劉小江， 李 軍， 管義祥

(江蘇省海安市人民醫(yī)院神經(jīng)外科， 江蘇 海安 226600)

腦出血是臨床上的危急重癥之一，發(fā)病占腦卒中的10%～30%，具有高發(fā)病率、高死亡率和低治愈率的特點(diǎn)[1]。高血壓性腦出血(hypertensive intracerebral hemorrhage，HICH)是由于高血壓常導(dǎo)致腦內(nèi)小動(dòng)脈血管壁上發(fā)生玻璃樣或纖維樣病變，進(jìn)而引起已病變的動(dòng)脈破裂出血所致，約占自發(fā)性腦出血的70%～80%[2]。HICH發(fā)生后，血管破裂出血會(huì)引發(fā)血腫壓迫病灶周?chē)X組織，繼發(fā)腦水腫，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞受損，誘發(fā)腦部炎癥變化，激活神經(jīng)細(xì)胞凋亡，并最終引起繼發(fā)性腦組織損傷。目前，手術(shù)清除血腫可緩解周?chē)X組織的機(jī)械性壓迫，但是針對(duì)出血引起的繼發(fā)性腦損傷仍缺乏有效治療手段。MicroRNAs(miRs)是一類(lèi)由內(nèi)源基因編碼、長(zhǎng)度在19～25個(gè)核苷酸的小RNA[3]。MiRs與靶標(biāo)mRNA的3'-UTR區(qū)結(jié)合，可以降解或抑制靶向mRNA的翻譯，抑制轉(zhuǎn)錄后水平的蛋白質(zhì)表達(dá)，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、代謝、增殖和凋亡。MiR-27b是miR-27家族的一個(gè)亞型。近年來(lái)眾多研究表明，miR-27b具有響應(yīng)生物體氧化應(yīng)激(oxidative stress，OS)反應(yīng)的功能，并參與Ⅱ型糖尿病、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胃癌等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展[4]。Nrf2/ARE信號(hào)通路是生物體內(nèi)最重要的抗氧化信號(hào)通路，可被外界各種OS所誘導(dǎo)，通過(guò)活化后的轉(zhuǎn)錄因子核因子相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)與其DNA結(jié)合序列antioxidant response element(ARE)結(jié)合并激發(fā)下游靶基因的表達(dá)。這些靶基因主要包括血紅素加氧酶(heme oxygenase 1，HO-1)、醌氧化還原酶1(quinone oxidoreductase 1，Nqo1)和甘肽過(guò)氧化酶1(glutathione peroxidase，Gpx1)等[5]。目前miR-27b與HICH之間的關(guān)系缺乏相關(guān)報(bào)道，Nrf2/ARE信號(hào)通路在HICH中的表達(dá)變化也尚未明確。因此，本研究擬通過(guò)調(diào)控miR-27b在HICH大鼠中的表達(dá)，分析miR-27b對(duì)Nrf2/ARE信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白以及HICH的影響，探討尋找治療HICH的藥物新靶點(diǎn)的可能性。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物分組:普通級(jí)健康雄性Wistar大鼠60只，體重220～270g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。隨機(jī)分為以下4組，Sharm組、HICH組、HICH-NC組和HICH- antagomir組，每組各45只。

1.2HICH大鼠模型的制備:首先采用雙側(cè)腎動(dòng)脈前支部分熱凝、高鹽高脂高膽固醇飲食飼養(yǎng)6周后建立大鼠高血壓模型，期間每周用RBP-1B型大鼠血壓計(jì)行尾部血壓測(cè)量1次。在上述高血壓模型基礎(chǔ)上，采用立體定位儀下自體血腦內(nèi)注入法建立高血壓腦出血模型。具體步驟為：用100g/L水合氯醛350mg/kg體質(zhì)量腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠，腹位固定于定向儀上，頂部剃毛消毒后正中矢狀位切開(kāi)，在前囟后0.2mm，右旁開(kāi)3.0mm處行顱骨鉆，用50℃溫水加溫鼠尾，斷尾取血100μL，在立體定向儀下進(jìn)針6.0mm(相當(dāng)于尾殼核部)，3min內(nèi)將50μL血注入大鼠腦內(nèi)(相當(dāng)于人腦出血40mL)，留針10min后退出，縫合頭皮。Sharm組采用腦出血模型制備同種方法，但進(jìn)針后不注血，注入50μL生理鹽水代替自體血。HICH大鼠前3d，HICH組、HICH-NC組和HICH- antagomir組分別將5μL生理鹽水、5μL(20nmoL/L)拮抗劑陰性對(duì)照、5μL(20nmoL/L)miR-27b拮抗劑注入大鼠右側(cè)腦室，具體坐標(biāo)為前鹵后1.5mm，中線右側(cè)旁開(kāi)1.1mm，立體定位儀下進(jìn)針4.5mm。miR-27b拮抗劑購(gòu)自Ribobio(China)。Sharm組采用同種方法，注入等量生理鹽水。

1.3qRT-PCR檢測(cè)miR-27b、Nrf2基因表達(dá):分別在造模后的第6h、12h、24h、48h和72h，采用qRT-PCR檢測(cè)HICH組大鼠和Sharm組大鼠miR-27b及Nrf2 mRNA水平。取大鼠出血部位紋狀體腦組織，Trizol法(Invitrogen，USA)提取總RNA。miR-27b mRNA 5'-3'端引物序列為T(mén)TCACAGTGGCTAAGTTCTGC；Nrf2 mRNA 5'-3'端引物序列為T(mén)TTGTAGATGACCATGAGTCGC，3'-5'端引物序列為T(mén)GTCCTGCTGTATGCTGCTT。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara，Japan)和Mir-XTMmiRNA First Strand Synthesis Kit(Takara，Japan)分別合成cDNA。以cDNA為模板，按照熒光定量PCR試劑盒TB Green Premix Ex Taq (Takara，Japan)說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)，miR-27b mRNA 3'-5'端引物為試劑盒常用引物。2-ΔΔct進(jìn)行數(shù)據(jù)定量分析。

1.4Western Blot檢測(cè)Nrf2、HO-1和Nqo1蛋白質(zhì)表達(dá):取大鼠紋狀體腦組織，加入RIPA細(xì)胞裂解液(Beyotime，China)，4℃下制備組織勻漿。BCA試劑盒(Beyotime，China)測(cè)定蛋白濃度，根據(jù)所測(cè)蛋白濃度計(jì)算上樣體積。10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，PVDF轉(zhuǎn)膜。5%脫脂牛奶室溫封閉1h，分別加一抗Nrf2(1:1000，Abcam，UK)、HO-1(1:10000，Abcam，UK)、Nqo1(1:1000，Abcam，UK)及β-actin(1:1000)4℃孵育過(guò)夜。第2天加二抗室溫孵育2h，TBST洗膜后，GE Amersham Imager 600顯影成像，ImageJ軟件定量分析各組蛋白表達(dá)差異，以β-actin為內(nèi)參，進(jìn)行蛋白表達(dá)相對(duì)定量計(jì)算。

1.5SOD、TNF-α和IL-1β水平檢測(cè):在給藥造模后的24h，處死大鼠，出血部位提取腦組織制備10%組織勻漿，離心10min。SOD檢測(cè)采用黃嘌呤氧化法，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行各項(xiàng)操作內(nèi)容，試劑盒采購(gòu)自南京建成生物工程研究所。TNF-α和IL-1β檢測(cè)采用Elisa，試劑盒購(gòu)自Bio-Rad(USA)，操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.6TUNEL法流式細(xì)胞分析法檢測(cè)神經(jīng)組織細(xì)胞凋亡:采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記測(cè)定法(TUNEL)進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程根據(jù)試劑盒(Roche，US)要求操作，使用Image-pro plus系統(tǒng)分析在光學(xué)顯微鏡(每組選擇5個(gè)隨機(jī)的視野，400X放大率)下觀察到的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。流式細(xì)胞分析法取各組新鮮腦組織4℃研磨制成組織勻漿，篩網(wǎng)過(guò)濾后加入PBS溶液配成細(xì)胞懸液，1000 rpm離心5 min，用PBS緩沖液洗滌上清液細(xì)胞。之后1000rpm再次離心5min，向沉淀中加入500μL膜聯(lián)蛋白結(jié)合緩沖液，吹打混勻，加入5μL的Annexin V- FITC試劑常溫避光靜置10min，加入10μL PI試劑室溫下避光孵育5min。流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，分析細(xì)胞凋亡百分率。

2 結(jié) 果

2.1HICH大鼠miR-27b和Nrf2 mRNA水平的變化:與Sham組比較，miR-27b表達(dá)量在HICH后6 h顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),并在24 h達(dá)到最低水平(P<0.05)，隨后miR-27b水平開(kāi)始上升，在72 h逐漸恢復(fù)至正常水平(P>0.05)。同時(shí)，Nrf2 mRNA水平也呈現(xiàn)出時(shí)間依賴(lài)性變化。在HICH后的6h，Nrf2 mRNA水平顯著升高(P<0.05)，并在24 h 達(dá)到最高水平(P<0.05)，隨后Nrf2 mRNA表達(dá)量開(kāi)始下降，在72 h后逐漸恢復(fù)至正常水平(圖1)。這些結(jié)果表明miR-27b與Nrf2信號(hào)通路之間存在明顯的負(fù)相關(guān)性。

圖1 不同時(shí)間點(diǎn)HICH大鼠miR-27b和Nrf2 mRNA表達(dá)情況。*表示與Sharm組比較

2.2miR-27b拮抗劑誘導(dǎo)HICH大鼠Nrf2/ARE信號(hào)通路Nrf2、HO-1、Nqo1表達(dá)激活:為進(jìn)一步探究miR-27b與Nrf2/ARE信號(hào)通路之間的關(guān)系，我們通過(guò)側(cè)腦室注射miR-27b拮抗劑，測(cè)定Nrf2/ARE下游蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果見(jiàn)圖2。與Sharm組相比，HICH組Nrf2、HO-1、Nqo1蛋白表達(dá)量顯著提高(P<0.05)，而注射miR-27b拮抗劑的HICH-antagomir組Nrf2、HO-1、Nqo1表達(dá)與HICH組相比，表達(dá)量則進(jìn)一步提高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明miR-27b拮抗劑可以進(jìn)一步激活Nrf2/ARE下游抗氧化蛋白的表達(dá)。

圖2 miR-27b拮抗劑促進(jìn)Nrf2/ARE信號(hào)通路下游蛋白表達(dá)。*表示與Sharm組相比；#表示與HICH組相比

2.3miR-27b拮抗劑對(duì)HICH大鼠腦組織氧化損傷和神經(jīng)炎癥的作用:進(jìn)一步驗(yàn)證miR-27b拮抗劑對(duì)HICH誘導(dǎo)的OS的影響，如圖3所示。與HICH組比較，HICH-antagomir組SOD水平顯著提高，TNF-α和IL-1β水平則顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明miR-27b拮抗劑有效緩解了HICH對(duì)大鼠腦組織造成的氧化損傷以及神經(jīng)炎癥。

圖3 miR-27b拮抗劑緩解HICH大鼠腦組織氧化損傷和神經(jīng)炎癥。*表示與Sharm組相比；#表示與HICH組相比

2.4miR-27b拮抗劑緩解HICH大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡:為了檢測(cè)miR-27b拮抗劑對(duì)HICH大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響(圖4)。分析各組實(shí)驗(yàn)結(jié)果，HICH組陽(yáng)性細(xì)胞比率比Sham組顯著提高(58.85±6.89% vs. 8.79±1.52%)，差異具有顯著性(P<0.01)。HICH-antagomir組與HICH組比較，TUNEL陽(yáng)性比率則顯著降低(29.52±3.69% vs. 58.85±6.89%)，差異具有顯著性(P<0.05)。流式細(xì)胞圖顯示Sham組細(xì)胞凋亡率3.06%；HICH細(xì)胞凋亡率50.00%；HICH-NC組細(xì)胞凋亡率36.58%；HICH-antagomir組細(xì)胞凋亡率12.2%。這些結(jié)果表明miR-27b拮抗劑對(duì)HICH大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡具有一定的緩解效果。

圖4 TUNEL法和流式細(xì)胞分析法檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。*表示與Sharm組相比；#表示與HICH組相比

3 討 論

在腦實(shí)質(zhì)中HICH造成血液成分發(fā)生崩解，進(jìn)而引發(fā)大量活性氧組(reactive oxygen species，ROS)釋放，誘發(fā)OS，造成脂質(zhì)、DNA、蛋白質(zhì)等發(fā)生氧化損傷以及神經(jīng)炎癥，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡，是造成繼發(fā)性腦損傷的主要原因。本研究發(fā)現(xiàn)，在HICH大鼠模型中抑制miR-27b的表達(dá)，能夠有效緩解HICH造成的氧化損傷以及神經(jīng)炎癥，對(duì)HICH導(dǎo)致的繼發(fā)性腦損傷具有保護(hù)作用。有研究表明，抑制miR-27b可能與Nrf2/ARE信號(hào)通路的激活有關(guān)，這與我們的研究結(jié)果一致[6]。

最近的一些研究表明，生物體內(nèi)的OS可以通過(guò)影響miRs裝配成熟的關(guān)鍵分子來(lái)調(diào)節(jié)miR的生物學(xué)功能，同時(shí)miRs本身也可以被OS調(diào)節(jié)，從而改變miRs的完整性、穩(wěn)定性和生物學(xué)功能[7]。目前有多種miR通過(guò)抗氧化途徑參與到對(duì)OS的細(xì)胞應(yīng)答。MiR-27b是一類(lèi)與OS有關(guān)的miRs，在生物體內(nèi)受到氧化刺激后，miR-27b表達(dá)被明顯抑制[8]。在本研究中，HICH大鼠腦內(nèi)的miR-27b表達(dá)量在造模后發(fā)生了明顯下降，說(shuō)明HICH大鼠腦內(nèi)可能產(chǎn)生大量OS。檢測(cè)SOD、TNF-α和IL-1β水平發(fā)現(xiàn)，SOD水平與Sham組相比顯著降低，同時(shí)TNF-α和IL-1β水平則顯著上升。進(jìn)一步驗(yàn)證了HICH大鼠腦內(nèi)發(fā)生嚴(yán)重的OS和神經(jīng)炎癥反應(yīng)。Nrf2是維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，是miR-27b的潛在靶標(biāo)分子。HICH模型大鼠中進(jìn)行的miR-27b和Nrf2 mRNA表達(dá)研究結(jié)果顯示，miR-27b的下調(diào)的同時(shí)，大鼠的Nrf2 mRNA表達(dá)顯著上調(diào)，說(shuō)明miR-27b和Nrf2表達(dá)之間可能存在負(fù)相關(guān)性。鑒于Nrf2在大鼠HICH模型中的神經(jīng)保護(hù)作用以及Nrf2與miR-27b之間潛在的相互作用，我們認(rèn)為miR-27b表達(dá)的下調(diào)可被視為對(duì)HICH的保護(hù)性應(yīng)答機(jī)制。

生物體內(nèi)，SOD具有清除自由基和阻斷自由基觸發(fā)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)及細(xì)胞損傷的作用[9]。TNF-α和IL-1β則是NF-kB表達(dá)的下游響應(yīng)因子，是參與生物體炎癥反應(yīng)的重要因子[10]。HICH模型大鼠側(cè)腦室注射給藥miR-27b拮抗劑，抑制miR-27b的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，miR-27b表達(dá)量降低會(huì)激活Nrf2/ARE下游靶標(biāo)蛋白HO-1、Nqo1的表達(dá)，使HICH大鼠腦組織內(nèi)的SOD水平逐漸恢復(fù)至正常狀態(tài)，TNF-α和IL-1β水平同時(shí)也會(huì)顯著降低。表明miR-27b表達(dá)降低能夠激活Nrf2/ARE信號(hào)通路，有效緩解HICH模型大鼠體內(nèi)的氧化損傷和神經(jīng)炎癥。MiR-27b拮抗劑的使用同時(shí)也大幅度降低了腦組織內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。這些結(jié)果提示，通過(guò)抑制miR-27b的表達(dá)，激活Nrf2/ARE信號(hào)通路，對(duì)于HICH模型大鼠的腦損傷具有一定的療效，這為進(jìn)一步研發(fā)HICH藥物提供了理論基礎(chǔ)。