王欣俞，崔 凱，趙晉文，丁曉娜，王鑫琪，魏殿軍，張延海，高德祿，劉 朋，郭奕陽

（1. 河北燕達(dá)醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北廊坊 066251；2. 河北燕達(dá)醫(yī)學(xué)研究院，河北廊坊 066251；3. 河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院檢驗(yàn)科，石家莊 050000）

梅毒是由梅毒螺旋體（treponemia pallidum，TP）感染引起的，累及全身多器官的一種疾病，其傳播途徑主要是性傳播[1]。近年來梅毒的陽性檢出率隨著人口流動性增加及社會生活方式的改變而呈現(xiàn)不斷上升的趨勢[2]，特別是因?yàn)樵缙诿范镜牟∽兘M織，又增加了獲得性傳播人類免疫缺陷病毒（HIV）感染的風(fēng)險[3]。其診斷主要根據(jù)病史，臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室血清學(xué)檢測。血清學(xué)檢測梅毒特異性抗體是目前國內(nèi)外診斷梅毒的主要方法[4]，在梅毒診斷方面起到重要作用[5]。血清學(xué)檢測主要分為兩類：第1類為非TP抗原血清試驗(yàn)，常用方法包括快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)（RPR）、性病研究實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)（VDRL）、甲苯胺紅不加熱血清試驗(yàn)（TRUST）等；第2類為TP抗原血清試驗(yàn)，主要有梅毒螺旋體血凝試驗(yàn)（TPHA）、梅毒螺旋體明膠凝集試驗(yàn)（TPPA）、熒光密螺旋體抗體吸附試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、免疫層析法、化學(xué)發(fā)光法及免疫印跡法等（WB）[6]。在梅毒血清學(xué)檢測方法中，不同檢測方法學(xué)反應(yīng)性結(jié)果存在不一致性。梅毒螺旋體抗體免疫印跡試驗(yàn)（treponema pallidum-western blot，TP- WB）采用大量高度純化的梅毒螺旋體抗原，是目前較為公認(rèn)的梅毒特異性抗體確證方法[7]。本研究將梅毒血清學(xué)檢測初篩有反應(yīng)性的臨床患者入組，擬評估免疫印跡法檢測TPN15，TPN17，TPN45和TPN47抗體表達(dá)在梅毒診斷中的應(yīng)用，研究結(jié)果為提高梅毒血清學(xué)診斷準(zhǔn)確性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 回顧性納入河北燕達(dá)醫(yī)院2018年6月～2019年6月28 417例使用化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析法（CMIA）篩查的梅毒血清樣本，選取檢測結(jié)果cutoff值S/CO比值＞15以及S/CO比值1～9患者樣本178例為研究對象，其中男性86例，女性92例，平均年齡56.22±19.15歲。分組：A組34例標(biāo)本，CMIA檢測有反應(yīng)性，TPPA陽性且RPR檢測陽性并伴有滴度；B組38例標(biāo)本，CMIA檢測有反應(yīng)性，cutoff值S/CO比值＞15，TPPA陽性，RPR檢測陰性；C組106例標(biāo)本CMIA檢測有反應(yīng)性，cutoff值S/CO比值1～9，TPPA均陽性，RPR檢測均陰性。梅毒感染診斷符合《中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)-梅毒診斷（WS273-2018）》[8]。

1.2 試劑和儀器 CMIA檢測法使用的廠家配套試劑盒及ARCHITECT i2000儀器，購自美國雅培公司； TPPA檢測法使用原廠配套試劑，購自日本富士公司的瑞必歐株式會社；TP- WB檢測法使用原廠配套試劑盒，購自德國歐蒙公司。

1.3 方法 抽取梅毒篩查對象空腹靜脈血5ml，3 000r/min離心10min，血清樣本加樣，2～8℃保存。CMIA法檢測梅毒特異性抗體，儀器測得樣本發(fā)光值并計(jì)算反應(yīng)物濃度，結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)：S/CO≥1為梅毒螺旋體抗體反應(yīng)性，S/CO＜1為非反應(yīng)性。RPR法檢測非特異性抗體；TPPA法檢測梅毒特異性抗體；TP-WB法檢測梅毒特異性抗體，該方法將含有TPN47，TmpA， TPN45，TPN17和TPN15抗原的硝酸纖維素膜測試條與30μl血清樣品一起溫育，然后與辣根過氧化物酶標(biāo)記的對人IgG特異的二抗孵育。在添加TMB后，免疫復(fù)合物在條帶上可視化為暗帶。通過與截止對照條帶的強(qiáng)度比較來評估每個抗原條帶的強(qiáng)度。檢測膜條置于全自動免疫印跡儀EUROBlotMasterll上檢測，通過EUROLineScan軟件判讀結(jié)果，當(dāng)五個診斷帶中至少兩條特異性抗原帶明確顯色，測試被判讀為陽性；一條特異性抗原帶明確顯色，測試被判讀為可疑。EUROLineScan軟件判讀結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)為著色強(qiáng)度≥24判定為有反應(yīng)性，儀器判讀檢測線性為24～255。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用MetaboAnalyst 4.0 的Statistical Analysis 模塊進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，具體步驟如下：樣本TPN47， TPN45，TPN17和TPN15及S/CO指標(biāo)值以列的方式分別錄入，以逗號間隔的CSV格式文件上傳，然后進(jìn)行數(shù)據(jù)完整性檢查，樣本經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換及數(shù)據(jù)正態(tài)化后進(jìn)行相關(guān)分析及主成分聚類分析。其中，相關(guān)分析采用Pearson r 距離法；數(shù)據(jù)分類可視化采用主成分分析法（principal component analysis， PCA）。采用Medcalc軟件對CMIA 法S/CO做特征曲線(ROC曲線)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算曲線下面積，確定 CMIA 法對梅毒診斷效能最大時的 S/CO最佳截斷點(diǎn)。不同診斷方法計(jì)數(shù)資料的比較采用卡方檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TP-WB法、CMIA法及TPPA法試驗(yàn)檢測梅毒抗體結(jié)果 178例受檢者中，TPPA法檢測結(jié)果梅毒陽性共168 例，陽性檢出率為94.4%；TP-WB法檢測結(jié)果梅毒陽性 78例，陽性率為43.8%，兩種檢測方法陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=104.2，P＜0.01），TP-WB法的靈敏度為 68.29%，特異度為90.91%。以TP-WB結(jié)果為參照，繪制ROC曲線，見圖1。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，當(dāng) CMIA 法測得的 S/CO 截斷值為 6.79時，敏感度為 79.41%，特異度為 96.05%，此時曲線下面積最大為 0.911，即6.79 為 CMIA 法的最佳診斷截斷值。

圖1 S/CO 比值ROC曲線分析

圖2 TP-WB法四種抗體著色強(qiáng)度和S/CO比值相關(guān)性

2.2 TP-WB檢測TPN15，TPN17，TPN45及TPN47抗體表達(dá)與CMIA法相關(guān)性分析 TP-WB法檢測TPN15，TPN17，TPN45及TPN47抗體表達(dá)著色強(qiáng)度和CMIA法S/CO比值相關(guān)性分析結(jié)果見圖2。同一樣本TPN15，TPN17，TPN45及TPN47抗體表達(dá)水平與S/CO比值均呈正相關(guān)（P ＜0.05），四種抗體表達(dá)水平與S/CO比值相關(guān)系數(shù)r分別為0.87，0.81，0.87及0.76。

2.3 TP-WB法著色強(qiáng)度分組的結(jié)果分析 按照TP-WB法讀取著色強(qiáng)度值將178例樣本進(jìn)行分析， A組34例著色強(qiáng)度50～170，B組38例著色強(qiáng)度24～90，C組106例著色強(qiáng)度24～50，組別及主成分分析聚類結(jié)果見表1及圖3。當(dāng)?shù)谝恢鞒煞譃?0.6%，第二主成分為3.9%時，將三組分別聚類分開。分組因子貢獻(xiàn)分析見圖4所示，5個分組因子夾角為銳角，貢獻(xiàn)率從高到低依次為TPN15，TPN45，TPN17，TPN47和S/CO比 值。A組，TPN15，TPN17，TPN45和TPN47抗體均反應(yīng)性且著色強(qiáng)度高數(shù)值，顯示評價方法和比對方法陽性符合率、總符合率為100%，具有高度一致性。B組，TPN15，TPN17，TPN45和TPN47抗體陽性率均減少，分別為92.1%，65.8%，86.8%和36.8%。TPN17和TPN47抗體陽性率顯著降低（P＜0.05）。C組，TPN15和TPN17抗體表達(dá)為主。TP-WB法檢測30例結(jié)果反應(yīng)性（檢測出6例結(jié)果陽性，24例結(jié)果可疑陽性），76例結(jié)果陰性。TPPA法復(fù)驗(yàn)，檢測出96例結(jié)果1:80陽性，10例結(jié)果陰性（TP-WB確證時，2例結(jié)果判定可疑）；TPPA與TP-WB法相比，顯示陽性符合率29.2%。

表1 CMIA,TPPA,RPR,TP-WB及其抗體表達(dá)檢測結(jié)果

圖3 TP-WB免疫印跡法樣本著色強(qiáng)度分組主成分聚類結(jié)果

圖4 TP-WB免疫印跡法樣本著色強(qiáng)度分組因子貢獻(xiàn)分析

3 討論

近年來，梅毒作為嚴(yán)重威脅公共健康的傳染性疾病之一[9-10]，具有極強(qiáng)的侵襲性，它通過黏附、定植、穿過組織屏障、累及全身各器官[11]。據(jù)報道，無癥狀梅毒的發(fā)生率高達(dá)64.6%以上[12]，盡管梅毒的發(fā)現(xiàn)和診治已有數(shù)十年的歷史，但是初期梅毒確診和晚期梅毒治療仍具有挑戰(zhàn)性[13]。TP侵入機(jī)體后可誘導(dǎo)產(chǎn)生針對其不同抗原成分的抗體，主要包括抗心磷脂抗體和抗TP特異性抗體，是臨床血清學(xué)檢驗(yàn)診斷是否攜帶梅毒的基礎(chǔ)。TP蛋白是梅毒感染的重要因素，在感染梅毒時，檢測患者血清中的TP蛋白對梅毒的診斷具有重要價值[14].TP外膜蛋白是免疫的主要靶點(diǎn)，相關(guān)研究已發(fā)現(xiàn)9種具有免疫活性的蛋白，即TPN15，TPN17，TPN33，TPN37，TPN39，TPN43，TPN45，TPN47和TPN97，而其中的TPN15，TPN17，TPN45和TPN47抗體表達(dá)水平被認(rèn)為在梅毒的致病與診斷中起重要作用[15]。

TP是迄今為止無法在體外培養(yǎng)的病原微生物,感染后其表面的膜蛋白對宿主的固有免疫系統(tǒng)具有很強(qiáng)的調(diào)控作用,因此被認(rèn)為是 TP重要的毒力因子[16-17]。隨著醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，TP膜蛋白的相關(guān)研究報道及應(yīng)用不斷涌現(xiàn)[18]。在蛋白質(zhì)印跡診斷測試中TPN45脂蛋白（TmpA; tp0768基因產(chǎn)物）和嵌合大腸埃希菌表達(dá)TPN15，TPN17，TP44.5和TPN47抗原（Meridian Life Science，Inc.，Memphis，Tennessee USA）作為免疫原性抗原的組合，被證實(shí)對獲得性梅毒具有高度敏感度和特異度[19]。其中TPN47，TPN17，TPN15以及TmpA脂蛋白具有強(qiáng)大的前炎癥活性，與TP引起的梅毒免疫反應(yīng)密切相關(guān)[20]。KUBANOV等[19]報道TPN15和TPN17免疫原性抗原是關(guān)鍵成員，在梅毒感染期間誘導(dǎo)高抗體反應(yīng)并且不與來自患有其他螺旋體病的患者的血清交叉反應(yīng)。CHAN等[21]提出TPN17在菌體外膜表面的分布具有隨意性的特點(diǎn)。它可能通過激活細(xì)胞間黏附分子1（ICAM-1），E-選擇素和單核細(xì)胞趨化蛋白-1的表達(dá)，在蛋白質(zhì)配體結(jié)合，密螺旋體膜結(jié)構(gòu)維持[22]或梅毒發(fā)病機(jī)制中起作用。另一種強(qiáng)免疫原TPN47，具有較強(qiáng)的免疫原性和反應(yīng)性，通過刺激微血管內(nèi)皮細(xì)胞合成細(xì)胞間黏附分子并誘導(dǎo)血管細(xì)胞黏附分子在宿主-病原體相互作用中發(fā)揮作用[19，23]。

本項(xiàng)研究中顯示活動性梅毒患者中免疫印跡梅毒特異性抗體TPN15，TPN17，TPN45和TPN47抗體均具反應(yīng)性且EUROLineScan軟件判讀結(jié)果著色強(qiáng)度數(shù)值高反應(yīng)性，與梅毒活動進(jìn)展呈正相關(guān)性；CMIA檢測S/CO值＞15時，梅毒抗體單陽者中免疫印跡梅毒特異性抗體TPN15，TPN17，TPN45和TPN47陽性率均減少，其中TPN17和TPN47抗體陽性率顯著降低（P＜0.05）；CMIA檢測S/CO值在1～9之間反應(yīng)性結(jié)果時，通過免疫印跡檢測確認(rèn)顯示陽性及可疑患者中TPN15，TPN17，TPN45和TPN47抗體的表達(dá)明顯減少且反應(yīng)曲線著色強(qiáng)度均呈低水平。CMIA，TPPA與WB-Tp之間檢測結(jié)果不一致，其陽性符合率僅為29.2%，并且臨床最終判定結(jié)果陽性占20%（6/30），可疑陽性結(jié)果占80%（24/30）。

綜上所述，基于重組脂蛋白技術(shù)的密螺旋體特異度檢測顯著改善了梅毒的診斷，為臨床實(shí)驗(yàn)室提供血清學(xué)檢測確證的依據(jù)。本研究結(jié)果顯示，梅毒患者分期處于不同的階段時，梅毒特異性抗體TPN15，TPN17，TPN45和TPN47抗體表達(dá)存在差異。當(dāng)梅毒血清初篩檢測結(jié)果弱反應(yīng)性以TPPA復(fù)核時，TPPA檢測結(jié)果并不能作為臨床確證的診斷，實(shí)驗(yàn)室血清學(xué)確證方法應(yīng)首選梅毒免疫印跡法進(jìn)行確證。