諸 君， 孔 燕， 史簫笛， 榮強(qiáng)全， 徐 飛

(1.江蘇省南京市高淳人民醫(yī)院， 江蘇 南京 211300 2.江蘇省南京市兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科， 江蘇 南京 210000)

甲型流感是一種由病毒感染引起的急性呼吸道疾病，具有致病性高、傳染性強(qiáng)、病毒易變異、死亡率高等特點(diǎn)，資料顯示，甲型流感的發(fā)病年齡較小，青少年及兒童發(fā)病人數(shù)約占全部確診人數(shù)的60%[1]。研究表明，甲型流感患者常見(jiàn)死亡原因之一是繼發(fā)肺部感染，目前臨床上常見(jiàn)的繼發(fā)肺部感染病原體包括肺炎鏈球菌(streptococcus pneumoniae，SPN)及流感嗜血桿菌等，其中肺炎鏈球菌在重癥甲型流感患兒中發(fā)生率較高，而且與非甲流引得肺部感染比較，其具有更強(qiáng)傳染性，對(duì)于抵抗能力較差患兒，將嚴(yán)重影響患兒生命健康及生活安全[2]。目前由于抗生素的濫用，肺炎鏈球菌對(duì)青霉素、紅霉素及萬(wàn)古霉素等多種抗生素的耐藥性普遍呈上升趨勢(shì)，且不同地區(qū)、不同人群肺炎鏈球菌的耐藥性存在不同程度差異[3]，因此，臨床上加強(qiáng)對(duì)甲型鏈球菌的耐藥檢測(cè)具有十分重要的意義。本研究通過(guò)對(duì)常用肺炎鏈球菌抗菌藥物的耐藥性及耐藥基因分布進(jìn)行探討，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料:選取2016年1月至2019年1月在南京市高淳人民醫(yī)院就診的476例甲型流感患兒為研究對(duì)象，其中男247例，女229例，年齡0.2～3歲，平均年齡(1.15±0.62)歲，納入標(biāo)準(zhǔn)：①出現(xiàn)流感樣癥狀(包括發(fā)熱、鼻塞、流涕、咳嗽、咽痛、頭痛、肌痛、嘔吐、腹瀉、乏力等)；②甲型流感病毒核酸檢測(cè)陽(yáng)性(咽拭子或鼻拭子陽(yáng)性)；③年齡≤3歲；④患兒家屬均已簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①非甲流患兒；②合并嚴(yán)重心、腦、血管疾病患兒；③合并肝、腎功能異?；純?；④合并造血系統(tǒng)等疾病患兒。本研究經(jīng)南京市高淳人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審批。

1.2方 法

1.2.1標(biāo)本采集與鑒定:采集甲型流感患兒住院當(dāng)日咽拭子或鼻拭子標(biāo)本，將各個(gè)咽拭子或鼻拭子標(biāo)本常規(guī)接種于血平板，將其置于35℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～24h，菌落長(zhǎng)出后，挑選血平板上呈灰白色、半透明、直徑0.5～1.5cm、表面光滑、菌落周?chē)胁菥G色溶血環(huán)的可疑菌落進(jìn)行純化，經(jīng)奧普托欣實(shí)驗(yàn)鑒別后，采用美國(guó)Biolog全自動(dòng)微生物鑒定儀(購(gòu)自華粵行儀器有限公司)進(jìn)行菌株鑒定。

1.2.2藥敏試驗(yàn):采用瓊脂稀釋法通過(guò)全自動(dòng)細(xì)菌鑒定/藥敏系統(tǒng)對(duì)肺炎鏈球菌進(jìn)行藥敏檢測(cè)確認(rèn)，采用以ATCC49619作為SP藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)菌株，每次實(shí)驗(yàn)前均做質(zhì)控對(duì)照，ATCC49619菌株購(gòu)自上海北諾生物科技有限公司。紅霉素、克林霉素、青霉素、萬(wàn)古霉素、阿奇霉素、頭孢他啶、美羅培南、四環(huán)素、利奈唑胺、莫西沙星均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品鑒定所。

1.2.3基因分型檢測(cè):采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行檢測(cè)，Zhao等[4]實(shí)驗(yàn)過(guò)程進(jìn)行檢測(cè)，pbp2B、ermB、mefA、tetM基因引物均由上海生物工程股份有限公司進(jìn)行合成，相關(guān)引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

表2 肺炎鏈球菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料采用“%”表示，組間差異采用“χ2”檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1藥敏試驗(yàn)結(jié)果:476例甲型流感患兒咽拭子或鼻拭子標(biāo)本中共分離出肺炎鏈球菌36株(7.56%)，其中對(duì)紅霉素耐藥35株(97.22%)，對(duì)克林霉素耐藥31株(86.11%)，對(duì)青霉素耐藥36株(100.00%)，對(duì)萬(wàn)古霉素耐藥3株(8.33%)，對(duì)阿奇霉素耐藥30株(83.33%)，對(duì)頭孢他啶耐藥32株(88.89%)，對(duì)美羅培南耐藥1株(2.78%)，對(duì)四環(huán)素耐藥36株(100.00%)，對(duì)利奈唑胺耐藥11株(30.56%)，對(duì)莫西沙星耐藥36株(47.22%)，見(jiàn)表2。

2.2肺炎鏈球菌耐藥基因分型情況:36株肺炎鏈球菌含pbp2B耐藥基因32株(88.89%)，含ermA耐藥基因17株(47.22%)，含mefB耐藥基因21株(58.33%)，含tetM耐藥基因30株(83.33%)，見(jiàn)表3。

2.3不同耐藥細(xì)菌的耐藥基因分型情況:pbp2B、ermA、mefB、tetM基因突變與其耐藥表型的測(cè)定均具有較高一致性，其中對(duì)β-內(nèi)酯酰胺類(lèi)抗生素青霉素、頭孢他啶耐藥的肺炎鏈球菌中pbp2B基因檢測(cè)出率分別為88.89%、100.00%，對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素紅霉素、阿奇霉素耐藥的肺炎鏈球菌中ermA、mefB兩種基因中的任一種或二者同時(shí)存在的耐藥基因檢出率分別為97.14%、93.33%，對(duì)四環(huán)素耐藥的肺炎鏈球菌中tetM基因檢出率為83.33%，見(jiàn)表4。

表3 肺炎鏈球菌耐藥基因分型情況

表4 不同耐藥細(xì)菌的基因分型情況

3 討 論

甲型流感是一種急性傳染性疾病，具有起病急、傳染性強(qiáng)及流行廣泛等特點(diǎn)，可通過(guò)呼吸道、消化道和眼結(jié)膜等多種途徑進(jìn)行傳播[5]。臨床表現(xiàn)特征為發(fā)熱、鼻塞、流涕、咳嗽、咽痛、頭痛、肌痛、嘔吐、腹瀉、乏力等，部分患者出現(xiàn)肺炎鏈球菌感染，少數(shù)患者出現(xiàn)多臟器功能衰竭、急性呼吸窘迫綜合征而死亡，其中肺炎鏈球菌感染是甲型流感患者常見(jiàn)和嚴(yán)重的并發(fā)癥，嚴(yán)重威脅甲型流感患者的生命安全。研究表明，流感流行造成的高病死率與并發(fā)細(xì)菌感染，尤其是肺炎鏈球菌感染密切相關(guān)[6]。因此，進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)甲型流感患者肺炎鏈球菌的檢測(cè)，重視二者之間的關(guān)系，并及時(shí)采取相應(yīng)的治療措施，對(duì)于降低甲型流感的死亡率具有十分重要的意義。

目前肺炎鏈球菌臨床上首選的藥物是β-內(nèi)酯酰胺類(lèi)抗生素，如青霉素、頭孢他啶等，但近年來(lái)由于抗生素的濫用，肺炎鏈球菌對(duì)青霉素、頭孢他啶等藥品的耐藥率日益嚴(yán)重[7]，本研究從476例甲型流感患兒咽拭子或鼻拭子標(biāo)本中共分離出肺炎鏈球菌36株(7.56%)，通過(guò)分析肺炎鏈球菌對(duì)不同類(lèi)型抗生素的耐藥情況，以有效控制肺炎鏈球菌感染。方潮等[8]研究表明，肺炎鏈球菌對(duì)萬(wàn)古霉素(100.0%)，利奈唑胺(100.0%)和莫西沙星(100.0%)均敏感；而對(duì)紅霉素(1.7%)、克林霉素(3.7%)和四環(huán)素(5.0%)敏感率低。本研究結(jié)果顯示36株肺炎鏈球菌中對(duì)紅霉素耐藥35株(97.22%)，對(duì)克林霉素耐藥31株(86.11%)，對(duì)青霉素耐藥36株(100.00%)，對(duì)萬(wàn)古霉素耐藥3株(8.33%)，對(duì)阿奇霉素耐藥30株(83.33%)，對(duì)頭孢他啶耐藥32株(88.89%)，對(duì)美羅培南耐藥1株(2.78%)，對(duì)四環(huán)素耐藥36株(100.00%)，對(duì)利奈唑胺耐藥11株(30.56%)，對(duì)莫西沙星耐藥36株(47.22%)，與方潮等人對(duì)利奈唑胺及莫西沙星耐藥率差別較大，可能是由于樣本來(lái)源及地區(qū)差異等造成的。本研究與陳巧君等[3]對(duì)紅霉素、克林霉素及四環(huán)素的研究結(jié)果大致相符，陳巧君等研究表明SPN對(duì)紅霉素、克林霉素及四環(huán)素的耐藥率分別為95.6%、84.5%、87.4%，提示臨床上應(yīng)慎用大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)及四環(huán)素、克林霉素等抗生素，合理使用萬(wàn)古霉素、美羅培南及頭孢素類(lèi)抗生素作為替代藥物，因此臨床上應(yīng)加強(qiáng)對(duì)肺炎鏈球菌實(shí)施藥敏實(shí)驗(yàn)及耐藥性監(jiān)測(cè)，以指導(dǎo)臨床合理使用抗生素。

肺炎鏈球菌青霉素結(jié)合蛋白(PBPS)共有6個(gè)亞單位，其分別由pbp1A、pbp2A、pbp1B、pbp2B、pbp2X及pbp3編碼，其中肺炎鏈球菌的耐藥主要與pbp2B基因突變有關(guān)，變異的pbp2B與β-內(nèi)酯酰胺類(lèi)抗生素(包括青霉素、頭孢他啶等)親和力下降，從而產(chǎn)生耐藥性[9]。本研究結(jié)果通過(guò)分析肺炎鏈球菌耐藥顯示，36株肺炎鏈球菌中含pbp2B耐藥基因32株(88.89%)，pbp2B基因突變與其耐藥表型的測(cè)定具有較高一致性，有突變的菌株對(duì)青霉素全部耐藥，提示此時(shí)臨床上可考慮選用萬(wàn)古霉素等進(jìn)行治療，肺炎鏈球菌erm、mef基因是紅霉素類(lèi)的耐藥基因，ermA、mefB兩種基因中的任一種單獨(dú)表達(dá)，或二者同時(shí)表達(dá)，均能夠引起肺炎鏈球菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素(紅霉素、阿奇霉素)耐藥。本研究結(jié)果顯示含ermA耐藥基因17株(47.22%)，含mefB耐藥基因21株(58.33%)，表明ermA、mefB基因的存在可能提示其對(duì)紅霉素類(lèi)抗生素耐藥。本研究結(jié)果顯示含tetM耐藥基因30株(83.33%)，對(duì)四環(huán)素耐藥的肺炎鏈球菌中tetM基因檢出率為83.33%，提示tetM基因存在可能是引起四環(huán)素耐藥的主要原因。

綜上所述，肺炎鏈球菌對(duì)青霉素、紅霉素、四環(huán)素等抗生素的耐藥性較高，不適用于甲型流感患兒肺炎鏈球菌感染的臨床治療，肺炎鏈球菌的耐藥性與相關(guān)耐藥基因(pbp2B、ermA、mefB、tetM)的表達(dá)有關(guān)，臨床上加強(qiáng)病原學(xué)檢測(cè)，進(jìn)而為合理選擇抗菌藥物提供可靠依據(jù)，另外本研究樣本例數(shù)較少，后期準(zhǔn)備擴(kuò)大樣本容量繼續(xù)進(jìn)行研究。