羅天淇，蔡淼，王世杰，朱宏，楊貞耐,*

（1.北京工商大學(xué)，北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類(lèi)健康高精尖創(chuàng)新中心，北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京100048；2.石家莊君樂(lè)寶乳業(yè)有限公司，河北石家莊050221）

作為牛乳的重要組分，乳脂不僅對(duì)牛乳的物理特性（色澤、透明度等）、結(jié)構(gòu)特性（質(zhì)地、黏稠度）、傳熱性和非感官效果（飽腹感）起關(guān)鍵作用，而且是牛乳中重要的風(fēng)味物質(zhì)前體[1-3]。正常情況下牛乳中的脂肪酸絕大部分都以甘油三酯的形式存在，沒(méi)有氣味，但是熱處理和乳酸菌發(fā)酵會(huì)加快乳脂降解，以醛類(lèi)、酮類(lèi)為主的脂質(zhì)降解產(chǎn)物會(huì)增強(qiáng)來(lái)自乳脂的風(fēng)味，對(duì)牛乳風(fēng)味有較大影響，甚至使牛乳帶有不新鮮甚至腐臭的氣味[4-5]。

同時(shí)，乳脂還是牛乳中風(fēng)味物質(zhì)的重要載體及釋放調(diào)節(jié)物質(zhì)[6]。牛乳中風(fēng)味物質(zhì)的釋放主要受化合物揮發(fā)性（熱力學(xué)因素）和從乳液到氣相的傳質(zhì)阻力（動(dòng)力學(xué)因素）2 個(gè)因素的控制[7]。熱力學(xué)因素決定風(fēng)味物質(zhì)在平衡狀態(tài)下在基質(zhì)中的保留或分配，而動(dòng)力學(xué)因素影響風(fēng)味物質(zhì)在食物中的釋放速率。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，牛乳中風(fēng)味化合物的釋放包括在油相、油水界面、水相及頂空4 部分之間的分配和傳質(zhì)。由于牛乳中揮發(fā)性風(fēng)味化合物或多或少地分布在脂肪相中，其釋放主要取決于化合物的疏水性強(qiáng)弱及脂肪含量，對(duì)于親脂物質(zhì)，脂肪含量的變化會(huì)改變這些化合物的釋放速率和頂空濃度，影響食用時(shí)的感知效果[8-9]。

目前相關(guān)研究大多集中于乳脂對(duì)發(fā)酵乳感官特性及與某些風(fēng)味物質(zhì)相互作用的影響，而對(duì)發(fā)酵乳整體風(fēng)味組成與含量變化的影響報(bào)道極少。本研究通過(guò)制備不同乳脂含量的牛乳進(jìn)行發(fā)酵，系統(tǒng)研究比較乳脂含量引起的發(fā)酵乳風(fēng)味差異，探討這些差異的來(lái)源，為進(jìn)一步了解乳脂在發(fā)酵乳風(fēng)味形成中的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮牛乳北京三元食品股份有限公司；發(fā)酵劑YO-MIX 300 LYO（保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌）丹麥Danisco公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Nova-Safety蓋勃離心機(jī) 德國(guó)Gerebe公司；FT1乳成分分析儀丹麥Foss公司；MLS-3781L-PC高壓蒸汽滅菌鍋日本Sanyo公司；DHP-9032電熱恒溫培養(yǎng)箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司；iCinac乳品發(fā)酵監(jiān)控儀法國(guó)AMS Alliance公司；Rheolaser Master光學(xué)微流變儀法國(guó)Formulaction公司；7890A-7000氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀美國(guó)Agilent公司；CT3質(zhì)構(gòu)儀美國(guó)Brook field公司。

1.3 方法

1.3.1 不同乳脂含量發(fā)酵乳的制備

使用離心機(jī)離心（60 ℃，4 000 r/min、15 min）鮮牛乳得到乳脂，將乳脂加入鮮牛乳中復(fù)配，并使用乳成分分析儀測(cè)定組分，使牛乳中乳脂含量分別為3.7%、3.9%、4.1%、4.3%、4.5%，其余組分含量相同；將不同乳脂含量的牛乳在65 ℃條件下殺菌30 min，冷卻至室溫，加入商業(yè)發(fā)酵劑YO-MIX 300 LYO，42 ℃發(fā)酵4 h后冷卻，置于4 ℃后熟24 h后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測(cè)定。

1.3.2 發(fā)酵乳pH值及氧化還原電位測(cè)定

采用iCinac乳品發(fā)酵監(jiān)控儀對(duì)發(fā)酵過(guò)程中牛乳的pH值和氧化還原電位進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，每1 min記錄1 次。

1.3.3 發(fā)酵乳微流變性質(zhì)測(cè)定

取20 mL發(fā)酵乳至微流變儀專(zhuān)用樣品池中，將樣品池插入微流變儀，運(yùn)行測(cè)試程序，測(cè)定發(fā)酵乳在1 Hz下的彈性模量（G’）和黏性模量（G’）。

參考龐志花等[10]的方法，使用質(zhì)構(gòu)儀進(jìn)行質(zhì)地剖面分析（texture pro file analysis，TPA）。選用圓柱形TA10探頭，目標(biāo)值10.0 mm，觸發(fā)點(diǎn)負(fù)載5.0 g，測(cè)試速率0.5 mm/s。

1.3.4 發(fā)酵乳揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測(cè)定

固相微萃取（solid phase micro-extraction，SPME）法提取揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)：萃取前將SPME纖維置于GC-MS儀進(jìn)樣口老化；取10 g發(fā)酵乳樣品和1 μL內(nèi)標(biāo)物2-甲基-3-庚酮于30 mL萃取瓶中，內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度為0.816 μg/μL，加蓋密封，40 ℃恒溫水浴平衡30 min后，將SPME纖維通過(guò)瓶蓋插入樣品瓶中的頂空部分，推出纖維，頂空吸附30 min后拔出；快速插入GC-MS儀進(jìn)樣口解吸5 min，進(jìn)行GC-MS分析。

GC條件：采用DB-wax色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）進(jìn)行分析。升溫程序：起始柱溫40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升溫至200 ℃，以10 ℃/min升溫至230 ℃，保持3 min，載氣為氦氣，流速1.2 mL/min，不分流進(jìn)樣。

MS條件：電子轟擊離子源，電子能量70 eV，傳輸線溫度280 ℃，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，質(zhì)量掃描范圍40～250（m/z）。

定性分析：化合物通過(guò)NIST 14質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行質(zhì)譜定性，通過(guò)比較實(shí)際保留指數(shù)（retention index，RI）與文獻(xiàn)報(bào)道RI進(jìn)行定性，差值小于50認(rèn)為是同一物質(zhì)。文獻(xiàn)報(bào)道RI通過(guò)NIST Chemistry WebBook網(wǎng)站（https://webbook.nist.gov/chemistry/cas-ser/）查詢(xún)，實(shí)際RI在分析樣品中添加C9～C26正構(gòu)烷烴內(nèi)標(biāo)物后，根據(jù)式（1）計(jì)算。

式中：n和n+1分別為未知物流出前、后正構(gòu)烷烴的碳原子數(shù)；t’（i）為待測(cè)組分的調(diào)整保留時(shí)間（t’（n）＜t’（i）＜t’（n+1））；t’（n）和t’（n+1）分別為具有n和n+1個(gè)碳原子正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間。

定量分析：使用2-甲基-3庚酮為內(nèi)標(biāo)物，采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析，各揮發(fā)性成分含量按式（2）計(jì)算。

式中：Ci為未知物含量/（ng/g）；S未、S內(nèi)分別為未知物、內(nèi)標(biāo)物的峰面積；ρ內(nèi)為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度/（μg/μL）；V內(nèi)為內(nèi)標(biāo)物添加體積/μL；m為樣品質(zhì)量/g。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)樣品至少測(cè)定3 次，使用OriginPro 2017軟件作圖，風(fēng)味物質(zhì)用NIST 14譜庫(kù)檢索，并應(yīng)用Canoco 4.5統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行相關(guān)性分析。風(fēng)味化合物的油水分配系數(shù)lgP通過(guò)ChemSpider網(wǎng)站（http://www.chemspider.com）查詢(xún)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同乳脂含量牛乳發(fā)酵過(guò)程中pH值的變化

圖1 不同乳脂含量牛乳發(fā)酵過(guò)程中pH值的變化Fig. 1Changes in pH value of fermented milk during fermentation

由圖1可知，不同乳脂含量牛乳發(fā)酵時(shí)的pH值曲線變化趨勢(shì)相同，呈先下降后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)，并且整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中各組樣品的pH值均無(wú)明顯差異。由于牛乳發(fā)酵過(guò)程中的pH值變化是乳酸菌代謝乳糖產(chǎn)生乳酸引起的，因此不同樣品間乳脂含量的差異不會(huì)影響乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)酸。

2.2 不同乳脂含量發(fā)酵乳的流變和質(zhì)構(gòu)特性

流變和質(zhì)構(gòu)特性是反映發(fā)酵乳結(jié)構(gòu)特征的重要指標(biāo)，G’和G”分別用于描述樣品的類(lèi)固體（彈性）特征和類(lèi)流體（黏性）特征。

表1 發(fā)酵乳的流變及質(zhì)構(gòu)特性Table 1 Rheological and textural properties of fermented milk

由表1可知，所有發(fā)酵乳的G’均大于G”，表明發(fā)酵乳中彈性成分占優(yōu)勢(shì)，樣品表現(xiàn)出類(lèi)固體的特征[11]。隨著乳脂含量的增加，發(fā)酵乳的G’、G”均顯著降低（P＜0.05）；而質(zhì)構(gòu)特性方面，發(fā)酵乳硬度、內(nèi)聚性變化較小，膠著性顯著增加（P＜0.05）。

2.3 不同乳脂含量發(fā)酵乳風(fēng)味物質(zhì)分析

2.3.1 不同乳脂含量發(fā)酵乳的風(fēng)味物質(zhì)組成

表2 發(fā)酵乳揮發(fā)性組分的定性及定量分析結(jié)果Table 2 Qualitative and quantitative analysis results of volatiles in fermented milk ng/g

由表2可知，經(jīng)過(guò)SPME萃取，GC-MS檢測(cè)分析后，從5 組發(fā)酵乳中共檢出揮發(fā)性物質(zhì)34 種，包括烴類(lèi)6 種、醇類(lèi)1 種、醛類(lèi)4 種、酮類(lèi)6 種、酯類(lèi)2 種、酸類(lèi)9 種、其他化合物6 種。酸類(lèi)物質(zhì)的含量在各組樣品中均為最高，隨著乳脂含量的增加，酸類(lèi)物質(zhì)含量先上升后下降，酮類(lèi)物質(zhì)含量先上升后趨于穩(wěn)定，醛類(lèi)、酯類(lèi)及其他化合物含量呈下降趨勢(shì)。整體上，乳脂含量的變化對(duì)發(fā)酵乳中風(fēng)味物質(zhì)含量影響較大，而對(duì)風(fēng)味物質(zhì)種類(lèi)影響較小。

上述風(fēng)味物質(zhì)中，烴類(lèi)物質(zhì)大多來(lái)源于原料乳本身，對(duì)發(fā)酵乳風(fēng)味的貢獻(xiàn)較小。醛類(lèi)是發(fā)酵乳制品中一類(lèi)重要的風(fēng)味物質(zhì)，其風(fēng)味閾值一般很低[12]，己醛能賦予乳制品新鮮味和青草味，而壬醛具有花香、柑橘及脂肪香氣[13]，是巴氏殺菌乳中的主要風(fēng)味物質(zhì)[14]。酮類(lèi)化合物可以由多種途徑生成，隨著碳鏈的增長(zhǎng)香氣更加濃郁，其中2,3-丁二酮、3-羥基-2-丁酮是發(fā)酵乳中的重要風(fēng)味物質(zhì)[15]，是奶油味的重要來(lái)源[16]，其含量隨著乳脂含量的增加先增加后趨于穩(wěn)定。揮發(fā)性有機(jī)酸是發(fā)酵乳中含量最高的一類(lèi)風(fēng)味物質(zhì)，在發(fā)酵乳中主要在脂肪酶的作用下將脂肪水解而形成[17]，具有清爽的口感和乳香味。

2.3.2 發(fā)酵乳風(fēng)味物質(zhì)組成的主成分分析

圖2 發(fā)酵乳風(fēng)味物質(zhì)組成的主成分分析Fig. 2 Principal component analysis of flavor compounds of fermented milk

為明確乳脂含量變化對(duì)發(fā)酵乳整體風(fēng)味特征的影響，利用主成分分析考察揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量隨乳脂含量變化的趨勢(shì)。由圖2可知，主成分1和主成分2的貢獻(xiàn)率分別為81.7%和11.6%，可以很好地解釋乳脂含量與發(fā)酵乳揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量之間的關(guān)系。34 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)在圖中的分布可以分為2 類(lèi)，一類(lèi)介于乳脂含量3.7%和3.9%兩組樣品之間，一類(lèi)介于乳脂含量4.1%和4.3%兩組樣品之間，說(shuō)明隨著乳脂含量的增加，一部分風(fēng)味物質(zhì)含量隨之減小，而另一部分風(fēng)味物質(zhì)含量先增加，乳脂含量在4.1%和4.3%之間達(dá)到最大值，隨后減小。

2.3.3 乳脂含量與風(fēng)味物質(zhì)變化相關(guān)性分析

Brauss等[3]研究表明，乳脂是一種重要的風(fēng)味溶劑和風(fēng)味成分，風(fēng)味化合物疏水性的不同會(huì)影響它們?cè)诟飨嚅g的分配系數(shù)。一般認(rèn)為，親水性化合物在食物內(nèi)部及外部空氣中的分布釋放與脂肪含量無(wú)關(guān)，而增加脂肪含量將顯著降低頂部空間中疏水性化合物的含量。因此，結(jié)合風(fēng)味化合物的親水性和親脂性進(jìn)一步研究乳脂含量對(duì)發(fā)酵乳中風(fēng)味化合物的影響機(jī)理。

由表2中的lgP（lgP＞0為親脂性化合物，lgP＜0為親水性化合物）可知，34 種物質(zhì)中有7 種親水性化合物、27 種親脂性化合物，說(shuō)明發(fā)酵乳中只有一小部分風(fēng)味物質(zhì)是親水性化合物[18]。

表3 不同乳脂含量發(fā)酵乳中親脂性化合物和親水性化合物含量Table 3 Content of lipophilic and hydrophilic compounds in fermented milk with different fat contents

由表3可知，隨著乳脂含量的增加，親水性物質(zhì)含量先增加后減少，占比先增加后趨于穩(wěn)定，親脂性物質(zhì)含量持續(xù)降低，占比先降低后趨于穩(wěn)定，說(shuō)明乳脂含量的增加會(huì)降低頂部空間中親脂性化合物的含量，同時(shí)增加頂部空間中親水性化合物的含量，這與乳脂對(duì)親脂性化合物的結(jié)合有關(guān)[7]。親脂性風(fēng)味物質(zhì)在乳脂肪球上的吸附使其釋放速率降低，而親水性化合物不受影響，進(jìn)而使得揮發(fā)性物質(zhì)在頂空中達(dá)到平衡時(shí)，頂空氣體中親水性化合物含量增加，而親脂性化合物含量降低。當(dāng)乳脂含量較高時(shí)，頂空中親水性化合物含量降低，這可能與乳脂引起的發(fā)酵乳結(jié)構(gòu)變化有關(guān)。

表4 乳脂含量與親水性化合物含量的相關(guān)性Table4 Correlation between milk fat content and hydrophilic flavor compounds

表5 乳脂含量與親脂性化合物含量的相關(guān)性Table 5 Correlation between milk fat content and lipophilic flavor compounds

為了進(jìn)一步明確乳脂含量對(duì)不同親水性及親脂性風(fēng)味化合物的影響，采用Pearson相關(guān)性分析研究乳脂含量和2 種風(fēng)味化合物之間的關(guān)系。由表4～5可知，親水性風(fēng)味化合物中γ-丁內(nèi)酯含量與乳脂含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，其余均為正相關(guān)，但相關(guān)性均不顯著，說(shuō)明乳脂含量對(duì)親水性風(fēng)味化合物的影響較小。親脂性風(fēng)味化合物中，苯乙烯、2-乙基己醇、2-壬酮、己酸和丁酸5 種風(fēng)味化合物含量與乳脂含量呈正相關(guān)，其余均為負(fù)相關(guān)，并且除己醛、辛酸、癸酸外相關(guān)性均較高。整體上，風(fēng)味化合物的親脂性越強(qiáng)，其含量與乳脂含量的相關(guān)性越顯著。同時(shí)，乳脂含量對(duì)風(fēng)味化合物含量的影響和風(fēng)味化合物疏水性強(qiáng)弱的關(guān)系并不絕對(duì)。

結(jié)合乳酸菌在牛乳發(fā)酵過(guò)程中降解脂質(zhì)的途徑[19-20]及乳脂在發(fā)酵過(guò)程中的代謝進(jìn)一步分析可知，對(duì)于含量變化與疏水性強(qiáng)弱相關(guān)性較小的風(fēng)味物質(zhì)，丁酸、己酸、辛酸、癸酸等游離脂肪酸可以通過(guò)飽和脂肪酸的降解大量產(chǎn)生[21]。經(jīng)過(guò)β-氧化、水解、脫羧等作用，飽和脂肪酸還可以生成2-壬酮等甲基酮類(lèi)物質(zhì)，而不飽和脂肪酸在自由基的存在下被氧化形成氫過(guò)氧化物，迅速分解可以形成己醛或不飽和醛，進(jìn)一步降解可以得到醇類(lèi)、酸類(lèi)物質(zhì)[22]，同時(shí)不飽和脂肪酸的β-氧化能夠形成4-羥基酸或5-羥基酸[23]，在發(fā)酵乳中這些環(huán)酸容易環(huán)化得到γ-丁內(nèi)酯等γ-內(nèi)酯或δ-內(nèi)酯類(lèi)物質(zhì)。因此，在不同乳脂含量發(fā)酵乳中，乳脂相關(guān)代謝產(chǎn)物的變化不完全受其親水性及親脂性的影響。隨著乳脂含量的增加，除了γ-丁內(nèi)酯，其代謝產(chǎn)物的含量也隨之增加，但是發(fā)酵過(guò)程中脂肪代謝能夠產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)有限，而乳脂含量越高，其對(duì)親脂性風(fēng)味物質(zhì)的吸附越強(qiáng)，2-壬酮、己醛、丁酸、己酸等乳脂代謝產(chǎn)物含量降低。而隨著乳脂含量增加，γ-丁內(nèi)酯含量的直接降低可能與乳脂含量增加引起的不飽和脂肪酸代謝途徑變化有關(guān)。

3 結(jié)論

改變牛乳中的乳脂含量并對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果表明：發(fā)酵pH值曲線顯示，乳脂含量的變化對(duì)乳酸菌的產(chǎn)酸沒(méi)有影響；流變學(xué)和質(zhì)構(gòu)特性測(cè)定結(jié)果顯示，隨著乳脂含量的增加，發(fā)酵乳G’和G”降低，硬度和內(nèi)聚性無(wú)明顯變化，而膠著性顯著增加（P＜0.05）；GC-MS分析共檢出7 種親水性風(fēng)味化合物和27 種親脂性風(fēng)味化合物，隨著乳脂含量的增加，發(fā)酵乳的風(fēng)味物質(zhì)種類(lèi)無(wú)明顯差異，但含量有明顯變化，且變化趨勢(shì)不一；主成分分析結(jié)合相關(guān)性分析結(jié)果顯示，風(fēng)味物質(zhì)含量與其自身的疏水性強(qiáng)弱及來(lái)源有關(guān)，除γ-丁內(nèi)酯外，2-壬酮、己醛等與乳脂相關(guān)的代謝產(chǎn)物含量整體上先增加后減少，與乳脂降解無(wú)關(guān)的風(fēng)味物質(zhì)中，親水性風(fēng)味化合物含量先增加后減少，而親脂性風(fēng)味化合物含量降低。