接種方法不同菌種數(shù)量的平板數(shù)塊

2.4.2 菌落計(jì)數(shù)

痰和中段尿標(biāo)本各50份分別采用手工法和儀器法劃線(xiàn)接種，培養(yǎng)后分離的菌落計(jì)數(shù)分布見(jiàn)表5、6。儀器法與手工法2種方法間菌落計(jì)數(shù)采用Mann-Whitney U非參數(shù)秩和檢驗(yàn)進(jìn)行比較，痰和尿標(biāo)本的菌落計(jì)數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（痰：P=0.154＞0.05；尿：P=0.895＞0.05）。

表5 50份痰標(biāo)本2種接種方法不同菌落計(jì)數(shù)的平板數(shù)（n=150）塊

表6 50份中段尿標(biāo)本2種接種方法不同菌落計(jì)數(shù)的平板數(shù)（n=100）塊

2.4.3 單個(gè)菌落數(shù)量

儀器法和手工法的劃線(xiàn)接種效果如圖2、3所示，儀器法菌落區(qū)間生長(zhǎng)明顯，單個(gè)菌落邊緣、分界清晰，但手工法菌落略顯密集生長(zhǎng)。該現(xiàn)象可能由手工接種時(shí)檢驗(yàn)人員用力不均所致。50份痰樣本共150塊平板及50份中段尿樣本共100塊平板不同方法之間的單個(gè)菌落計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表7。兩者的單個(gè)菌落數(shù)量采用ANOVA單因素方差檢驗(yàn)進(jìn)行比較，儀器法優(yōu)于手工法，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（痰：P=0.111＞0.05；尿：P=0.532＞0.05）。

圖2 痰標(biāo)本2種方法分離效果

3 討論

臨床微生物學(xué)是研究微生物的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、分類(lèi)、生命活動(dòng)規(guī)律的一門(mén)科學(xué)，是臨床醫(yī)學(xué)的基礎(chǔ)之一，可為指導(dǎo)感染性疾病的診斷、治療和預(yù)防提供專(zhuān)業(yè)依據(jù)和知識(shí)支持。目前，在檢驗(yàn)其他專(zhuān)業(yè)領(lǐng)域（如臨床檢驗(yàn)、免疫檢驗(yàn)、生化檢驗(yàn)等）均普及全自動(dòng)流水線(xiàn)的情形下，由于各種原因，大多數(shù)微生物實(shí)驗(yàn)室仍采用傳統(tǒng)的手工方法對(duì)臨床樣本進(jìn)行劃線(xiàn)接種、培養(yǎng)、分離。但是由于手工方法因不同的操作人員其接種手法、習(xí)慣和熟練程度不同，對(duì)標(biāo)本的菌落分離效果可能產(chǎn)生較為明顯的影響，且在接種時(shí)可能發(fā)生樣本“張冠李戴”的差錯(cuò)情況，生物安全亦存在著一定的風(fēng)險(xiǎn)。全自動(dòng)微生物分離與培養(yǎng)流水線(xiàn)系統(tǒng)在臨床中的廣泛應(yīng)用不但可彌補(bǔ)和改善手工方法的不足，對(duì)標(biāo)本的接種進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化[12]，而且由于全自動(dòng)微生物流水線(xiàn)系統(tǒng)連接自動(dòng)數(shù)字讀板設(shè)備，采用條碼識(shí)別功能，提高了標(biāo)本的溯源性、樣本接種的效率和菌落分離的效果，避免了人為的差錯(cuò)和手工煩瑣重復(fù)勞動(dòng)，減少了二次分離次數(shù)，加快了結(jié)果報(bào)告時(shí)間，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了微生物培養(yǎng)的實(shí)時(shí)監(jiān)視，即時(shí)為臨床提供實(shí)驗(yàn)室微生物檢驗(yàn)信息[13-14]。

圖3 尿標(biāo)本2種方法分離效果

表7 50份痰標(biāo)本（150塊平板）和50份中段尿標(biāo)本（100塊平板）不同接種方法單個(gè)菌落數(shù)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果（±s）個(gè)

表7 50份痰標(biāo)本（150塊平板）和50份中段尿標(biāo)本（100塊平板）不同接種方法單個(gè)菌落數(shù)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果（±s）個(gè)

接種方法 痰 尿儀器法 26.28±5.31 9.74±4.49手工法 20.84±5.59 7.33±5.03

本文對(duì)當(dāng)前廣為使用的意大利Copan公司研發(fā)的WASP全自動(dòng)微生物前處理系統(tǒng)的工作性能進(jìn)行了評(píng)估，對(duì)10個(gè)血瓊脂平板獲得的菌落計(jì)數(shù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，其均值與理論值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明儀器具有高度的重現(xiàn)性。同時(shí)，在無(wú)菌生理鹽水平板上均無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，儀器無(wú)交叉攜帶污染，避免了假性結(jié)果。在16個(gè)不同濃度混合菌懸液接種的48塊血瓊脂平板共計(jì)147種菌株中，手工法與儀器法可回收菌株的數(shù)量與未回收菌株的數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），顯示儀器法與手工法的一致性滿(mǎn)足臨床的需要，而且儀器法可回收更多的菌株，菌落分離能力提高了7.55%，從而進(jìn)一步提高了細(xì)菌的陽(yáng)性檢出率。

在50份痰標(biāo)本的臨床應(yīng)用中，菌株較多時(shí)儀器法的菌種分離數(shù)量比手工法略顯優(yōu)勢(shì)。但手工法無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)平板比儀器法多3塊，這可能是由于痰標(biāo)本在前處理過(guò)程中Copan WASP全自動(dòng)微生物前處理系統(tǒng)的消化時(shí)間長(zhǎng)并且有15 s振蕩時(shí)間，使痰液充分液化，使得細(xì)菌完全釋放，但2種方法之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與王賀等[15]研究結(jié)果相一致。而在中段尿標(biāo)本中，儀器法無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)平板數(shù)（26塊）卻少于手工法（28塊），這是由于尿液標(biāo)本無(wú)需準(zhǔn)備處理，本身均質(zhì)性好，且雜菌少，此時(shí)更顯儀器法規(guī)范化接種方式的優(yōu)勢(shì)。2種方法在尿標(biāo)本菌株分離數(shù)量無(wú)明顯差異（P＞0.05）。

在菌落計(jì)數(shù)方面，CopanWASP全自動(dòng)微生物前處理系統(tǒng)對(duì)痰標(biāo)本分離出高濃度（≥1.0×107cfu/ml）平板明顯高于手工法?？赡苁怯捎谠撉疤幚硐到y(tǒng)自動(dòng)化程度高，劃線(xiàn)接種與孵育培養(yǎng)的一體化裝置使樣本接種完畢無(wú)需平板轉(zhuǎn)移，而是經(jīng)軌道直接送入孵箱，并按照設(shè)置條件進(jìn)行孵育。而手工法劃線(xiàn)接種后則需要人為地將平板轉(zhuǎn)入孵箱，對(duì)細(xì)菌培養(yǎng)可能具有一定的影響，尤其是標(biāo)本的苛氧菌培養(yǎng)的生長(zhǎng)。而對(duì)中段尿標(biāo)本分離出的各濃度菌落的平板數(shù)量2種接種方法的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.895）。

單個(gè)菌落生長(zhǎng)情況及數(shù)量結(jié)果表明，手工法單個(gè)菌落生長(zhǎng)密度相對(duì)集中，分離度稍差。盡管如此，無(wú)論在痰標(biāo)本抑或中段尿標(biāo)本中，儀器法與手工法的單個(gè)菌落平均數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。而提高單個(gè)菌落分離數(shù)量，可減少二次分離次數(shù)，便于及時(shí)進(jìn)入菌落菌屬鑒定及其藥物敏感性試驗(yàn)的下一步操作程序，從而縮短報(bào)告流程時(shí)間[16-17]，快速為臨床提供準(zhǔn)確的診斷依據(jù)。

綜上所述，Copan WASP全自動(dòng)微生物前處理系統(tǒng)主要性能指標(biāo)表現(xiàn)突出，優(yōu)于手工方法，樣本處理充分、勻質(zhì)性高，提高了微生物標(biāo)本檢驗(yàn)陽(yáng)性率和工作效率，縮短了報(bào)告流轉(zhuǎn)時(shí)間，實(shí)現(xiàn)了微生物檢查劃線(xiàn)接種的標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化，可替代手工法廣泛地應(yīng)用于臨床。