張 恒，袁 莉，王 佩，吳曉康，雷華斌,焦飛燕

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)孫思邈醫(yī)院a.檢驗(yàn)科；b.腦病科，陜西銅川 727031；2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，西安 710061；3.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，西安 710000；4.陜西省第四人民醫(yī)院，西安 710043）

缺血性腦血管病產(chǎn)生的神經(jīng)功能損害是醫(yī)學(xué)界一大難題[1]。研究表明，腦缺血/再灌注損傷后會(huì)引起人體血腦屏障（blood brain barrier，BBB）通透性的破壞，從而引發(fā)腦出血、腦水腫[2]。另外發(fā)現(xiàn)腦缺血后缺血區(qū)新生血管的恢復(fù)與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、生長(zhǎng)相關(guān)因子的表達(dá)水平相關(guān)[3]。血管生成素作為其中一種生長(zhǎng)相關(guān)因子，已證實(shí)在血管新生方面具有重要作用，據(jù)報(bào)道其可改善腦血流灌注后造成的腦損傷，挽救缺血半暗帶的神經(jīng)元，從而促進(jìn)腦缺血區(qū)的神經(jīng)功能恢復(fù)[4]。血管生成素樣蛋白2（Angiopoietin-Like Protein 2，ANGPTL2）作為血管生成素樣蛋白家族成員，具有促進(jìn)血管發(fā)生、組織修復(fù)、維持造血干細(xì)胞的特性，調(diào)控腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移等功能，并且發(fā)現(xiàn)該蛋白與糖尿病、癌癥等疾病的發(fā)生相關(guān)[5-7]。另有研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞來(lái)源的ANGPTL2在心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，而血小板源的ANGPTL2在血栓形成中有關(guān)鍵作用[8]。然而，ANGPTL2在腦缺血/再灌注后腦損傷過(guò)程中的作用機(jī)制卻很少有報(bào)道。本研究通過(guò)建立大鼠局灶性腦缺血/再灌注模型，探討ANGPTL2對(duì)大鼠腦缺血/再灌注損傷的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物來(lái)源 SPF級(jí)雄性Wister大鼠由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。選擇Wister大鼠60只，建立大鼠局灶性腦缺血/再灌注模型，隨機(jī)分為假手術(shù)組和ANGPTL2組。

1.2 試劑與儀器 病理組織漂烘儀、包埋機(jī)購(gòu)自常州市中威電子儀器有限公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自美谷分子儀器有限公司；大鼠腦槽購(gòu)自美國(guó)TED-Pella；氯代三苯基四氮唑溶液購(gòu)自青島海博生物技術(shù)公司；ELISA試劑盒購(gòu)自上海通蔚生物技術(shù)公司；PCR試劑盒購(gòu)自日本TAKARA公司；SP試劑盒購(gòu)自上海國(guó)源生物技術(shù)有限公司；ANGPTL2單克隆抗體購(gòu)自上海信裕生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物模型建立：參照高軒等[8]人報(bào)道的大腦中動(dòng)脈線(xiàn)栓法建立腦缺血/再灌注模型。首先注射戊巴比妥鈉（60 mg/kg）麻醉大鼠，然后使大鼠仰臥位，剪開(kāi)大鼠右側(cè)皮膚，暴露頸總動(dòng)脈，將涂有肝素的尼龍線(xiàn)線(xiàn)栓自頸總動(dòng)脈向頸內(nèi)動(dòng)脈插入，栓線(xiàn)長(zhǎng)度約17～18 mm，從而阻斷大腦中動(dòng)脈血流，造成局灶性腦缺血。本研究分別在腦缺血30 min或90 min后松開(kāi)尼龍線(xiàn)，造成血流再灌注。假手術(shù)組：不阻斷大鼠大腦中動(dòng)脈，手術(shù)操作與模型制備相同；ANGPTL2組：再灌注同時(shí)，向大鼠尾靜脈注射ANGPTL2(2 μg/kg)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.2 ANGPTL2 mRNA及蛋白檢測(cè)：假手術(shù)組、ANGPTL2組建模6，12，24，48，72 h后，采集大鼠的外周血，進(jìn)行RT-PCR檢查，應(yīng)用Thermal Cycler Dice Real time System兩步法PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

HE染色：采用SP法，操作步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。一抗為ANGPTL2單克隆抗體。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用Image-Pro Plus高清彩色病理圖文報(bào)告分析系統(tǒng)對(duì)所選取視野中陽(yáng)性信號(hào)進(jìn)行圖像分析。

1.3.3 大鼠神經(jīng)功能評(píng)分：建模48 h后，進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分[9]，分為0分、1分、2分、3分、4分。在手術(shù)前1天和手術(shù)后分別進(jìn)行該項(xiàng)檢測(cè)。

1.3.4 腦組織含水量檢測(cè)：建模48 h后，每組隨機(jī)取5只大鼠斷頭取腦，去除大鼠嗅球、小腦和腦干，測(cè)定濕重，110℃烘烤24 h后稱(chēng)干重，腦組織含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.3.5 BBB通透性檢測(cè)：建模48 h后，每組隨機(jī)取5只大鼠經(jīng)股靜脈按2 ml/kg注入2.5g/dl伊文思藍(lán)生理鹽水，2 h后經(jīng)左心室注射200 ml生理鹽水。取出腦組織將其浸潤(rùn)于二甲基甲酰胺溶液，60 ℃孵育24 h，離心取上清。在620 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度(A)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算腦組織中伊文思藍(lán)（Evans blue, EB）含量(1 μg/g腦重量)。

1.3.6 大鼠腦梗死體積測(cè)定：建模48 h后，每組隨機(jī)取5只大鼠在規(guī)定的不同處理時(shí)間點(diǎn)斷頭處理，取出腦組織置于-20℃冰箱，從額極開(kāi)始從前向后切取腦組織5～7片，每片約2 mm厚。然后置于2% 氯代三苯基四氮唑溶液中，37℃避光孵育30 min。紅色區(qū)域?yàn)檎ＤX組織，蒼白色為梗死區(qū)。采用圖像分析軟件處理計(jì)算腦梗死體積。

1.3.7 標(biāo)記物檢測(cè)：分別于建模(T0)、建模后2 h(T1)，6 h(T2)，12 h(T3)和24 h(T4)各時(shí)間點(diǎn)抽取每組大鼠眼眶血1 ml，3000 r/min離心10 min。采用ELISA測(cè)定血清中S-100β,腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-1（IL-1）水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)比較兩組間的差異。采用重復(fù)測(cè)量資料比較不同時(shí)間點(diǎn)大鼠血清中S-100β，TNF-α和IL-1水平。計(jì)數(shù)資料用構(gòu)成比表示，采用卡方（χ2）檢驗(yàn)比較組間差異。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠大腦皮層中ANGPTL2 mRNA表達(dá)水平的變化 見(jiàn)表1。采用免疫組化分析大鼠缺血/再灌注后大腦皮層中ANGPTL2的表達(dá)水平，缺血30和90 min時(shí)ANGPTL2mRNA的表達(dá)水平高于假手術(shù)組。大鼠腦缺血/再灌注處理后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，ANGPTL2 mRNA水平逐漸升高，在48 h時(shí)達(dá)到最高峰，隨后ANGPTL2 mRNA水平逐漸減少。

表1 缺血30 min及90 min再灌注不同時(shí)間點(diǎn)大腦皮層中ANGPTL2 mRNA表達(dá)的變化

表1可以看出，在缺血30min時(shí)ANGPTL2組再灌注6 h的ANGPTL2 mRNA表達(dá)水平高于假手術(shù)組(t=1.841，P=0.103)，ANGPTL2組再灌注12 h的ANGPTL2 mRNA表達(dá)水平顯著高于假手術(shù)組(t=2.412，P=0.042)，ANGPTL2組再灌注24 h的ANGPTL2 mRNA表達(dá)水平顯著高于假手術(shù)組(t=3.646，P=0.006)，ANGPTL2組再灌注48h的ANGPTL2 mRNA表達(dá)水平顯著高于假手術(shù)組(t=7.437，P=0.000)，ANGPTL2組 再 灌 注72 h的ANGPTL2 mRNA表達(dá)水平顯著高于假手術(shù)組(t=5.021，P=0.001)。在 缺 血90 min時(shí)ANGPTL2組再灌注6 h的ANGPTL2 mRNA表達(dá)水平高于假手術(shù)組(t=1.833，P=0.104)，ANGPTL2組再灌注12 h的ANGPTL2 mRNA表達(dá)水平顯著高于假手術(shù)組(t=2.394，P=0.043)，ANGPTL2組再灌注24 h的ANGPTL2 mRNA表達(dá)水平顯著高于假手術(shù)組(t=3.578，P=0.007)，ANGPTL2組再灌注48 h的ANGPTL2 mRNA表達(dá)水平顯著高于假手術(shù)組(t=7.645，P=0.000)，ANGPTL2組 再 灌 注72 h的ANGPTL2 mRNA表達(dá)水平顯著高于假手術(shù)組(t=5.660，P=0.000)。

2.2 ANGPTL2對(duì)大鼠腦缺血/再灌注損傷的影響 見(jiàn)表2。在建模48 h后，ANGPTL2組大鼠的腦組織含水量、伊文思藍(lán)含量和腦梗死體積均顯著低于假手術(shù)組，而ANGPTL2組大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分顯著高于假手術(shù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表2 ANGPTL2對(duì)各指標(biāo)的影響

2.3 ANGPTL2對(duì)標(biāo)記物S-100β的影響 見(jiàn)表3。相較于T0，大鼠在T1時(shí)的S-100β顯著增加。隨著建模時(shí)間的延長(zhǎng)，S-100β水平逐漸降低，并且與T0的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表3 ANGPTL2組不同再灌注時(shí)間對(duì)不同組大鼠血清S-100β標(biāo)記物表達(dá)水平的影響

表4 ANGPLT2組不同再灌注時(shí)間對(duì)大鼠血清中TNF-α，IL-1表達(dá)水平的影響

2.4 ANGPTL2對(duì)炎癥介質(zhì)TNF-α，IL-1的影響 見(jiàn)表4。相較于T0，ANGTPL2組大鼠在T1，T2，T3，T4時(shí)血清TNF-α，IL-1均顯著增加，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

據(jù)報(bào)道血管生成素樣蛋白是與血管生成相關(guān)的一類(lèi)分泌型糖蛋白，其中ANGPTL2在血管內(nèi)皮細(xì)胞受損恢復(fù)中具有重要作用，另外還發(fā)現(xiàn)ANGPTL2具有促進(jìn)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)、抑制血小板聚集的功能[8]。TAZUME等[9]發(fā)現(xiàn)了ANGPTL2在腹主動(dòng)脈瘤的巨噬細(xì)胞中大量表達(dá)，證實(shí)了巨噬細(xì)胞來(lái)源的ANGPTL2能夠促進(jìn)腹主動(dòng)脈瘤的發(fā)展。HORIO等[10]人對(duì)10例冠心病患者進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中ANGPTL2過(guò)表達(dá)，同時(shí)粥樣斑塊浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞數(shù)目顯著降低；人為抑制內(nèi)皮源性的ANGPTL2表達(dá)后，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶發(fā)生失活，內(nèi)皮細(xì)胞功能減弱，同時(shí)還促使部分促炎癥型巨噬細(xì)胞M1向抗炎癥型巨噬細(xì)胞M2的分化。然而關(guān)于ANGPTL2蛋白在腦缺血/再灌注后急性腦損傷過(guò)程中的作用機(jī)制卻少有報(bào)道。

本文發(fā)現(xiàn)在缺血30和90min時(shí)ANGPTL2組再灌注6，12，24，48和72 h的ANGPTL2 mRNA表達(dá)水平高于假手術(shù)組。在建模48 h后，ANGPTL2組大鼠的腦組織含水量、伊文思藍(lán)含量和腦梗死體積均顯著低于假手術(shù)組，ANGPTL2組大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分顯著高于假手術(shù)組。該結(jié)果表明ANGPTL2可以幫助大腦缺血/再灌注后受損傷的血腦屏障的恢復(fù)，降低腦水腫，從而遏制了腦缺血/再灌注病程的發(fā)展。

有研究報(bào)道，腦梗死體積和腦出血量與S-100β蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)[11]。另外發(fā)現(xiàn)腦損傷發(fā)生20 min后血清中S-100β濃度就會(huì)出現(xiàn)明顯升高[12]。且大量研究證實(shí)缺血、缺氧是誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)S-100β表達(dá)上調(diào)的重要因素，因此S-100β水平可作為檢測(cè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的一個(gè)靈敏性指標(biāo)[13]。本研究中將S-100β水平高低作為判斷血腦屏障是否損傷的監(jiān)測(cè)指標(biāo)，S-100β蛋白分子量大，如果血腦屏障未受到損傷的情況下，正常腦血流中很難檢測(cè)到S-100β，只有當(dāng)血腦屏障發(fā)生破壞時(shí)才能檢測(cè)到。本研究結(jié)果顯示相較于T0，大鼠在T1時(shí)S-100β顯著增加。隨著建模時(shí)間的延長(zhǎng)，S-100β水平逐漸降低，并且與T0的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。表明ANGPTL2可有效降低S-100β蛋白的表達(dá)，對(duì)腦缺血/再灌注損傷（中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷）有保護(hù)作用。

大腦缺血/再灌注時(shí)分子氧進(jìn)入缺血組織時(shí)會(huì)產(chǎn)生O2-，OH-等氧自由基，從而激活促炎癥相關(guān)的轉(zhuǎn)錄信號(hào)，導(dǎo)致炎性因子表達(dá)量升高，這是目前關(guān)于腦缺血/再灌注損傷時(shí)發(fā)生的機(jī)制[14]。本研究結(jié)果表明相較于T0，ANGPTL2組大鼠在T1，T2，T3，T4時(shí)血清中TNF-α和IL-1水平均顯著升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。ANGPTL2作為一種多功能的炎性因子可以參與多種信號(hào)通路在不同的組織細(xì)胞中發(fā)揮功能[15-16]。目前發(fā)現(xiàn)ANGPTL2主要通過(guò)結(jié)合整合素α5β1和免疫抑制性受體來(lái)發(fā)揮生理作用[17]。本研究揭示了ANGPTL2可以促進(jìn)組織炎癥反應(yīng)、減輕由腦缺血、缺氧造成的BBB通透性的改變、降低S-100β蛋白的表達(dá)，具有幫助腦缺血/再灌注損傷恢復(fù)的作用。