周向平 舒翠華 滕凱 甘在德 肖啟明 陳武 李小慧 劉天波

摘要：為獲得對(duì)煙草青枯病菌具有拮抗作用的生防菌，從湖南永州青枯病發(fā)病較重?zé)熖锏慕】禑熤旮抵蟹蛛x獲得1株對(duì)煙草青枯病菌具有較強(qiáng)抑菌活性的菌株，對(duì)峙培養(yǎng)其抑菌圈直徑達(dá)到30.5mm，將其命名為Xe01。利用形態(tài)觀察、生理生化特征及16STRNA基因序列分析鑒定其為解淀粉芽孢（Bacillus amyloliquefaciens），溫室盆栽和小區(qū)試驗(yàn)中Xe對(duì)煙草青枯病的防治效果分別達(dá)到56.32%和61.46%。對(duì)其發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進(jìn)行單因素試驗(yàn)及正交設(shè)計(jì)優(yōu)化，最適培養(yǎng)基碳源、氮源和無機(jī)鹽種類及濃度為葡萄糖90gL、牛肉膏3.0gL、氯化鈣4.0gL最佳發(fā)酵條件為pH7.0，30℃，180rmin培養(yǎng)52h，使用優(yōu)化后的發(fā)酵條件培養(yǎng)，抑菌圈直徑由優(yōu)化前的30.5mm提高至42.5mm，提高了39.34%。研究結(jié)果為解淀粉芽孢桿菌Xe01生防菌劑的開發(fā)及應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：煙草青枯病菌;解淀粉芽孢杄菌;鑒定;發(fā)酵條件優(yōu)化

由茄科雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的青枯病是煙草主要病害之一，給煙草造成嚴(yán)重?fù)p失。目前煙草青枯病防治主要依賴化學(xué)農(nóng)藥，但生產(chǎn)上尚無有效的化學(xué)藥劑，且隨著人們的生態(tài)意識(shí)和環(huán)保理念的加強(qiáng)，過量施用化學(xué)農(nóng)藥帶來的3R（殘留、抗性和再增猖獗）問題日益受到人們重視。生物防治是一種環(huán)境友好和具有良好發(fā)展?jié)摿Φ姆乐问侄?，有益微生物利用已成為防控?zé)煵萸嗫莶〉难芯繜狳c(diǎn)。植物內(nèi)生細(xì)菌與植物高度親和，內(nèi)生菌作為生物防治菌株不僅能避免因使用化學(xué)農(nóng)藥給人類健康和環(huán)境帶來的風(fēng)險(xiǎn)，還可減少對(duì)植物根際土壤微生態(tài)平衡的破壞，在防治植物病害上具有很大應(yīng)用前景。目前，已從水稻、番茄等植株內(nèi)分離篩選到具有良好拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌。國內(nèi)外針對(duì)煙草青枯病也篩選了一些內(nèi)生細(xì)菌，如舒翠華等、易有金等從煙草根內(nèi)篩選到對(duì)煙草青枯菌有較好抑制效果的內(nèi)生拮抗細(xì)菌假單胞杄菌、短短芽胞杄菌和枯草芽孢桿菌。此外，為更好地將生防菌應(yīng)用到生產(chǎn)，發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的篩選和優(yōu)化必不可少。梁艷瓊、劉京蘭等1叫通過單因素和正交試驗(yàn)方法分別對(duì)解淀粉芽孢杄菌JNC2和CC09液體發(fā)酵的最適發(fā)酵培養(yǎng)基成分

及發(fā)酵條件進(jìn)行篩選優(yōu)化，優(yōu)化后發(fā)酵濾液中抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)量顯著提高。由于煙葉種植制度和土壤生態(tài)環(huán)境的差異，生防菌在大田應(yīng)用效果不夠穩(wěn)定，菌種本身所具有的優(yōu)良遺傳性狀也可能發(fā)生變異退化，因此，有必要不斷挖掘和發(fā)現(xiàn)新的生防菌，并優(yōu)化其發(fā)酵條件，為生防菌應(yīng)用提供基礎(chǔ)。本研究從煙草根內(nèi)篩選分離得到一株對(duì)煙草青枯菌有顯著抑制作用的拮抗菌株，通過形態(tài)觀察、生理生化檢測(cè)及16STRNA基因序列分析初步鑒定其種屬，盆栽和小區(qū)試驗(yàn)考察防治效果。采用單因素試驗(yàn)及正交設(shè)計(jì)優(yōu)化菌株發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件，以期為后續(xù)生產(chǎn)應(yīng)用提供理論支撐。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

內(nèi)生拮抗菌寄生植物樣品于2014年取自湖南省永州市江永縣和江華縣青枯病發(fā)病較重?zé)熖锏慕】禑熤?，煙草品種為云煙87。

供試病原菌煙草青枯病菌（Ralstonia solanacearum）、煙草黑脛病菌（Phytophthora para.silica）、煙草赤星病菌（Alternaria alternata）、辣椒炭疽病菌（Colletotrichum capsici）、辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici）、柑橘炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）和西瓜灰霉病菌（Cladosporium cucumerinum）均由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病蟲害生物學(xué)與防控實(shí)驗(yàn)室提供。

拮抗細(xì)菌的分離、培養(yǎng)用NA培養(yǎng)基，煙草青枯菌培養(yǎng)用LB培養(yǎng)基，煙草黑脛病菌的培養(yǎng)用燕麥培養(yǎng)基，其他病原真菌的培養(yǎng)用PDA培養(yǎng)基。拮抗細(xì)菌總DNA提取、16SIRNA片段擴(kuò)增所用試劑均購自天根生化科技有限公司。

1.2根內(nèi)細(xì)菌的分離

剪取1g清洗干凈的煙草根系樣品，依次用75%乙醇浸泡1min，無菌水沖洗3次，5%NaCIO泡6min，無菌水沖洗5次后，在無菌研缽中加入10mI無菌水研磨，取1mL研磨液渦旋振蕩10min。采用稀釋平板涂布法，制備102、103、10-4、10-5、10CFU/ML梯度稀釋液，各取0.1mL涂布在固體NA平板上，28℃培養(yǎng)48h。挑取培養(yǎng)特征明顯不同的單菌落，于NA平板進(jìn)行劃線純化，將純化好的菌株4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3拮抗菌株的篩選

1.3.1拮抗菌株的初篩參照夏艷等方法，制備煙草青枯病菌濃度為1×10°CFU/ml的菌懸液，取1mL加入45℃左右的IB培養(yǎng)基，搖勻，待培養(yǎng)基凝固后，用滅菌牙簽挑取1.2中備用菌株單菌落點(diǎn)接于培養(yǎng)基上，每板測(cè)試4個(gè)菌株，每菌株重復(fù)3次，30℃條件下培養(yǎng)48h，十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑，求平均值。

1.3.2拮抗菌株的復(fù)測(cè)選取有拮抗活性的菌株接種于NA培養(yǎng)基中，28℃、180r/min培養(yǎng)48h。取發(fā)酵液10mL，10000rmin離心10min，用0.22m的微孔濾膜過濾其上清液，得無菌發(fā)酵濾液。按1.3.1的方法制備青枯菌平板，在平板四周用直徑8mm的打孔器打孔，孔內(nèi)注入0.1mL無菌發(fā)酵液，30℃條件下培養(yǎng)48h，十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑，求平均值。

1.4拮抗菌株的鑒定

1.4.1形態(tài)觀察將篩選到有明顯拮抗作用的菌株從冰箱取出，NA平板劃線，28℃培養(yǎng)48h后挑取單菌落，在新的NA平板上劃線28℃培養(yǎng)60h，觀察并記錄菌落的顏色、形態(tài)等特征，并通過光學(xué)顯微鏡和革蘭氏染色觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.4.2生理生化特征鑒定參照文獻(xiàn)[17]進(jìn)行生理生化試驗(yàn)，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.4.316S TRNA鑒定拮抗細(xì)菌16SIRNAPCR擴(kuò)參考周鑫鈺等的方法。將16S TRNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后送上海生物工程有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，并選擇同源性比較高的序列用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹材。

1.5拮抗菌株的抑菌譜測(cè)定

以7種病原菌為靶標(biāo)，于9CmPDA或燕麥培養(yǎng)基平板中心接種直徑5mm的靶標(biāo)菌菌餅，用接種環(huán)挑取拮抗菌株劃線接種在距平板中央3cm處，同時(shí)以單獨(dú)接種病原菌作為對(duì)照，每個(gè)處理3次重復(fù)。28℃恒溫培養(yǎng)4d，測(cè)量對(duì)照和處理的靶標(biāo)菌菌落直徑，計(jì)算抑菌帶寬度，計(jì)算公式為：抑菌帶寬度=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）2。

1.6拮抗菌株對(duì)煙草青病的防治效果

通過溫室盆栽和田間試驗(yàn)考察拮抗菌株對(duì)煙草青病的防治效果。設(shè)3個(gè)處理，處理1：拮抗菌株Xe01;處理2：3%中生菌素WP（福建凱立生物制品有限公司生產(chǎn)）：處理3：清水（對(duì)照）。每處理重復(fù)3次。盆栽試驗(yàn)每重復(fù)20盆，每盆栽煙1株，田間試驗(yàn)每小區(qū)面積67m2（植煙100株），隨機(jī)排列。

盆栽試驗(yàn)在湖南省永州市煙葉生產(chǎn)技術(shù)中心試驗(yàn)基地溫室進(jìn)行。取5～6片真葉煙苗移栽于裝有滅菌土的花盆，移栽后按處理分別灌根拮抗Xe發(fā)酵液（菌量為1×108CFU/mL）、3%中生菌素WP（500倍液）和清水各20mL/株，24h后灌根接種煙草青枯菌菌懸液（1×10CFU/mL）10mL/株。置于溫室28～32℃條件下，常規(guī)管理。觀察煙株發(fā)病情況，始見病株后，每7d調(diào)查一次病害發(fā)生情況，共調(diào)查3次。病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)按國家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)GB/T23222-2008，統(tǒng)計(jì)發(fā)病率、病情指數(shù)和防治效果。

田間小區(qū)試驗(yàn)在湖南省永州市江永縣夏層鋪鎮(zhèn)東鋪村旱土煙田進(jìn)行。選擇煙草青枯病發(fā)生較重且連作3年以上的田塊，移栽時(shí)和移栽后30d分別用拮抗菌Xel發(fā)酵液（×105CFUm）3%中生菌素WP（500倍液）和清水灌根，每株200mL。在田間煙草青枯病始發(fā)期開始調(diào)查，調(diào)查統(tǒng)計(jì)方法同盆栽試驗(yàn)。

1.7發(fā)酵培養(yǎng)基成分優(yōu)化

1.7.1單因素篩選優(yōu)化最佳碳源、氮源、無機(jī)鹽種類篩選：分別以玉米粉、乳糖、蔗糖、麥芽糖、甘油、可溶性淀粉替換NA培養(yǎng)基中的葡萄糖;分別以蛋白胨、酵母粉、大豆蛋白胨、尿素、硝酸銨、硫酸銨替換NA培養(yǎng)基中的牛肉膏汾別以氯化鈣、磷酸氫二鉀、氯化錳替NA培養(yǎng)基中的氯化鈉。

最佳碳源、氮源、無機(jī)鹽濃度篩選：分別設(shè)定葡萄糖60、7.0、80、9.0、10.0、1.0、和12.0g/L，牛肉膏1.0、2.0、3.0、4.0和5.0gL，氯化鈣1.02.0、3.0、4.0和5.0gL。

以上試驗(yàn)每組處理設(shè)3組重復(fù)，在溫度28℃、150r/min培養(yǎng)24h，測(cè)定菌體量（DD600），按1.3.2測(cè)抑菌圈直徑，確定最佳碳源、氮源和無機(jī)鹽種類和濃度。

1.7.2正交優(yōu)化根據(jù)以上單因子篩選的基礎(chǔ)上，選擇葡萄糖、牛肉膏、氯化鈣為考察因素，按照正交設(shè)計(jì)表（3）設(shè)計(jì)3個(gè)因素、3個(gè)水平的正交試驗(yàn)，確定最適配比。

1.8培養(yǎng)條件的優(yōu)化

1.8.1培養(yǎng)條件單因素優(yōu)化采用最適培養(yǎng)基配方，依次進(jìn)行以下條件的優(yōu)化，每次都將上一優(yōu)化結(jié)果應(yīng)用于下一因素的優(yōu)化の。初始pH：41050、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0;溫度：26、28、30、32、34、36、和38℃轉(zhuǎn)速：140、160、180、200、220和240r/min;發(fā)酵時(shí)間：36、40、4448、52、56和60h。每個(gè)處理3次重復(fù)，測(cè)定菌體量（DD6OO）按1.3.2測(cè)抑菌圈直徑。

1.8.2正交優(yōu)化根據(jù)單因素的優(yōu)化結(jié)果，選擇發(fā)酵培養(yǎng)初始pH、溫度、轉(zhuǎn)速和發(fā)酵時(shí)間為考察因素，按照正交設(shè)計(jì)表（3）設(shè)計(jì)4個(gè)因素、3個(gè)水平的正交試驗(yàn)，確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件組合。

2結(jié)果

2.拮抗菌株的分離和篩選

采用平板梯度稀釋法共分離出96株形態(tài)不同的菌株，經(jīng)平板對(duì)峙法初篩和復(fù)篩，得到15株對(duì)煙草青枯病菌具有拮抗效果的菌株，其中JH24、JY46、JY38、JYO5、JY22、JH23、JY37、JH35等菌株的抑菌效果較好，拮抗菌株發(fā)酵濾液抑菌圈直徑在20mm以上，菌株JY16的拮抗效果最好，抑菌圈直徑達(dá)到30.5mm（表1和圖1）。在轉(zhuǎn)移5代后，菌株JY16菌效果表現(xiàn)穩(wěn)定，將其命名為Xeol，并進(jìn)行深入研究。

2.2拮抗菌株的形態(tài)特征

對(duì)劃線后長出的單菌落進(jìn)行觀察，菌株Xe1在NA培養(yǎng)基上呈灰白色，不透明，表面干燥皺縮，邊緣不規(guī)則，具有較強(qiáng)的黏附性（圖2a）：革蘭氏染色呈陽性，周生鞭毛，有芽孢，呈桿狀（圖2b）。

2.3生理生化特征

生理生化試驗(yàn)測(cè)定表明（表2），菌株Xe01好氧，明膠液化試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、酪朊水解試驗(yàn)、接觸酶反應(yīng)硝酸鹽還原反應(yīng)、V-P反應(yīng)結(jié)果為陽性硫化試驗(yàn)結(jié)果為陰性。根據(jù)形態(tài)觀察并結(jié)合生理生化結(jié)果，初步確定菌株Xe01為芽孢杄菌屬（Bacillus）

2.416S IRNA鑒定

測(cè)序結(jié)果與Genbank中已知序列比對(duì)，菌株Xe1的16S TRNA序列（Genbank登錄號(hào)為JX477175）與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）的16STRNA序列同源性高達(dá)100%。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明（圖3），菌株Xe0與解淀粉芽胞菌（JQ916086）處于同一個(gè)分支，因此將該菌鑒定為解淀粉芽孢杄菌。

2.5拮抗菌株的抑菌譜

抑菌譜測(cè)定結(jié)果表明（表3），拮抗菌株Xe1對(duì)煙草黑脛病菌、煙草赤星病菌、辣椒炭疽病菌、辣椒疫霉病菌、柑橘炭疽病菌、稻瘟病菌和西瓜灰霉病菌均具有抑制作用，其中對(duì)煙草黑脛病菌的抑制作用最強(qiáng)，抑菌帶寬度達(dá)15.1mm。由此說明，Xe1的抑菌譜廣，具有較好的應(yīng)用前景。

2.6拮抗菌對(duì)煙草青枯病的防治效果

溫室盆栽和小區(qū)試驗(yàn)結(jié)果表明（表4），拮抗菌對(duì)煙草青枯病有明顯防治效果，施用拮抗菌株Xe01顯著降低了煙草青枯病的發(fā)病率和病情指數(shù)，溫室盆栽試驗(yàn)拮抗菌Xe對(duì)煙草青枯病的防效為56.32%，小區(qū)試驗(yàn)防效為61.46%，防效均好于藥劑防治。

2.7發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.7.1單因素篩選碳源、氮源、無機(jī)鹽種類篩選不同碳源、氮源和無機(jī)鹽對(duì)Xe1的菌體量和抑菌活性影響較大，以葡糖為碳源時(shí)菌體量達(dá)到最大（OD=1.29），抑菌圈也最大（31.5mm）（圖4a）以牛肉膏為氮源時(shí)菌體量達(dá)到最大（ODoo=1.3），抑菌活性也最大（抑菌圈直徑31.6mm）（圖4b）;以氯化鈣為無機(jī)鹽時(shí)菌體量達(dá)到最大（OD0=1.43）抑菌圈也最大（3.7mm）（圖4c）。因此，葡萄糖、牛肉膏和氯化鈣為最適碳源、氮源和無機(jī)鹽組分。

葡萄糖、牛肉膏和無機(jī)鹽濃度篩選：不同濃度葡萄糖、牛肉膏和氯化鈣對(duì)Xel菌體量和抑菌活性有顯著影響。隨著濃度的增加，Xel菌體量和菌活性先隨之増加，達(dá)到高峰后，隨著濃度加Xe1菌體量和抑菌活性反而下降。在葡萄糖10gL時(shí)菌體量（OD600=153）和抑菌活性（抑菌圈直徑337mm）最大（圖5a），牛肉膏3gL時(shí)菌體量（ODo=1.54）和抑菌活性（抑菌圈直徑33.8mm）最大（圖5b），氯化鈣2gL時(shí)菌體量（ODo=1.56）和抑菌活性（抑菌圏直徑33.9mm）最大（圖5c）。因此，葡萄糖10gL、牛肉膏3gL、氯化鈣2gL為Xe01菌株發(fā)酵最佳濃度。

2.7.2正交優(yōu)化根據(jù)上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用

（3）正交表，設(shè)計(jì)了3因素3水平的正交試驗(yàn)，進(jìn)一步確定影響XeOl菌株抑菌活性的最佳組合，結(jié)果見表5。由極差R值的大?。≧c》R》R2）可以看出，影響XeO菌株抑菌活性的因子強(qiáng)度由強(qiáng)到弱依次為C（氯化鈣）》A（葡萄糖）》B（牛肉膏），氯化鈣濃度是影響XeO菌株抑菌活性的最重要因子。結(jié)合K值，適合Xe菌株發(fā)酵的最優(yōu)組合為A1BC3，即葡萄糖9.0g兀L、牛肉膏3.0gL，氯化鈣4.0gL。在此培養(yǎng)基條件下，菌株Xe發(fā)酵濾液對(duì)煙草青枯病菌的抑菌直徑達(dá)到36.1mm，比基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)的抑菌圈直徑（30.5mm）増加了18.4%。

2.8發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.8.1單因素篩選初始pH（圖6）：在pH7時(shí)菌體量達(dá)到最高（ODo01.61），抑菌活性最高在pH6和pH7，抑菌圈直徑分別為37.0和37.6mm，低于或高于該pH值，抑菌活性則顯著降低。可見，pH67為Xc菌株發(fā)酵最佳pH。

培養(yǎng)溫度（圖7）：在32℃發(fā)酵條件下，Xe1菌體量最高（ODoo=1.60），低于或高于此溫度，均不利于Xe菌株的生長，而在32～34℃時(shí)抑制活性最高。可見，Xe01菌株發(fā)酵最佳溫度為32～34℃。轉(zhuǎn)速（圖8）：搖床轉(zhuǎn)速在180r/min時(shí)Xel菌體量和抑制活性均達(dá)到最大（ODo1.66，扣菌直徑37.5mm），轉(zhuǎn)速高于或低于180r/min，Xeol菌株的菌體和抑制活性均顯著下降。因此，Xe0菌株發(fā)酵最佳轉(zhuǎn)速為180rmin。

發(fā)酵時(shí)間（圖9）：在發(fā)酵時(shí)間48h和56h時(shí)菌體量達(dá)到最高，在52h和56h時(shí)抑菌圈直徑達(dá)最大，然后逐漸少。因此，XeOl菌株發(fā)酵最佳發(fā)酵時(shí)間為48～56h。

2.8.2正交優(yōu)化根據(jù)上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用o（3）正交表，設(shè)計(jì)4因素3水平的正交試驗(yàn)，進(jìn)步確定影響XeO菌株抑菌活性的最佳發(fā)酵條件組合，結(jié)果見表6。由極差R值可見，4種因素對(duì)Xe1菌株抑菌活性影響力的強(qiáng)弱順序?yàn)锳（pH）》B（溫度）》C（轉(zhuǎn)速）》D（培養(yǎng)時(shí)間）。結(jié)合K值，最優(yōu)發(fā)酵條件組合為A3B1C2D2，即pH7.0，30℃，180r/min，培養(yǎng)52h。在此培養(yǎng)條件下，驗(yàn)證對(duì)煙草青枯病菌的抑制活性，抑菌圈直徑達(dá)到42.5mm比初始培養(yǎng)條件抑菌圈直徑（30.5mm）増加了39.34%。3討論

傳統(tǒng)的生防菌種大多來自土壤，從土壤中篩選出的拮抗細(xì)菌通過抑制土傳病原菌的繁殖達(dá)到防病的效果2-2內(nèi)生拮抗細(xì)菌能進(jìn)入植物組織，與病原菌竟?fàn)幙臻g與營養(yǎng)，可在植物內(nèi)部抑制病原菌的繁殖，能更好地防治病原菌，較傳統(tǒng)的土壤細(xì)菌更有優(yōu)勢(shì)，已成為防治植物病害的一個(gè)重要菌種資源來源2。本研究通過稀釋涂布平板對(duì)峙法從煙草根內(nèi)篩選獲得一株具有較強(qiáng)抑菌活性的拮抗細(xì)菌（Xe01），通過形態(tài)觀察、生理生化檢測(cè)及16SrRNA基因序列分析初步鑒定其種屬，初步鑒定為解淀粉芽孢菌（Bacillus amyloliquefaciens）。拮抗菌株對(duì)煙草青枯病菌具有較好的抗菌活性，還可以制煙草黑脛病菌、煙草赤星病菌和辣椒炭疽病菌等常見病原菌，抑菌范圍比較廣泛，應(yīng)用前景良好。優(yōu)化生防菌培養(yǎng)液組分可以提高菌體的菌體量和抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)量，進(jìn)而提高生防效果242本研究將Xel的菌體量及抑菌活性作為主要考量指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基碳源、氮源和無機(jī)鹽種類及濃度為葡萄糖9.0gL、牛肉膏3.0gL、氯化鈣4.0gL時(shí)，菌體量最大，抑菌活性最佳，但抑菌活性物質(zhì)含量的變化暫未分析。初始pH、培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速和發(fā)酵時(shí)間影響其活菌數(shù)量以及對(duì)病原菌的抑制效果，它們之間互相作用、互相影響，高產(chǎn)發(fā)酵需要各因素之間的最佳組合。因此，解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵條件的優(yōu)化除采用單因素外，同時(shí)還需考慮多因素及其交互作用。本研究通過單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化了培養(yǎng)條件，發(fā)現(xiàn)pH70，30℃，180rmin，培養(yǎng)52h時(shí)抑菌圈直徑達(dá)42.5mm，比優(yōu)化前增加了39.34%。本研究只是在搖床條件下對(duì)菌株Xe01培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，今后還需進(jìn)行小試、中試，以驗(yàn)證和完善發(fā)酵工藝，獲得適合發(fā)酵罐的發(fā)酵工藝，在實(shí)際工業(yè)化生產(chǎn)中對(duì)發(fā)酵條件的控制方法也有待于進(jìn)一步研究，為下一步抑菌活性物質(zhì)的分離鑒定以及田間實(shí)際應(yīng)用提供理論參考。

解淀粉芽孢杄菌不僅能夠產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，抑制植物病原菌生長，而且能促進(jìn)植物生長和誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性。權(quán)春善等2、林巧玲等分離篩選的解淀粉芽孢杄菌Q-12對(duì)植尖孢鐮刀菌具有較好抑制作用，解淀粉芽孢桿菌SH-27能顯著降低大豆疫病的病情指數(shù)，促進(jìn)根系生長。本研究篩選的拮抗菌株解淀粉芽孢桿菌Xe1對(duì)煙草青枯病菌具有較好的抑菌活性，溫室盆栽和小區(qū)試驗(yàn)對(duì)煙草青枯病的防治效果達(dá)到50%以上，防治效果與姜乾坤等、易有金等篩選的生防菌相當(dāng)。但拮抗菌株XeO如何發(fā)揮作用，是否還具有促進(jìn)植物生長和誘導(dǎo)植物抗性等作用暫不明確，后續(xù)將對(duì)XeO1的生防機(jī)制及其抑菌物質(zhì)的分離純化等方面進(jìn)行更深入的研究。

4結(jié)論

本研究篩選獲得一株對(duì)煙草青枯菌具有較好抑制作用的解淀粉芽孢杄菌Xe0，盆栽和小區(qū)試驗(yàn)表明其對(duì)煙草青枯病的防治效果良好。優(yōu)化了發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件，優(yōu)化培養(yǎng)后抑菌活性提高了39.34%，為解淀粉芽孢杄菌XeO防治煙草青枯病及生防菌劑的開發(fā)應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1]WICKER E， GRASSART L， CORANSON-BEAUDU R， et al Ralstonia solanacearum strains from martinique（french west indies） exhibiting a new pathogenic potential [J]. Applied and Environmental

Microbiology，2007，73（21）：6790-6801

[2]劉偉，沈小英，段軍娜，等抗煙草青枯病的芽胞桿菌篩選和鑒定[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2013（1）：97-98

[3] STUMBRIENE K， GUDIUKAITE R， SEMASKIENE R， et al Screening of new bacterial isolates with antifungal activity and application of selected Bacillus sp. cultures for biocontrol of Fusarium graminearum under field conditions]. Crop Protection2018，113：22-28

[4]李威，肖煕雞，李可，等.茄子青枯病拮抗放線菌L-6的篩選鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化微生物學(xué)通報(bào)，2018，45（2）：357-367

[5] XUE YR， GUO C， FANG Y B， et al. Application of an endophytic Bacillus amyloliquefaciens CC09 in field control of Rehmannia glatinosa root rots disease [J]. Annual Research &Review in Biology2014，4（14）：2327-236

[6]張麗，紀(jì)明山，谷祖敏，等.印內(nèi)生放線菌鑒定及對(duì)稻瘟病拮抗作用研究.中國生物防治學(xué)報(bào)，2014，30（4）：534-539

[7]姜乾坤，彭閣，王瑞，等抗青枯內(nèi)生細(xì)菌的篩選及其對(duì)煙草青枯病的防治效果中國煙草科學(xué)，2017（5）：18-22，36

[8]沙月霞，隋書婷，曾慶超，等.貝萊斯芽孢桿菌E69對(duì)稻瘟病和其他真菌病害的生防潛力中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，52（1）：1908-1917

[9]梁新冉，李乃薈，周新剛，等.譖茄根內(nèi)促生放線的分離鑒定及其促生效果[J].微生物學(xué)通報(bào)，2018，45（6）：1314-132

[10]舒翠華，彭可為，戴林建，等.煙草青病菌內(nèi)生拮抗菌株HN3的鑒定與高產(chǎn)抗菌物質(zhì)的培養(yǎng)基優(yōu)化.中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2013，29（10）：108-113

[11]易有金，尹華群，羅寬，等.煙草內(nèi)生短短芽孢桿菌的分離鑒定及對(duì)煙草青枯病的防效卩植物病理學(xué)報(bào)，200737（3）：301-306

[12]易有金，肖浪濤，王若仲，等內(nèi)生枯草芽孢桿菌B-001對(duì)煙草幼苗的促生作用及其生長動(dòng)態(tài)植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2007，34（6）：619-623

[13]梁艷瓊，吳偉懷，習(xí)金根，等解淀粉芽胞桿菌JNC2搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化.草業(yè)科學(xué)，2019（8）：2159-2167

[14]劉京蘭，薛雅蓉，劉常宏，等.內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌CC9產(chǎn)turinA搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化微生物學(xué)通報(bào)，201441（1）：75-82.

[15]李小杰，李成軍，胡亞靜，等豫南煙區(qū)煙草青枯病菌拮抗內(nèi)生細(xì)菌的篩選及其防病效果初探卩河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，47（5）

[16]夏艷，徐茜等.煙草青枯病菌拮抗菌的篩選、鑒定及生防特性研究卩中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2014，22（2）：201-20

[17]東秀珠，蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M]北京：科學(xué)出版社，2001：166-171

[18]周鑫鈺，朱宏建，周倩，等.1株煙草青枯病拮抗內(nèi)生細(xì)菌的分離及鑒定[J]湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），201137（6）：637-640.664

[19]章四平，劉圣明，王建新，等.枯草芽孢桿菌生防菌株NJ-18的發(fā)酵條件優(yōu)化.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，33（2）：58-62

[20]方傳紀(jì)，陸兆新，孫力軍，等淀粉液化芽孢桿菌抗菌脂肽發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件的優(yōu)化.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，41（2）：533-539.

[21]吳翔，甘炳成，謝麗源，等一株煙草青桔拮抗細(xì)菌的篩選、鑒定和培養(yǎng)特性研究.中國土壤與肥料，2019（2）：208-215

[22]陳奇園，丁鑰琪，趙世民，等.洛陽地區(qū)煙株根圍抗煙草疫霉放線菌的篩選與鑒定煙草科技，2019，52（1）：22-28.

[23]胡桂萍，鄭雪芳，尤民生，等.植物內(nèi)生菌的研究進(jìn)展福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2010（2）：226-234.

[24]李麗，嚴(yán)月根，吳華明，等.解淀粉芽孢桿菌M搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化及脫氮性能評(píng)價(jià).生物技術(shù)通報(bào)，2019，35（5）：102-108

[25]洪鵬，安國棟，胡美英，等.解淀粉芽孢桿菌-01發(fā)酵條件優(yōu)化中國生物防治學(xué)報(bào)，2013，29（4）：569-578

[26]孫力軍，陸兆新，別小妹，等培養(yǎng)基對(duì)解淀粉芽孢桿菌ES-2菌株產(chǎn)抗菌脂肽的影響中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，41（10）3389-33

[27]韓玉竹，鄧釗，張寶，等.解淀粉芽孢桿菌H15產(chǎn)抗菌肽的發(fā)酵條件優(yōu)化和提取方法比較研究食品科學(xué)，2015，36（15）135-141

[28]陳楠楠，秦平偉，尹瑞伊，等.解淀粉芽孢杄菌抗菌機(jī)制研究進(jìn)展中國微生態(tài)學(xué)雜志，2018，30（12）：1464-1469

[29]權(quán)春善，王軍華，徐洪濤，等.一株抗真菌解淀粉芽孢桿菌的分離鑒定及其發(fā)酵條件的初步研究[J].微生物學(xué)報(bào)，2006，46（1）

[30]林巧玲，盧乃會(huì)，何紅，等.海洋細(xì)菌解淀粉芽胞桿菌SH-27在大豆體內(nèi)的定殖動(dòng)態(tài)及促生防病作用中國生物防治學(xué)報(bào)，2019，35（2）：240-246.