連若純，徐仕儒，許健，刁梁輝，黃春宇，曾勇

（深圳中山泌尿外科醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，深圳市圍著床期生殖免疫重點實驗室，深圳中山生殖與遺傳研究所，深圳 518045）

控制性促排卵（COH）是IVF－ET的首要步驟和關(guān)鍵環(huán)節(jié)，為了獲得更多成熟卵母細(xì)胞，使用大劑量的促排卵藥物，可導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥——卵巢過度刺激征（OHSS）的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)高雌激素水平是導(dǎo)致OHSS發(fā)生的重要病因，且OHSS的發(fā)生與高凝狀態(tài)、血栓形成密切相關(guān)［1－2］。隨著輔助生育技術(shù)的進(jìn)步和需求量增加，如何提高IVF／ICSI－ET成功率，降低OHSS發(fā)生概率，也越來越受關(guān)注。D－二聚體是高凝狀態(tài)和內(nèi)源性纖溶系統(tǒng)的重要標(biāo)志物，是預(yù)測血栓事件的重要指標(biāo)之一［3］。但雌二醇（E2）水平與D－二聚體之間是否存在相關(guān)性，可否通過D－二聚水平預(yù)測OHSS發(fā)生風(fēng)險，目前鮮有研究。另外，妊娠本身是一種高凝狀態(tài)，隨著早期、中期、晚期妊娠的發(fā)展，D－二聚體水平隨之顯著升高，并且與孕周顯著正相關(guān)，但早孕期D－二聚體水平并不能預(yù)測早期流產(chǎn)的發(fā)生［4］。但有研究提出，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者早孕期D－二聚體水平顯著升高，存在血栓形成傾向，檢測血漿D－二聚可能可預(yù)測復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者發(fā)生血栓的風(fēng)險，提前給予干預(yù)治療可以改善妊娠結(jié)局［5］。關(guān)于D－二聚體對妊娠結(jié)局的預(yù)測作用仍存在爭議。本研究旨在分析COH后高水平E2與D－二聚體之間的相關(guān)性，評估D－二聚體預(yù)測IVF／ICSI－ET患者發(fā)生OHSS及不良妊娠結(jié)局的潛在價值。

材料與方法

一、研究對象

回顧性分析2016年6月至2017年5月于我院生殖科行IVF／ICSI治療的100例不孕不育患者的病歷資料，年齡20～38歲，均采用黃體期長方案促排卵。入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡≤38歲；（2）采用黃體期長方案促排卵；（3）雙側(cè)卵巢基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)＞6個，男方非手術(shù)取精。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）多囊卵巢綜合征患者；（2）高血壓病史、糖尿病病史、動靜脈血栓病史、肝臟疾病、腎臟疾病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡病史患者；（3）吸煙患者；（4）近2月服用過避孕藥或雌孕激素類藥物；（5）HCG注射日或之前已確定不行新鮮胚胎移植患者。排除其他因素后，實際入組69例，根據(jù)妊娠結(jié)局分為：正常妊娠組（44例），即成功分娩者；妊娠失敗組（25例），包括移植后未妊娠、生化妊娠丟失、流產(chǎn)等情況。

二、研究方法

1．標(biāo)本采集：所有患者均接受黃體期長方案COH。血樣采集時間點：（1）黃體期降調(diào)日（促排前）：黃體期使用降調(diào)節(jié)藥物進(jìn)行治療當(dāng)天；（2）HCG注射日（扳機(jī)日）：使用HCG注射進(jìn)行扳機(jī)當(dāng)天；（3）新鮮胚胎移植后2周（驗孕日）：驗孕日是患者移植胚胎后2周進(jìn)行血HCG測定日。用枸櫞酸鹽1∶9抗凝管抽取外周血2ml，1 500g離心 15min，待用。

2．D－二聚體檢測方法：檢測方法為酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA法），采用酶聯(lián)免疫夾心兩步法和熒光檢測（ELFA）相結(jié)合的原理，根據(jù)檢測試劑盒的說明書，讀取mLE批號信息，校正標(biāo)準(zhǔn)曲線后，放入試劑盒的試劑條和固相管SPR，加入200μl枸櫞酸鈉抗凝血血漿，然后按開始鍵開始自動檢測并打出結(jié)果報告。檢測試劑：D－二聚體排除試驗試劑盒（SA，法國）。異常指標(biāo)：＞500ng／ml。

3．IVF－ET 促排方案：采用黃體期長方案COH，用短效注射用曲普瑞林 （達(dá)菲林，博福益普生，法國）。降調(diào)節(jié)，達(dá)到降調(diào)標(biāo)準(zhǔn)后開始使用注射用重組FSH（果納芬，雪蘭諾，瑞士）或注射用尿FSH（麗申寶，珠海麗珠制藥）促排卵，促排卵當(dāng)日短效達(dá)菲林改成0．05mg／d，陰道超聲監(jiān)測卵泡發(fā)育。當(dāng)有兩個主導(dǎo)卵泡直徑≥18mm時，當(dāng)晚肌肉注射 HCG 10 000U，34～36h后在陰道 B超引導(dǎo)下穿刺取卵，同時記錄獲卵數(shù)。取卵3～4h后受精，16～18h后觀察受精情況，并繼續(xù)培養(yǎng)至72h左右移植1～3個胚胎，同時記錄受精數(shù)、卵裂數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)。取卵當(dāng)天即開始行黃體支持治療，采用黃體酮60mg／d肌肉注射支持黃體。移植術(shù)后13d初步確診早孕，移植后30d超聲檢查宮內(nèi)有孕囊及胎芽、胎心搏動則診斷臨床妊娠，即成功妊娠。為降低OHSS發(fā)生率，取卵個數(shù)≥20取消新鮮胚胎移植。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

利用SPSS 23．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料數(shù)據(jù)結(jié)果以（）表示。兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗；多組之間比較采用單因素ANOVA檢驗；兩變量之間的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析。P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、一般資料

本研究中行IVF／ICSI治療的100例不孕癥患者均接受黃體期長方案COH，平均取卵（12．1±3．7）個，MⅡ卵（11．2±3．3）個，所有患者促排前后均未發(fā)現(xiàn)血栓相關(guān)疾病病史。其中31例患者因以下原因取消新鮮胚胎移植：宮腔異常（1例）、高孕酮水平（2例）、抗磷脂綜合征高滴度（3例）、取卵個數(shù)≥20個疑似OHSS或確診輕度OHSS（25例）。另69例進(jìn)行新鮮胚胎移植，HCG陽性率78．3%（54／69），胚胎著床率50．0%（66／132），臨床妊娠率68．2%（47／69），異位妊娠1例，2例發(fā)生早期流產(chǎn)，其中1例為絨毛染色體非整倍數(shù)目異常。

根據(jù)妊娠結(jié)局將69例患者分為正常妊娠組（n＝44）與妊娠失敗組（n＝25），兩組患者年齡、基礎(chǔ)FSH、AMH、BMI、不孕年限、Gn使用劑量等均無顯著性差異（P＞0．05）（表1）。

表1 正常妊娠組與妊娠失敗組患者基線資料［（），%］

表1 正常妊娠組與妊娠失敗組患者基線資料［（），%］

組 別 例數(shù) 年齡 FSH（U／L） AMH（ng／ml） BMI（kg／m2） 不孕年限正常妊娠組 44 30．4±4．4 6．5±1．2 4．2±2．6 21．8±3．2 3．4±2．2妊娠失敗組 25 30．9±4．3 7．5±3．3 4．7±4．1 23．1±3．6 4．0±2．0組 別 例數(shù) 獲卵數(shù) 移植胚胎數(shù) 移植優(yōu)胚數(shù) 囊胚數(shù)占比 Gn總量（U）正常妊娠組 44 12．2±3．7 2．0±0．4 1．9±0．6 65．52 2 264±715妊娠失敗組 25 11．8±3．8 1．8±0．6 1．8±0．5 55．56 2 564±702

二、不同時間點D－二聚體濃度變化情況

在降調(diào)日、扳機(jī)日以及驗孕日3個不同時間點抽取枸櫞酸鈉抗凝血進(jìn)行D－二聚體檢測，結(jié)果顯示：D－二聚體濃度在降調(diào)日、扳機(jī)日及驗孕日分別為（280±160）ng／ml、（240±190）ng／ml、（1 100±540）ng／ml，降調(diào)日與扳機(jī)日D－二聚體濃度無顯著性差異（P＞0．05），而在驗孕日顯著上升（P＜0．001）（圖1）。

圖1 不同時間點D－二聚體濃度變化情況

三、血清E2與D－二聚體濃度之間的相關(guān)性

使用Gn促排卵后血清E2水平隨著卵泡的發(fā)育，逐漸升高。扳機(jī)日E2水平［（9 530±4 484）pmol／L］與D－二聚體濃度［（240±190）ng／ml］之間呈負(fù)相關(guān)（r＝－0．1），但無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05），即E2處于高水平時，血漿中D－二聚體并沒有隨之升高（圖2）。

圖2 扳機(jī)日血清E2水平與D－二聚體水平的相關(guān)性

四、扳機(jī)日D－二聚體濃度與OHSS發(fā)生的相關(guān)性

取卵個數(shù)≥20個疑似OHSS或已確診OHSS的患者與接受新鮮胚胎移植患者（取卵＜20個）在扳機(jī)日的 D－二聚體濃度［（250±220）ng／ml vs．（240±190）ng／ml］無顯著 性 差 異 （P＞0．05）（圖3）。

圖3 扳機(jī)日D－二聚體濃度與OHSS發(fā)生的相關(guān)性

五、驗孕日D－二聚體濃度與妊娠結(jié)局的相關(guān)性

驗孕日正常妊娠組D－二聚體濃度［（1 200±580）ng／ml］高于妊娠失敗組［（900±420）ng／ml］，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）（圖4）。

圖4 驗孕日D－二聚體水平與妊娠結(jié)局相關(guān)性

討 論

COH過程中大劑量性激素類藥物的運(yùn)用使機(jī)體受高水平雌激素刺激，血液處于高凝狀態(tài)，是導(dǎo)致OHSS發(fā)生的重要原因。合并有肥胖、高血壓、抗磷脂綜合征等與血栓形成相關(guān)的高危因素的患者，在COH治療過程中更容易形成血栓，因此，在IVF／ICSI治療前需對高危人群進(jìn)行系統(tǒng)評估及診療，促排前后給予阿司匹林、低分子肝素等抗凝治療，甚至直至分娩后6周，或根據(jù)病情繼續(xù)抗凝治療，可有效預(yù)防血栓栓塞性疾病發(fā)生及改善其妊娠結(jié)局［6］。目前已有學(xué)者開始重視IVF過程中的高凝狀態(tài)，提出促排卵過程預(yù)防性使用抗凝藥物可有效降低OHSS發(fā)生率，降低妊娠后流產(chǎn)率，提高胚胎種植率［7－8］。孫雯等［9］提出OHSS的主要危險因素是血栓，對于血栓形成高?；颊撸杞o予預(yù)防性抗凝治療，一旦早期發(fā)現(xiàn)血栓栓塞，立即給予低分子肝素進(jìn)行抗凝治療，提高血栓栓塞患者的預(yù)后。

那么，如何在COH治療過程中盡早發(fā)現(xiàn)血栓形成風(fēng)險？D－二聚體是纖溶酶水解交聯(lián)蛋白所形成的降解產(chǎn)物之一，作為高凝狀態(tài)和內(nèi)源性纖溶系統(tǒng)的標(biāo)志物，其升高主要反應(yīng)體內(nèi)凝血活性增強(qiáng)，因此D－二聚體對高凝狀態(tài)的診斷、療效觀察和預(yù)后判斷具有重要的應(yīng)用價值。但目前對于無血栓形成的高?；颊邅碚f，D－二聚體濃度對OHSS的發(fā)生以及不良妊娠結(jié)局的預(yù)測作用尚不明確，也鮮有報道。因此，本研究擬分析降調(diào)日、扳機(jī)日及驗孕日這3個時間點D－二聚體的變化，以了解促排卵前后、移植胚胎后血漿D－二聚體水平的變化，以及促排卵前后D－二聚體濃度的變化對發(fā)生OHSS和不良妊娠結(jié)局的影響，以評估D－二聚體濃度對于IVF－ET治療中患者妊娠結(jié)局的預(yù)測價值。

OHSS是COH常見的并發(fā)癥之一，由于COH過程中雙側(cè)卵巢多個卵泡發(fā)育、黃體囊腫形成和急性血管通透性增加導(dǎo)致不同程度胸腹水、電解質(zhì)紊亂、肝腎功能損壞、血栓形成等。OHSS在輔助生殖技術(shù)治療中發(fā)生率為20%～33%。其中重度OHSS發(fā)生率為3%～8%［10］。OHSS患者機(jī)體發(fā)生凝血時，凝血酶作用于血漿纖維蛋白原（FIB），使其轉(zhuǎn)變?yōu)榻宦?lián)纖維蛋白，同時纖溶系統(tǒng)被激活，降解交聯(lián)纖維蛋白，便產(chǎn)生了包含γ鏈相連的2個D片段，即D－二聚體，且可持續(xù)4周以上［11］。多數(shù)研究認(rèn)為OHSS的發(fā)生與雌激素水平相關(guān)，但近年來，有學(xué)者提出取卵數(shù)對OHSS發(fā)生的預(yù)測價值更大。Magnusson等［12］研究指出取卵個數(shù)20個以上時OHSS及血栓事件發(fā)生率顯著升高，但是否需要使用抗凝藥物進(jìn)行治療，尚不明確。本研究結(jié)果顯示，取卵≥20個的患者與取卵＜20個的患者比較，取卵≥20個組扳機(jī)日血漿D－二聚體濃度略高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示促排后D－二聚體濃度可能不是預(yù)測OHSS發(fā)生的指標(biāo)。

國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，COH過程中超生理劑量的性激素類藥物的運(yùn)用以及多個卵泡發(fā)育引起體內(nèi)雌激素水平的升高，可能是影響胚胎種植和進(jìn)一步發(fā)育的因素［7］。其作用機(jī)理，有學(xué)者認(rèn)為高凝傾向可促使胚胎種植部位微血栓形成，影響合體滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲而 影 響 胚 胎 種 植［7，13－14］。另 外，過 高 雌 激 素 也可影響母體的凝血功能，母體血管血栓形成致絨毛間隙血流減少而導(dǎo)致反復(fù)流產(chǎn)的發(fā)生［15］。近年來大量數(shù)據(jù)顯示妊娠期高凝狀態(tài)引起的微循環(huán)障礙與反復(fù)流產(chǎn)、胎兒宮內(nèi)生長受限密切相關(guān)。Giardina等［16］研究發(fā)現(xiàn)，正常月經(jīng)周期增生期階段D－二聚體隨著雌激素升高而升高；Rogolino等［17］研究指出COH過程中D－二聚體隨著雌激素水平升高而升高，結(jié)果顯示D－二聚體可提示COH處于高凝狀態(tài)，對血栓形成、胚胎種植有著重要的預(yù)測作用。張莉莉等［18］檢測IVF－ET后7d血漿 D－二聚體水平，指出鮮胚移植周期由于超促排卵導(dǎo)致血清雌激素升高，血液高凝狀態(tài)，纖溶亢進(jìn)，血漿D－二聚體升高，胚胎發(fā)育可能受負(fù)面影響導(dǎo)致流產(chǎn)率升高。治療方面，有學(xué)者提出肝素可降低COH血栓形成風(fēng)險，還可促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞侵入內(nèi)膜，提高妊娠率［19－20］。然而，莫美蘭等［4］研究發(fā)現(xiàn)反復(fù)種植失敗患者妊娠后至12周內(nèi)D－二聚體水平在自然流產(chǎn)組與成功分娩組中無顯著性差異。本研究中發(fā)現(xiàn)，COH過程中隨著雌激素水平的升高，D－二聚體濃度并沒有顯著升高，說明促排卵后雌二醇的升高，并不是導(dǎo)致D－二聚體升高的主要原因，本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果不一致。而驗孕日D－二聚體濃度較降調(diào)日、扳機(jī)日顯著升高，即取卵術(shù)后2周，D－二聚體顯著升高，未排除穿刺卵泡后傷口修復(fù)激活凝血系統(tǒng)，同時纖溶系統(tǒng)亦被激活而代謝出D－二聚體。另外，正常妊娠與妊娠失敗患者驗孕日D－二聚體濃度無顯著性差異，表明驗孕日D－二聚體濃度未能預(yù)測IVF－ET患者妊娠結(jié)局。本研究未針對不孕癥患者妊娠后至12周之內(nèi)的D－二聚體水平進(jìn)行監(jiān)測，故未能進(jìn)一步分析早期流產(chǎn)與繼續(xù)妊娠患者之間D－二聚體水平的情況，此為本文不足之處。

綜上所述，血漿中D－二聚體濃度并不足以評估COH過程中高凝狀態(tài)，本研究中發(fā)現(xiàn)扳機(jī)日或驗孕日D－二聚體水平對無血栓形成高危因素的不孕癥患者發(fā)生OHSS及不良妊娠結(jié)局無預(yù)測作用。因此，對于COH過程中高凝狀態(tài)的準(zhǔn)確評估，可能需要同時監(jiān)測多個凝血或纖溶指標(biāo)，臨床醫(yī)生更要結(jié)合臨床，不能僅憑D－二聚體水平判斷患者的預(yù)后轉(zhuǎn)歸。