劉 勇, 王 斌, 金建琴, 陳思思

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市人民醫(yī)院， 湖北 十堰 442000)

作為惡性腫瘤，食管癌(esophageal cancer，EC)死亡率一直居于首位，對人們的生命健康造成了嚴重的威脅。EC早期癥狀不明顯，患者在就診時往往處于晚期，目前治療EC的主要手段是手術(shù)及術(shù)后化療藥物灌注，但患者的5年生存率僅有10%[1]，因此尋找新的治療靶點尤為迫切。長鏈非編碼RNA(long-chain noncoding RNA，Lnc RNA)是一類不編碼蛋白的RNA分子，長度介于200～100000 nt之間[2]。研究表明[3]，Lnc RNA在腫瘤細胞周期、腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移與化療耐藥等相關(guān)的信號通路方面均發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，其作用類似于癌基因或抑癌基因。Lnc RNA PCGEM1是一種在前列腺癌細胞中特異性高表達的Lnc RNA，并已證實可促進前列腺癌細胞的增殖和遷移。但目前關(guān)于PCGEM1在EC中的作用研究報道甚少，因此，本研究通過對EC組織和Eca-109細胞株的研究，探討PCGEM1在EC進展中的作用機制。

1 材料和方法

1.1組織標本：收集2016年3月至2018年5月于我院接受手術(shù)治療的62例EC患者癌組織及距離癌組織超過2cm處的正常組織，所有病例標本經(jīng)組織病理學(xué)檢測證實為原發(fā)性EC，其中腺癌32例，鱗癌30例?；颊吣挲g35～76歲，中位年齡55歲。所有患者均同意本研究并簽署知情同意書，且經(jīng)我院倫理委員會審核批準后收集標本。

1.2細胞及主要試劑和儀器:人正常食管上皮細胞HET-1A，人食管癌細胞株Eca-109、SHEEC1、Ec-9706、EC8712、TE-1均購自上海賽百慷生物技術(shù)股份有限公司。siPCGEM1及陰性對照siNC、miR-148a-minic及陰性對照NC-minic，PCGEM1及U6引物均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計完成。DMEM培養(yǎng)基(D777)；SYBR Green 熒光定量PCR 檢測試劑盒(QPK-201)于TOYOBO采購；Trizol reagent(9009)采購自TaKaRa；MTT試劑盒購自碧云天；Western blotting底物試劑盒及抗體購自北京百奧萊博科技有限公司。蘇凈Airtech超凈工作臺；SANYO MCO-15AC細胞培養(yǎng)箱；Nikon Ti-U/Ti-s倒置熒光顯微鏡；5810R 型高速離心機；Roche R480實時熒光定量PCR儀。

1.3細胞轉(zhuǎn)染:調(diào)整食管癌Eca-109細胞株濃度至1×106個/mL，取2mL接種于6孔板中，培養(yǎng)過夜，采用Lipofectamine 2000將濃度均為100 nmoL/L的siPCGEM1和陰性對照轉(zhuǎn)染至細胞，細胞分為：Eca-109-siPCGEM1組和Eca-109-siNC組，以Eca-109作為空白對照組。收集對數(shù)生長期的Eca-109-siPCGEM1細胞，采用上述方法轉(zhuǎn)染simiR-148a及陰性對照siNC-minic，并分為Eca-109-siPCGEM1+simiR-148a組和Eca-109-siPCGEM1+simiR-148a組。

1.4qRT-PCR檢測Lnc RNA PCGEM1的表達:采用Trizol法提取各組細胞總RNA并進行反轉(zhuǎn)錄，按照PrimeScrip反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用SYBR Premix Ex Taq說明書配置PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10min，然后95℃ 10s，60℃ 30s，72℃ 10s，40 個循環(huán)；95℃ 5s，60℃ 1min，95℃ 30s。U6作為內(nèi)參(上游引物為 5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物為 5'AACGCTTCACGAATTTGCGT-3')，Lnc RNA PCGEM1(上游引物為 5'-ACTGTCTCCCAACCCTTGTA-3'，下游引物為5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3')，miR-148a(上游引物為 5'-ACTGTCTCCCAACCCTTGTA-3'，下游引物為5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3')相對表達量用2-△△CT表示。每個樣本獨立重復(fù)實驗3 次。

1.5MTT及平板克隆實驗檢測細胞增殖:將各組細胞按照每孔500-1000 個密度鋪至96 孔板，輕輕混勻后，置入37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，每孔加MTT溶液20μl，37℃避光4h 后，棄掉孔內(nèi)液體，再加DMSO各100μl，置于37℃搖床上快速振蕩15min，以便充分溶解結(jié)晶物，最后將96 孔板置于酶標儀上檢測 492nm 處的OD值。將上述兩種穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞按每孔5×103個密度鋪6孔板繼續(xù)培養(yǎng)，隔周更換新鮮培養(yǎng)液，2周后用考馬斯亮藍染色，在顯微鏡下計數(shù)菌落形成數(shù)量。

1.6劃痕實驗檢測細胞遷移:將各組細胞E按5×105均勻鋪至6孔板，用10μl白槍頭劃線并以尺子輔助，加PBS將細胞碎片沖洗掉，然后加1%血清的培養(yǎng)基，置于顯微鏡下拍照并做好標記，此時記為0h，繼續(xù)于37℃、5%CO2溫箱培養(yǎng)，培養(yǎng)24h于倒置顯微鏡下觀察細胞運動情況并拍照。

1.7生物信息學(xué)預(yù)測:使用生物信息學(xué)網(wǎng)站StarBase預(yù)測PCGEM1可互補結(jié)合的微小RNA(microRNA，miRNA)，在根據(jù)Targetscan網(wǎng)站預(yù)測相應(yīng)miRNA可靶向結(jié)合的基因。

1.8Western blotting檢測:將轉(zhuǎn)染48h的Eca-109細胞，加入適量的RIPA裂解液，裂解30min，12 000/min 4℃離心10min，收集上清，采用ECA試劑盒檢測蛋白濃度，將蛋白樣品和Loading buffer混合，100℃水域變性5min，然后加入至制備好的SDS-PAGE凝膠(5%濃縮膠，10%分離膠)上樣孔中，每孔25μl，濃縮膠時調(diào)整電壓為60V，分離膠電壓為120V，結(jié)束后取出凝膠，4℃轉(zhuǎn)膜1.5h，采用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜2h，加入TGF-β2、Smad2一抗，4℃過夜，TBST洗膜后加入辣根過氧化物標記的羊抗兔IgG，37℃孕育2h后加入ECL顯影，采用自動凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，以GAPDH作為內(nèi)參，分析蛋白水平。

1.9統(tǒng)計學(xué)分析:用SPSS19.0對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以平均值±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩采用獨立樣本t檢驗進行分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1Lnc RNA PCGEM1在EC不同組織和細胞中的表達:qRT-PCR結(jié)果顯示，EC組織中 Lnc RNA PCGEM1的表達水平高于癌旁組織，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)； Lnc RNA PCGEM1在腫瘤細胞中的表達明顯高于人正常食管上皮細胞HFT-1A，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中在Eca-109細胞中表達量最高(P<0.01)，適合使用RNA干擾的方法進行后續(xù)Lnc RNA PCGEM1基因功能的研究，見圖1。

圖1 Lnc RNA PCGEM1在EC組織和不同EC細胞系中的表達(A：Lnc RNA PCGEM1在不同組織中的表達；B：Lnc RNA PCGEM1在不同EC細胞系中的表達，與HET-1A相比，*P<0.05，**P<0.01)

2.2細胞系構(gòu)建:qRT-PCR結(jié)果顯示空白對照組和陰性對照組Lnc RNA PCGEM1的表達無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，Eca-109-siPCGEM1組細胞中Lnc RNA PCGEM1的表達量明顯低于空白對照組和陰性對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示成功構(gòu)建PCGEM1沉默細胞系，見圖2。

圖2 Lnc RNA PCGEM1在各組Eca-109細胞中的表達

2.3Lnc RNA PCGEM1對EC細胞株Eca-109增殖能力的影響:平板克隆實驗結(jié)果顯示，沉默lnc RNA PCGEM1后，Eca-109-siPCGEM1細胞克隆數(shù)顯著減少(P<0.05)，空白對照組與Eca-109-siNC組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。說明Lnc RNA PCGEM1被沉默后，細胞增殖能力顯著降低，見圖3。

圖3 Lnc RNA PCGEM1對EC細胞株Eca-109增殖能力的影響(A：平板克隆實驗檢測細胞增殖；B：各組Eca-109細胞平板克隆結(jié)果)

2.4Lnc RNA PCGEM1對EC細胞株Eca-109遷移能力的影響:細胞劃痕實驗結(jié)果，相比空白對照組Eca-109和陰性對照組Eca-109-siNC，Eca-109-siPCGEM1組細胞運動能力減弱，細胞的創(chuàng)傷愈合速率降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明沉默lnc RNA PCGEM1后，細胞遷移能力明顯下降，見圖4。

圖4 Lnc RNA PCGEM1對EC細胞株Eca-109遷移能力的影響(A：劃痕實驗檢測細胞遷移能力；B：遷移細胞數(shù))

2.5生物信息學(xué)預(yù)測:采用StarBase網(wǎng)站預(yù)測結(jié)果顯示，Lnc RNA PCGEM1可與miR-148a互補結(jié)合，再經(jīng)Targetscan網(wǎng)站預(yù)測分析顯示，miR-148a與TGFβ2存在靶向結(jié)合位點，qRT-PCR結(jié)果顯示，Eca-109-siPCGEM1組中miR148的表達明顯高于空白對照組與Eca-109-siNC組(P<0.05)，見圖5。

圖5 生物信息學(xué)預(yù)測Lnc RNA PCGEM1與TGFβ2的關(guān)系(A：StarBase網(wǎng)站預(yù)測NEAT1與miR-148a互補結(jié)合位點；B：Targetscan預(yù)測miR-148a與TGFβ2靶向結(jié)合位點；C：miR-148a在不同細胞中的表達)

2.6下調(diào)miR-148a驗證Lnc RNA PCGEM1對Eca-109細胞的影響:Eca-109細胞沉默Lnc RNA PCGEM1后，再下調(diào)miR-148a觀察食管癌細胞增殖和遷移能力，siPCGEM1+simiR-148a組中miR-148a相對表達量明顯低siPCGEM1+siNC組(P<0.05)，提示沉默細胞系構(gòu)建成功；平板克隆實驗和劃痕實驗顯示，siPCGEM1+simiR-148a組細胞克隆數(shù)明顯增多，細胞運動能力增強(P均<0.05)，說明下調(diào)miR-148a可逆轉(zhuǎn)Lnc RNA PCGEM1沉默對Eca-109細胞的影響，見圖6。

圖6 下調(diào)miR-148a驗證Lnc RNA PCGEM1對Eca-109細胞的影響(A：不同細胞中miR-148a的表達；B：平板克隆實驗檢測細胞增殖；C：各組Eca-109細胞平板克隆結(jié)果；D：劃痕實驗檢測細胞遷移能力；E：遷移細胞數(shù))

2.7Lnc RNA PCGEM1與TGF β2/Smad 2的作用關(guān)系:Western blot檢測結(jié)果顯示Eca-109-siPCGEM1組中TGF β2及Smad 2的表達明顯低于空白對照組與陰性對照組(P<0.05)，空白對照組和陰性對照組中上述指標的表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示Lnc RNA PCGEM1對TGF β2/Smad 2通路蛋白表達的具有促進作用，見圖7。

圖7 Lnc RNA PCGEM1與TGF β2/Smad 2的作用關(guān)系(a：miR-148a在Eca-109細胞中的表達；b：Western blotting檢測TGF β2和p-Smad2在Eca-109細胞中的表達；c：TGF β2和p-Smad2在Eca-109細胞中相對表達量，與空白對照組相比，*P<0.05)

3 討 論

隨著人們飲食結(jié)構(gòu)和生活方式的改變，食管癌在多數(shù)國家的發(fā)病率均呈明顯上升趨勢。雖然近年來醫(yī)療技術(shù)取得飛速發(fā)展，但食管癌的發(fā)病、浸潤和轉(zhuǎn)移是由多種分子參與的復(fù)雜過程，已有的治療手段不能抑制腫瘤細胞的增殖，導(dǎo)致治療的失敗。因此從分子生物學(xué)角度出發(fā)尋找其進展和轉(zhuǎn)移的標志物，對于患者選擇合適的治療方法和預(yù)后指標的判定有著重要的意義。

目前關(guān)于Lnc RNA在腫瘤中的作用僅有一小部分被透徹研究，有些Lnc RNA在腫瘤中的表達異常改變，功能類似于癌基因或抑癌基因，可通過參與調(diào)控細胞周期，影響癌癥的發(fā)生發(fā)展[4]。目前，尚無標志性Lnc RNA可以直接預(yù)測EC，但Lnc RNA PCGEM1在前列腺癌中特異性表達已由Srikantan等證實，該基因位于染色體2q32位點上。Zhang等[5]采用RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)PCGEM1在結(jié)腸癌組織中的表達明顯高于癌旁組織。Chen等[6]人研究表明在胰腺癌患者癌組織和血清中，Lnc RNA PCGEM1的表達量上升。Lnc RNA PCGEM1在胰腺癌細胞分化過程中表達量顯著升高，而被沉默后，胰腺癌細胞的增殖能力減弱，并且增殖相關(guān)的基因亦表達量下降，由此推測Lnc RNA PCGEM1對胰腺癌細胞的增殖起到促進作用。本研究采用RT-PCR檢測其在EC組織和癌旁組織中的表達發(fā)現(xiàn)，在EC組織中表達水平明顯高于癌旁組織，提示Lnc RNA PCGEM1在EC的發(fā)生發(fā)展中可能起著重要作用。為了進一步研究Lnc RNA PCGEM1在EC中的作用，本研究構(gòu)建了PCGEM1沉默細胞系，結(jié)果顯示Lnc RNA PCGEM1下調(diào)后，EC癌細胞Eca-109的增殖能力和遷移能力明顯下降。

研究表明[7]，miRNA是通過堿基不完全互補的方式結(jié)合于靶基因上，從而影響腫瘤細胞的凋亡、遷徙與轉(zhuǎn)移，并引發(fā)周圍細胞的壞死與凋亡。同時miRNA也是Lnc RNA發(fā)揮作用的重要環(huán)節(jié)。本研究應(yīng)用StarBase數(shù)據(jù)庫，預(yù)測Lnc RNA PCGEM1可與miR-148a互補結(jié)合。李張維等[8]研究發(fā)現(xiàn)，miR-148a在食管癌組織中表達低于正常癌旁組織，上調(diào)miR-148a表達可抑制食管癌細胞的增殖和遷移，miR-148a作為癌基因?qū)κ彻馨┑倪M展發(fā)揮促進作用。本研究中，Eca-109細胞Lnc RNA PCGEM1沉默后，miR-148a表達上調(diào)，而下調(diào)miR-148a可逆轉(zhuǎn)Lnc RNA PCGEM1基因沉默后Eca-109細胞株的生物學(xué)行為，提示Lnc RNA PCGEM1促進EC細胞株Eca-109的增殖作用可能與下調(diào)miR-148a有關(guān)。根據(jù)Targetscan 網(wǎng)站預(yù)測顯示，miR-148a可互補結(jié)合TGF β2。本研究中，miR-148a表達上調(diào)后，TGFβ2蛋白的表達降低。TGF-β2/smad2 信號通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演了重要角色，該通路通過磷酸化轉(zhuǎn)錄因子Smad 蛋白，實現(xiàn)細胞內(nèi)通路信號的傳導(dǎo)[9]。Smad 蛋白包括 Smad1-Smad9，其中當 Smad2磷酸化水平受到抑制甚至沉默時，TGF-β2/Smad2信號通路的生物學(xué)功能發(fā)生轉(zhuǎn)變，對腫瘤細胞增殖和侵襲起到抑制作用[10]。在本次實驗中，我們發(fā)現(xiàn)過Eca-109-siPCGEM1組細胞中Smad2磷酸化水平明顯降低。王勁等發(fā)現(xiàn)[11]，下調(diào)Lnc RNA PCGEM1可調(diào)節(jié)TGF β2的表達從而抑制結(jié)直腸癌的侵襲及遷移。因此推斷，Lnc RNA PCGEM1可能通過調(diào)節(jié) TGF-β2/smad2 信號通路影響癌癥的進展。

綜上所述，Lnc RNA PCGEM1在食管癌中高表達，高表達Lnc RNA PCGEM1可能通過上調(diào)miR-148a水平，強化TGF β2/Smad2信號通路，從而促進EC的進展?？梢詫nc RNA PCGEM作為研究的新方向，為新型的生物藥品提供理論基礎(chǔ)。