盧山 唐波 詹建偉 陳子晞 徐遠(yuǎn)勝 王芳 吳錦鴻

西洛他唑（cilostazol，CLZ）是一種磷酸二酯酶Ⅲ抑制劑，可通過抑制血管內(nèi)環(huán)磷酸腺苷水平，起到抗血小板聚集作用[1]。已有證據(jù)表明，CLZ 可通過抑制細(xì)胞凋亡來保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，激活動脈平滑肌中鈣離子通道來誘導(dǎo)血管舒張從而影響腦血流量[2-5]。另有文獻(xiàn)報(bào)道長期持續(xù)口服CLZ 可改善腦梗死急性期后缺血半暗帶區(qū)域的腦血流量[6-8]，但是CLZ 對于腦梗死急性期腦血流量改善效果及作用機(jī)制鮮有報(bào)道。本資料通過在日本學(xué)習(xí)期間進(jìn)行了前期研究，即在構(gòu)建小鼠腦梗死模型并使用CLZ 進(jìn)行治療后觀測建模小鼠左側(cè)大腦關(guān)注區(qū)域（region of interest，ROI）及對側(cè)映射區(qū)域（以矢狀縫為中線分隔的對側(cè)鏡像區(qū)域）的腦血流量值并進(jìn)行對比分析，評估CLZ對于急性腦梗死后梗死區(qū)域腦血流量的改善效果；回國后進(jìn)一步檢測加入CLZ 培養(yǎng)的小鼠大腦由來血管內(nèi)皮細(xì)胞的磷酸化內(nèi)皮型一氧化氮合酶（phospho-endothelial nitric oxide synthase，p-eNOS）與內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）比值，評估CLZ是否具有促進(jìn)eNOS 活化的效果。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 （1）實(shí)驗(yàn)動物：8 周齡雄性Icr 小鼠12只，體重18.0～23.0（20.0±3.0）g，由日本Clea Japan Inc公司提供，置于日本兵庫醫(yī)科大學(xué)動物房飼養(yǎng)，12h 明暗周期循環(huán)，控制室溫為（21±2）℃。制備腦梗死模型后1 周內(nèi)予以粉狀飼料飼養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)取得日本兵庫醫(yī)科大學(xué)動物保護(hù)委員會批準(zhǔn)。（2）實(shí)驗(yàn)離體細(xì)胞培養(yǎng)：CRL-2299 系列小鼠大腦由來血管內(nèi)皮細(xì)胞由美國ATCC 公司提供。（3）藥物：CLZ，產(chǎn)品批號：190106P，50mg/粒，由浙江大冢制藥有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 藥物制備 為保證腹腔注射給藥劑量的穩(wěn)定性，將CLZ 粉碎后用羥乙基-β-環(huán)糊精（2-Hydroxypropylβ-cyclodextrin，HPβCD）制備成性質(zhì)較穩(wěn)定的懸濁液；為排除HPβCD 影響，使用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）作為溶劑制備PBS 懸濁液。

1.2.2 小鼠腦梗死模型建立、分組及給藥 12 只小鼠均使用3%異氟烷誘導(dǎo)全身麻醉及1.5%異氟烷維持麻醉，以右側(cè)臥位固定，暴露左側(cè)顳部，消毒后于左耳外耳道至左眼連線中點(diǎn)處剪開皮膚，鈍性分離靜脈、唾液腺及肌肉，并電凝阻斷手術(shù)視野內(nèi)所見血管。分離相關(guān)組織至左側(cè)顴骨顴弓區(qū)，剪斷顴骨，繼續(xù)分離肌肉及相關(guān)組織至顱底，在嗅索區(qū)域使用骨鉆去除顱骨，分離已暴露的硬腦膜，充分暴露左側(cè)大腦中動脈，在近嗅索區(qū)使用雙極電凝器阻斷左側(cè)大腦中動脈，并用顯微剪剪斷已電凝阻斷部位的殘余血管以確保血管阻斷。于手術(shù)區(qū)域加入動物用抗生素，將之前鈍性分離的組織復(fù)位，縫合皮膚。術(shù)后將小鼠放入恒溫箱內(nèi)觀察，待完全脫離麻醉狀態(tài)后繼續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)。手術(shù)過程中將小鼠體溫控制于（37.0±0.2）℃。建模成功后，小鼠左側(cè)大腦即出現(xiàn)局限于大腦皮層的腦梗死病灶。建模手術(shù)完成后30min，待腦梗死區(qū)域范圍穩(wěn)定后, 將其分為CLZ 組、PBS 組和HPβCD 組,每組4 只，分別腹腔注射50μl 的0.5%CLZ懸濁液，50μl PBS 及50μl HPβCD 溶液。

1.2.3 腦血流量測定及比較 本實(shí)驗(yàn)所行小鼠腦血流量測定及比較均在日本兵庫醫(yī)科大學(xué)先端醫(yī)學(xué)研究所神經(jīng)再生研究部門完成。使用日本Omegazone 公司OZ-2 的激光多普勒腦血流儀進(jìn)行腦血流量測定[9]。以780nm 半導(dǎo)體激光光束測量左側(cè)ROI（簡稱為L）及對側(cè)映射區(qū)域（簡稱為R）的腦血流量，由儀器讀取數(shù)值。L 測量區(qū)域設(shè)定為前囟左側(cè)2mm 偏背側(cè)1mm 范圍，包括部分梗死區(qū)及部分缺血半暗帶區(qū)域。于0min 及用藥后10、20、30 及60min 測量腦梗死模型建立后及用藥后L 及R 區(qū)域腦血流量，并比較上述各時(shí)點(diǎn)L 區(qū)域與R 區(qū)域的比值（L/R 比值）。腦血流量圖像中暖色調(diào)區(qū)域表明腦血量增加值較高，冷色調(diào)區(qū)域表明腦血量增加值較低。

1.2.4 小鼠大腦由來血管內(nèi)皮細(xì)包eNOS 含量測定 采用Western blot 檢測。將CLZ（10μg/L）和等量HPβCD、PBS 分別加入培養(yǎng)液中對小鼠大腦由來血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，6d 后用10% SDS 凝膠電泳分離。采用英國Abcam 公司的eNOS 抗體測定eNOS 總量（t-eNOS），采用美國Cell Signaling Technology 公司的p-eNOS 抗體測量p-eNOS 抗體濃度，β-actin 含量作為檢測樣本含量參照。使用image J 軟件，分析各組蛋白電泳條帶teNOS、p-eNOS 及β-actin 的灰度值，在β-actin 灰度值進(jìn)行統(tǒng)一化后換算，計(jì)算p-eNOS 與t-eNOS 灰度值比值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以比較，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.13 組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)的腦血流量圖像比較 見圖1（插頁）。

由圖1A 可見，CLZ 組小鼠在注射藥物后半暗帶區(qū)域腦血流量較其他兩組小鼠有所增加，暖色調(diào)區(qū)域較其他兩組面積大。由圖1B 可見，ROI 區(qū)域腦血流量較對側(cè)映射區(qū)域明顯下降。

2.23 組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)的L/R 比值比較 見表1。

由表1 可見，3 組小鼠在注射后10min 時(shí)L/R 比值，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。CLZ 組小鼠注射后20、30、60min 時(shí)的L/R 比值均高于PBS 組，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。CLZ 組小鼠注射后20min、30min 時(shí)的L/R 比值高于HPβCD 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。CLZ 組小鼠注射后20、30 及60min 時(shí)的L/R 比值均高于注射前（0min），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

表13 組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)的L/R 比值比較

2.3 小鼠大腦由來血管內(nèi)皮細(xì)胞的p-eNOS 及t-eNOS 含量比較 見圖2。

圖2 小鼠大腦由來血管內(nèi)皮細(xì)胞p-eNOS 及t-eNOS 含量比較（a：3 組小鼠大腦由來血管內(nèi)皮細(xì)胞的p-eNOS 及t-eNOS 電泳圖；b：3 組小鼠大腦由來血管內(nèi)皮細(xì)胞p-eNOS 與t-eNOS 灰度值比值比較）

由圖2 可見，加入CLZ 培養(yǎng)6d 后的小鼠大腦由來血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)p-eNOS 與t-eNOS 比值（0.673±0.074）大于PBS 組（0.425±0.093）和HPβCD 組（0.438±0.062），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

3 討論

CLZ 已在臨床用于腦梗死二級預(yù)防[10]。CLZ 為非水溶性物質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)選用腹腔注射法以保證給藥劑量恒定性，因此本研究使用將CLZ 納米顆粒加入HPβCD 中制備懸濁液[11]，并使用CLZ 懸濁液進(jìn)行腹腔注射給藥。

本研究通過腦血流量測定發(fā)現(xiàn)，CLZ 組小鼠ROI區(qū)域及對側(cè)映射區(qū)域腦血流量比值在注射后20～30min 時(shí)較注射前有明顯增加，而CLZ 組、100μl CLZ、PBS 組及HPβCD 組相關(guān)腦血流量比值在注射后無明顯改變。ROI 為腦梗死模型建模側(cè)區(qū)域，其對側(cè)映射區(qū)域?yàn)榻Ｐ∈鬅o腦梗死發(fā)生大腦半球區(qū)域，L/R 比值增加可以認(rèn)為是在CLZ 給藥后，ROI 腦血流量較對側(cè)映射區(qū)域腦血流量有更強(qiáng)的改善效果，因此可以認(rèn)為在Icr 小鼠腦梗死急性期使用適量CLZ 進(jìn)行治療，可顯著增加半暗帶區(qū)域腦血流量。這與既往相關(guān)研究報(bào)道CLZ 可改善機(jī)體組織缺血區(qū)域血流量[12-13]，減少缺血后的組織損傷結(jié)論相符[14-15]。

通過免疫印跡試驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)，在樣本量相同的情況下，添加CLZ 培養(yǎng)的小鼠大腦由來血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的p-eNOS 與t-eNOS 比值表達(dá)較PBS 組、HPβCD 組有明顯增加。因此我們認(rèn)為，CLZ 可能是通過調(diào)節(jié)腦梗死區(qū)域p-eNOS 活性，使腦梗死區(qū)域內(nèi)一氧化氮濃度增加，促進(jìn)局部血管擴(kuò)張，最終達(dá)到改善腦梗死區(qū)域腦血流量的目的。這與相關(guān)報(bào)道的eNOS 具備促進(jìn)組織產(chǎn)生一氧化氮達(dá)到血管擴(kuò)張效果結(jié)論相符[7，14]。

本研究所選用的L-MCAO 模型為局部微創(chuàng)手術(shù)。具備制備簡便，術(shù)后小鼠死亡率極低，長期存活率高，腦梗死模型病灶范圍、體積占病變側(cè)大腦總體積比例恒定等特點(diǎn)[5，9，15]。

本研究認(rèn)為，CLZ 可通過激活eNOS 有效活性成分途徑，達(dá)到改善腦梗死局部區(qū)域腦血流量效果，但尚未檢測ROI 區(qū)域微小血管是否有增生，且未對CLZ 是否具有促進(jìn)小鼠大腦由來血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力進(jìn)行評估。已有相關(guān)報(bào)道CLZ 可能通過上調(diào)血管緊張素Ⅱ及血管內(nèi)皮生長因子等途徑促血管生成因子的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)缺血區(qū)域血管新生[16-18]，相較于阿司匹林有改善血管相關(guān)細(xì)胞功能減少腦出血的能力[19-20]。eNOS 也可能具備促進(jìn)微血管新生[21]以及改善內(nèi)源性神經(jīng)細(xì)胞功能的作用[22]，后續(xù)也將對CLZ 是否具有促進(jìn)小鼠大腦缺血區(qū)域血管新生能力以及改善大腦缺血區(qū)域內(nèi)的血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞活性能力繼續(xù)進(jìn)行探討。

綜上所述，CLZ 在腦梗死急性期可以通過激活eNOS 活性成分途徑，起到改善腦梗死區(qū)域腦血流量效果,為腦梗死后缺血區(qū)域受損組織修復(fù)提供必要條件。