亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        魯卡因調(diào)節(jié)TRAIL基因抑制宮頸癌細胞增殖和誘導細胞凋亡的機制研究

        2020-01-18 07:35:16金翠紅劉淑娟靜金艷
        河北醫(yī)學 2020年1期
        關鍵詞:普魯卡因宮頸癌試劑盒

        金翠紅, 劉淑娟, 靜金艷

        (1.河北省灤平縣中醫(yī)院, 河北 灤平 068250 2.河北省承德市婦幼保健院, 河北 承德 067000)

        宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤,發(fā)病率及死亡率高,而晚期宮頸癌易發(fā)生遠處轉移,侵襲性、淋巴轉移率高,預后較差[1]。在治療過程中抑制腫瘤細胞增殖,促進凋亡是治療腫瘤的關鍵。普魯卡因是一種常見的麻醉藥物,近年來研究發(fā)現(xiàn)其還有抗腫瘤作用,如普魯卡因對胃癌細胞具有生長抑制和凋亡誘導作用[2]。普魯卡因還可抑制人類白血病細胞的生長[3]。腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體(tumor necrosis factor related apoptosis-inducingand,TRAIL)是腫瘤壞死因子超家族成員,可誘導腫瘤細胞凋亡,臨床上是極具潛能的抗腫瘤藥物[4]。研究發(fā)現(xiàn)TRAIL能夠誘導人前列腺癌細胞株PC-3細胞凋亡而不損傷正常細胞[5]。但普魯卡因和TRAIL對宮頸癌細胞增殖和凋亡的影響還尚未清楚,本實驗旨在研究普魯卡因和TRAIL對宮頸癌細胞增殖和凋亡的影響及普魯卡因是否通過TRAIL影響宮頸癌細胞的增殖、凋亡。

        1 材料與方法

        1.1材料:宮頸癌細胞SiHa購自中國科學院上海細胞庫;胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國Gibico公司;普魯卡因購自福州海王福藥制藥有限公司;Lipofectamine TM 2000購自Sigma公司;Trizol試劑、反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa公司;MTT試劑盒、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙錠(PI)試劑盒、BCA試劑盒、RIPA蛋白裂解液、SDS-PAGE試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司;抗體購自上海煊翎生物科技有限公司;載體質粒均由金瑞斯生物科技公司構建。

        1.2方 法

        1.2.1細胞培養(yǎng):宮頸癌細胞SiHa用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基于37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng),2d換液一次,待細胞融合至80%左右時,加入胰蛋白酶進行消化傳代,選取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

        1.2.2藥物處理與分組:當細胞融合至80%左右時,將細胞傳代接種至96孔板中,并用不同濃度的普魯卡因(0.0 mM/L、0.5 mM/L、1 mM/L、2 mM/L)處理SiHa細胞,實驗分為普魯卡因0.0 mM/L組、普魯卡因0.5 mM/L組、普魯卡因1 mM/L組、普魯卡因2 mM/L組。將pcDNA、pcDNA-TRAIL轉染至SiHa細胞,記為pcDNA組、pcDNA-TRAIL組;將si-NC、si-TRAIL轉染至SiHa細胞后用2mM/L的普魯卡因處理,分別記為普魯卡因2mM/L+si-NC組、普魯卡因2mM/L+si-TRAIL組,轉染均采用Lipofectamine TM 2000轉染試劑盒。

        1.2.3MTT檢測細胞增殖:在各組細胞培養(yǎng)至48h時加入20μL(5g/L)的MTT溶液,繼續(xù)孵育4h;棄去多余培養(yǎng)基并加入150μL DMSO振蕩反應10min,酶標儀檢測490 nm處吸光度(OD)值。細胞增殖抑制率(%)=1-實驗組OD值/空白對照組OD值×100%。每組重復3次。

        1.2.4流式細胞術檢測細胞凋亡:用不含EDTA的胰酶消化各組細胞,離心收集細胞,PBS漂洗2次,加結合緩沖液重懸細胞。依據(jù)試劑盒說明書,先后加入Annexin V-FITC和PI避光孵育。流式細胞儀檢測激發(fā)波長488 nm和發(fā)射波長530 nm處的熒光強度。實驗重復3次。

        1.2.5qRT-PCR檢測TRAIL mRNA的表達水平:收集不同濃度普魯卡因處理組細胞,研磨充分后加入Trizol試劑提取總RNA,微量核酸測定儀檢測RNA純度和濃度。使用TaKaRa反轉錄試劑盒將RNA反轉錄成cDNA,按照TaKaRa 熒光定量試劑盒使用說明配制反應體系,以β-actin為內(nèi)參進行PCR擴增,每個樣品重復3次,循環(huán)條件為95℃ 30s,60℃ 30s;72℃ 30s,共40個循環(huán);60 ℃延長5min。相對表達量采用2-△△Ct法計算。

        1.2.6Western blot檢測蛋白表達:收集各組細胞,加入RIPA裂解液裂解,4℃,12000 g離心15 min,收集蛋白上清液,BCA試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳后轉至PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1h。分別加入一抗(1:1000),4℃孵育過夜,TBST洗膜;加入二抗(1:2000)室溫孵育2h,TBST洗滌3次,每次10min,后在暗室中曝光顯影,再浸入定影,最后洗去殘液晾干,將膠片用Quantity One凝膠分析軟件處理,測定各組蛋白條帶的吸光度,以目的條帶和GAPDH條帶的比值作為蛋白表達水平。每個蛋白樣品重復3次。

        2 結 果

        2.1普魯卡因對宮頸癌SiHa細胞增殖、凋亡的影響:Western Blot檢測結果(圖1A,表1)顯示,與普魯卡因0.0mM/L組相比,普魯卡因0.5mM/L、1mM/L、2mM/L組宮頸癌SiHa細胞中CyclinD1、Bcl-2蛋白的表達水平逐漸顯著降低,P21、Caspase-8、Bax蛋白的表達水平逐漸顯著升高(P<0.05)。MTT法檢測結果(表1)顯示,與普魯卡因0.0mM/L組相比,普魯卡因0.5mM/L、1mM/L、2mM/L組宮頸癌SiHa細胞增殖抑制率逐漸顯著升高,呈濃度依賴型(P<0.05)。流式細胞儀檢測結果(圖1B,表1)顯示,與普魯卡因0.0mM/L組相比,普魯卡因0.5mM/L、1mM/L、2mM/L組宮頸癌SiHa細胞的凋亡率顯著升高,呈濃度依賴型(P<0.05)??梢?,普魯卡因抑制宮頸癌SiHa細胞增殖、促進凋亡。A:增殖、凋亡相關蛋白表達;B:宮頸癌SiHa細胞的凋亡

        表1 普魯卡因對宮頸癌SiHa細胞增殖的影響

        圖1 普魯卡因對宮頸癌SiHa細胞增殖、凋亡的影響

        圖2 TRAIL蛋白表達

        2.2普魯卡因對宮頸癌SiHa細胞中TRAIL表達的影響:qRT-PCR檢測結果(表2)顯示,與普魯卡因0.0mM/L組相比,普魯卡因0.5mM/L、1mM/L、2mM/L組宮頸癌SiHa細胞中TRAILmRNA的表達水平逐漸顯著升高,呈濃度依賴型(P<0.05)。Western Blot檢測結果(圖2,表2)顯示,與普魯卡因 0.0mM/L組相比,普魯卡因 0.5mM/L、1mM/L、2mM/L組宮頸癌SiHa細胞中TRAIL蛋白的表達水平逐漸顯著升高,呈濃度依賴型(P<0.05)??梢?,普魯卡因促進宮頸癌SiHa細胞中TRAIL的表達。

        表2 普魯卡因對宮頸癌SiHa細胞中TRAIL表達的影響

        2.3過表達TRAIL對宮頸癌SiHa細胞增殖的影響:Western Blot檢測結果(圖3,表3)顯示,與pcDNA-NC組相比,pcDNA-TRAIL組宮頸癌SiHa細胞中CyclinD1蛋白的表達水平顯著降低,P21蛋白的表達水平顯著升高(P<0.05)。MTT法檢測結果(表3)顯示,與pcDNA-NC組相比,pcDNA-TRAIL組宮頸癌SiHa細胞增殖抑制率逐漸顯著升高(P<0.05)。可見,過表達TRAIL抑制宮頸癌SiHa細胞增殖。

        表3 過表達TRAI對宮頸癌SiHa細胞增殖的影響

        表4 過表達TRAIL對宮頸癌SiHa細胞凋亡的影響

        圖3 TRAIL和增殖相關蛋白的表達

        圖4 TRAIL和凋亡相關蛋白的表達

        2.4過表達TRAIL對宮頸癌SiHa細胞凋亡的影響:Western Blot檢測結果(圖4,表4)顯示,與pcDNA-NC組相比,pcDNA-TRAIL組宮頸癌SiHa細胞中Bcl-2蛋白的表達水平顯著降低,Caspase-8、Bax蛋白的表達水平顯著升高(P<0.05)。流式細胞儀檢測結果(表4)顯示,與pcDNA-NC組相比,pcDNA-TRAIL組宮頸癌SiHa細胞的凋亡率顯著升高(P<0.05)。可見,過表達TRAIL促進宮頸癌SiHa細胞凋亡。

        圖5 抑制TRAIL表達對宮頸癌SiHa細胞增殖、凋亡相關蛋白的影響

        2.5抑制TRAIL逆轉普魯卡因抑制細胞增殖、促進細胞凋亡的作用:Western Blot檢測結果(圖5,表5,表6)顯示,與普魯卡因 0.0mM/L組相比,普魯卡因 2mM/L組宮頸癌SiHa細胞中CyclinD1、Bcl-2蛋白的表達水平顯著降低,P21、Caspase-8、Bax蛋白的表達水平顯著升高;與普魯卡因 2mM/L+si-NC組相比,普魯卡因 2mM/L+si-TRAIL組宮頸癌SiHa細胞中CyclinD1、Bcl-2蛋白的表達水平顯著升高,P21、Caspase-8、Bax蛋白的表達水平顯著降低(P<0.05)。MTT法檢測結果(表5)顯示,與普魯卡因 0.0mM/L組相比,普魯卡因 2mM/L組宮頸癌SiHa細胞增殖抑制率顯著升高;與普魯卡因 2mM/L+si-NC組相比,普魯卡因 2mM/L+si-TRAIL組宮頸癌SiHa細胞增殖抑制率顯著降低(P<0.05)。流式細胞儀檢測結果(表6)顯示,與普魯卡因 0.0mM/L組相比,普魯卡因 2mM/L組宮頸癌SiHa細胞的凋亡率顯著升高;與普魯卡因 2mM/L+si-NC組相比,普魯卡因 2mM/L+si-TRAIL組宮頸癌SiHa細胞的凋亡率顯著降低(P<0.05)??梢?,抑制TRAIL逆轉了普魯卡因抑制細胞增殖、促進細胞凋亡的作用。

        表5 抑制TRAIL表達對宮頸癌SiHa細胞增殖的影響

        表6 抑制TRAIL表達對宮頸癌SiHa細胞凋亡的影響

        3 討 論

        宮頸癌嚴重地威脅廣大女性生命健康,尋找多種有效治療方法對治療宮頸癌具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)普魯卡因可抑制脂多糖誘導的結腸癌細胞腫瘤侵襲性行為[6]。普魯卡因還可通過調(diào)節(jié)RhoA使ERK / MAPK / FAK通路失活來抑制結腸癌細胞的增殖和遷移[7]。鹽酸普魯卡因通過去ID4基因甲基化抑制白血病HL-60細胞增殖。本研究結果發(fā)現(xiàn),普魯卡因抑制CyclinD1、Bcl-2的表達,促進P21、Caspase-8、Bax的表達;抑制宮頸癌細胞SiHa的增殖,促進細胞凋亡;且還提高了TRAIL的表達水平。

        TRAIL是一種凋亡分子,能與死亡受體特異性結合后選擇性誘導癌細胞凋亡,在癌癥的發(fā)生、發(fā)展和治療方面扮演著重要的角色,是一種有潛力的抗腫瘤細胞因子[8]。研究發(fā)現(xiàn)TRAIL可明顯抑制腫瘤生長,誘導黑色素瘤細胞凋亡[9]。TRAIL-R1的單克隆抗體通過激活caspase-8途徑增強了TRAIL誘導的細胞凋亡[10]。阻止caspase-8激活可抑制TRAIL介導的癌細胞凋亡[11]。本研究發(fā)現(xiàn),過表達TRAIL能促進Caspase-8蛋白的表達,抑制宮頸癌細胞SiHa的增殖,促進細胞凋亡,提示TRAIL通過Caspase-8途徑影響了宮頸癌的凋亡。PI3K/mTOR雙靶點抑制劑PI-103與TRAIL聯(lián)合應用可使細胞周期停滯在S期,CyclinD1表達水平降低,抑制喉鱗癌細胞增殖。還有研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)P21和TRAIL可抑制黑素瘤HTB-72細胞的生長。本實驗結果顯示,過表達TRAIL降低了CyclinD1蛋白的表達水平,提高了P21蛋白的表達水平[12]。提示,TRAIL可能通過影響CyclinD1和P21的表達水平影響細胞增殖。且本實驗還發(fā)現(xiàn)抑制TRAIL表達逆轉了普魯卡因對宮頸癌細胞SiHa的增殖抑制和凋亡促進作用,提示普魯卡因可能影響TRAIL表達影響宮頸癌的凋亡。

        綜上所述,普魯卡因可抑制宮頸癌細胞SiHa的增殖,促進細胞凋亡,其機制可能與調(diào)控TRAIL有關。將可為宮頸癌的治療提供新思路和新靶點。

        猜你喜歡
        普魯卡因宮頸癌試劑盒
        中老年女性的宮頸癌預防
        普魯卡因在獸醫(yī)臨床上的應用及注意事項
        Hepsin及HMGB-1在宮頸癌組織中的表達與侵襲性相關性分析
        GlobalFiler~? PCR擴增試劑盒驗證及其STR遺傳多態(tài)性
        GoldeneyeTM DNA身份鑒定系統(tǒng)25A試劑盒的法醫(yī)學驗證
        E-cadherin、Ezrin在宮頸癌組織中的表達及臨床意義
        食管疾病(2015年3期)2015-12-05 01:45:07
        止血散聯(lián)合普魯卡因治療肺結核咯血患者的療效觀察
        Survivin、NF-кB和STAT3 mRNA在宮頸癌中的表達及其臨床意義
        牛結核病PCR診斷試劑盒質量標準的研究
        ELISA試劑盒法測定水中LR型微囊藻毒素
        台湾佬娱乐中文22vvvv| 国产手机在线观看一区二区三区| 国产爆乳美女娇喘呻吟| 国产精品无码成人午夜电影| 精品免费福利视频| 韩国美女主播国产三级| 高清日韩av在线免费观看| 国产乱人激情h在线观看| 杨幂AV污网站在线一区二区| 日本丰满少妇高潮呻吟| 日本视频一区二区三区观看| 无码人妻丰满熟妇区五十路| 少妇被粗大的猛进69视频| 亚欧视频无码在线观看| 国内精品国产三级国产| 人妻仑乱a级毛片免费看| 少妇极品熟妇人妻无码| 熟妇与小伙子露脸对白| 少妇又色又爽又高潮在线看| 日韩aⅴ人妻无码一区二区| 亚洲人成网站77777在线观看| 亚洲在线一区二区三区四区| 亚洲免费女女在线视频网站| 精品久久久久久成人av| 亚洲丁香婷婷综合久久小说 | 伊人久久大香线蕉亚洲五月天| 国产成人精选在线不卡| 国产一级一厂片内射视频播放| 久久久精品人妻一区二区三区四区| 三年在线观看免费大全下载 | 亚洲精品2区在线观看| 国产高清在线一区二区不卡| 无码少妇精品一区二区免费动态| 亚洲国产一区在线二区三区| 亚洲国产人成自精在线尤物| 曰韩无码av一区二区免费| 国产欧美亚洲精品a| 精品国产迪丽热巴在线| 在线观看国产成人自拍视频 | 亚洲av成人精品日韩一区| 激情五月天俺也去综合网|