王瑤，張敏，馬曉沖，劉星，柴艷兵*，張耀廣，李飛，李興佳

（君樂寶乳業(yè)集團質(zhì)量管理中心，河北石家莊050021）

維生素K2，亦稱甲萘醌，是自然界中VK的主要存在形式之一[1-2]。VK2通過激活r-谷氨酸羧化酶促進VK依賴性蛋白前體谷氨酸殘基（Glu）羧化為r-羧基谷氨酸（Gla），使蛋白質(zhì)發(fā)揮生物活性功能，對改善骨密度、促進骨細胞生長、調(diào)節(jié)T細胞、防止血管硬化和止血等有重要作用[3-6]，是人體不可缺少的重要維生素之一。研究表明，母乳喂養(yǎng)的嬰兒具有有限的VK來源，因為母體通過胎盤傳輸給嬰兒的VK較少且在人乳中以非常低的含量（（5.170±1.521） μg/L）存在[7]，孕婦及嬰幼兒已經(jīng)成為VK嚴重缺乏人群[8]。VK2是唯一具有生物活性的VK，VK1、VK3只有在肝臟中轉(zhuǎn)化為VK2后才能和胃腸微生物產(chǎn)生的VK2一起被人體吸收利用[9]。因此，VK2得到越來越多國內(nèi)外研究者的關(guān)注。目前，在乳粉中廣泛添加VK1，補充人體VK攝入的不足。但隨著對VK2研究的深入，一些企業(yè)推出添加VK2的乳粉產(chǎn)品，得到國家高度重視。目前我國尚未有乳粉中VK2的國家檢測標準，因此需建立VK2的測定方法，以保障乳粉產(chǎn)品質(zhì)量。

目前，VK2的檢測方法主要有液相色譜法[10-13]、毛細管電泳法[14]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[15-16]等。七烯甲萘醌（menaquinone-7，MK-7）是VK2的一個類型，即VK2側(cè)鏈上含有7 個異戊二烯單元，是一種脂溶性維生素[17]。所有VK的結(jié)構(gòu)相似，但側(cè)鏈長度不同。側(cè)鏈越長，人體吸收性越好、生物活性越高[18]。因此，長鏈的甲萘醌（特別是MK-7）是最優(yōu)質(zhì)的，因為它們能幾乎完全被人體吸收。本研究建立一種采用高效液相色譜法測定乳粉中MK-7含量的方法，為乳粉質(zhì)量管控提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

含VK2乳粉君樂寶乳業(yè)有限公司。

MK-7標準品（純度大于98%）日本富士和光純藥公司；甲醇（色譜級）德國默克公司；異丙醇、正己烷（均為色譜級）中國迪馬科技有限公司；無水乙醇（色譜級）天津福晨化學(xué)試劑有限公司；碳酸鉀（分析純）天津永大化學(xué)試劑廠；脂肪酶（酶活力≥700 U/mg）美國Sigma公司；實驗用水均為超純水（18.0 MΩ·cm）。

1.2 儀器與設(shè)備

1260高效液相色譜儀（配備熒光檢測器）美國安捷倫公司；Milli-Q ZMQS50001超純水機 美國密理博公司；LYNX4000高速落地離心機賽默飛世爾科技（中國）有限公司；ME203E/02電子分析天平瑞士梅特勒-托利多公司；RE311旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀重慶雅馬拓有限公司；DKZ-ZB恒溫水浴振蕩器上海一恒科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液配制

MK-7標準儲備液（1 mg/mL）：稱取MK-7 10 mg（精確至0.1 mg），置于10 mL棕色容量瓶中，用2 mL異丙醇溶解并用甲醇定容，搖勻，制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的標準儲備液，于4 ℃避光保存，使用期限6 個月。

MK-7標準中間溶液（10.0 μg/mL）：準確吸取100 μL 1 mg/mL的MK-7標準儲備液，置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，于4 ℃避光保存，使用期限3 個月。

MK-7標準工作溶液：分別準確吸取0、20、50、80、100、150 μL 10.0 μg/mL MK-7標準中間溶液，用甲醇-異丙醇（4∶1，V/V）溶液定容至1 mL，配制成質(zhì)量濃度分別為0、0.2、0.5、0.8、1.0、1.5 μg/mL的標準工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.2 樣品前處理

稱取混合均勻的固體試樣2 g（精確到0.01 g）于離心管中，用10 mL溫水溶解；向上述試樣溶液中加入一定量脂肪酶，于（37±5） ℃恒溫水浴振蕩器中振蕩，使其充分酶解；取出酶解好的試樣，依次加入5 mL無水乙醇和一定量碳酸鉀，充分混勻；加入20 mL提取溶劑，充分振搖后5 000 r/min離心5 min，取出上層清液，置于另一離心管中，再加入10 mL提取溶劑重復(fù)操作1 次，合并上清液；在離心管中加入5 mL超純水清洗上清液，取出上層清液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上于（40±2） ℃條件下蒸發(fā)至干；準確加入1 mL甲醇-異丙醇（4∶1，V/V）溶液復(fù)溶，充分振蕩溶解殘留物，過0.22 μm有機濾膜后上機檢測。

對脂肪酶添加量、酶解時間、碳酸鉀添加量及提取溶劑進行優(yōu)化。

1.3.2.1 脂肪酶添加量與酶解時間優(yōu)化

乳粉中脂質(zhì)豐富，MK-7是脂溶性維生素，因此前處理時加入脂肪酶降解試樣中的脂肪和不飽和脂肪酸是必要的。脂肪酶添加量及振蕩酶解時間均會影響MK-7的提取，以MK-7加標回收率為指標對脂肪酶添加量（0、250、500、750 mg/g）與酶解時間（1、2、4、6、12 h）進行優(yōu)化。MK-7加標回收率按式（1）計算。

式中：C1為試樣中MK-7含量/（μg/100 g）；C2為MK-7添加量/（μg/100 g）。

1.3.2.2 碳酸鉀添加量優(yōu)化

皂化反應(yīng)指堿和酯反應(yīng)生成醇和羧酸鹽的反應(yīng)。乳粉經(jīng)過皂化反應(yīng)，酶解后的脂肪生成脂肪酸鹽溶解于水相中，與VK2分離[19]，但VK2對堿敏感[20]，堿的添加量會影響VK2的回收率。以MK-7加標回收率為指標對碳酸鉀添加量進行優(yōu)化。

1.3.2.3 提取溶劑優(yōu)化

VK2在丙酮、正己烷和甲醇中均可溶解。以MK-7加標回收率為指標對3 種提取溶劑進行優(yōu)化。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）或具有同等性能的色譜柱；還原柱（4.0 mm×15 mm）；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進樣體積10 μL；運行時間30 min；檢測波長：激發(fā)波長243 nm，發(fā)射波長430 nm；流動相：甲醇-異丙醇（4∶1，V/V）。

1.3.4 MK-7含量計算

試樣中MK-7的含量按式（2）計算。

式中：C為試樣中MK-7的含量/（μg/100 g）；ρ為試樣溶液中MK-7的質(zhì)量濃度/（μg/mL）；V為復(fù)溶殘余物的定容體積/mL；m為試樣質(zhì)量/g；100為換算系數(shù)。

1.3.5 靈敏度、準確度和精密度考察

向空白樣品中添加適量MK-7標準溶液，經(jīng)上述方法測定，測定色譜峰信噪比（RS/N），RS/N＞3對應(yīng)的MK-7含量為方法檢出限，RS/N＞10對應(yīng)的MK-7含量為方法定量限。

選擇不含MK-7的樣品，分別添加5、10、25 μg/100 g的MK-7，每個添加量6 個平行試樣，按優(yōu)化后的方法提取和測定，計算加標回收率，考察方法準確度；計算相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），考察方法精密度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Origin 9.0軟件進行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理條件優(yōu)化

2.1.1 酶解條件選擇

圖1 脂肪酶添加量對MK-7加標回收率的影響Fig. 1Effect of lipase addition on recovery of MK-7

由圖1可知，樣品前處理不添加脂肪酶時，MK-7加標回收率僅為1.26%；而脂肪酶添加量為250 mg/g時，加標回收率可達87.66%，因此前處理時加入脂肪酶是必要的。脂肪酶添加量為250、500、750 mg/g時，MK-7加標回收率分別為87.66%、81.05%、86.61%，相差不大。綜合考慮經(jīng)濟效益后確定脂肪酶添加量為250 mg/g。

由圖2可知：酶解1 h時MK-7加標回收率為45.01%，酶解12 h時MK-7加標回收率為74.93%，均明顯低于其他酶解時間；酶解時間為2、4、6 h時，MK-7加標回收率分別為87.66%、81.70%、88.40%，相差不大，而酶解12 h會大大降低檢測效率，因此，綜合考慮選擇酶解時間為2 h。

圖2 酶解時間對MK-7加標回收率的影響Fig. 2Effect of hydrolysis time on recovery of MK-7

2.1.2 皂化條件選擇

圖3 碳酸鉀添加量對MK-7加標回收率的影響Fig. 3 Effect of potassium carbonate on recovery of MK-7

由圖3可知：碳酸鉀添加量為250 mg/g時，MK-7加標回收率偏低，為78.10%，可能是由于皂化不完全；碳酸鉀添加量為500 mg/g時，MK-7加標回收率最高，為87.66%；再增加碳酸鉀添加量時，MK-7加標回收率開始逐漸降低。因此選擇碳酸鉀添加量為500 mg/g。

2.1.3 提取溶劑選擇

圖4 提取溶劑對MK-7加標回收率的影響Fig. 4 Effect of extraction solvents on recovery of MK-7

由圖4可知：甲醇作為提取溶劑時，MK-7加標回收率僅為0.31%，不適合提取乳粉中的MK-7；丙酮作為提取溶劑時，MK-7加標回收率為79.91%，略低于正己烷作為提取溶劑時的加標回收率（87.76%），因此選擇正己烷作為提取溶劑。

2.2 分離度測定結(jié)果

VK的不飽和酮結(jié)構(gòu)共軛體系較小，不能產(chǎn)生熒光，但能通過衍生使VK同系物母核萘醌環(huán)產(chǎn)生熒光[21]。VK在分離色譜柱之后經(jīng)過還原色譜柱被還原，對還原型VK使用熒光檢測器進行檢測。

圖5 MK-7標準溶液（1.5 μg/mL）及樣品高效液相色譜圖Fig. 5 Chromatograms of MK-7 standard solution (1.5 μg/mL) and samples

由圖5可知，MK-7峰與相鄰峰有較好的分離度，容易辨識。

2.3 標準曲線繪制

對質(zhì)量濃度分別為0.0、0.2、0.5、0.8、1.0、1.5 μg/mL的MK-7標準工作溶液進行上機檢測，以目標峰面積為縱坐標，以MK-7標準工作溶液質(zhì)量濃度為橫坐標，建立標準曲線方程。結(jié)果表明，在MK-7標準工作溶液質(zhì)量濃度0.0～1.5 μg/mL范圍內(nèi)，標準曲線方程為y=229.430x-0.894（R2=0.999 95），線性關(guān)系良好。

2.4 方法的靈敏度、準確度和精密度

當稱樣量為2.0 g、定容體積為1 mL時，MK-7的檢出限為0.15 μg/100 g，定量限為0.5 μg/100 g。

表1 乳粉樣品中MK-7的加標回收率（n=6）Table 1Recoveries and precision of MK-7 from spiked milk powder samples ( n= 6)

由表1可知，空白乳粉中添加5、10、25 μg/100 g MK-7時的平均回收率為87.9%～94.3%，表明方法準確度良好。RSD為0.9%～6.4%，表明方法精密度較高。

3 結(jié)論

對乳粉中MK-7提取的酶解條件、皂化條件和提取溶劑進行優(yōu)化，選取最優(yōu)提取方法，采用高效液相色譜外標法定量測定乳粉中MK-7含量，方法前處理過程簡單、靈敏度高、檢測效率高、簡單快捷，可滿足乳粉中VK2含量的檢測要求。