李 燕，郭東貴，田黔粵，李立鵬

(貴州理工學院，貴州 貴陽 550003)

何首烏為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorum Thunb的干燥塊根[1]，何首烏中主要成分為二苯乙烯苷類、蒽醌類、核苷類、黃酮類、無機元素和磷脂類[2-6]。磷脂酰膽堿，又稱卵磷脂，是組成細胞膜最豐富的磷脂之一。卵磷脂在人體組織器官中，以腦、骨髓和神經(jīng)組織中含量最多。卵磷脂中的膽堿對脂肪有親和力，能促進脂肪的代謝，因此卵磷脂還可降低血清膽固醇含量，具有抗脂肪肝的作用，另外，對肝細胞膜具有修復作用[7]。

卵磷脂有利于神經(jīng)發(fā)育和增強記憶功能。磷脂酰膽堿在體內(nèi)水解成膽堿后與大腦中的乙酸結合形成乙酰膽堿，乙酰膽堿是神經(jīng)系統(tǒng)信息傳遞時必需的化合物，其含量越高，腦神經(jīng)細胞間的信息傳遞越快，記憶功能會得到增強[8]。隨著年齡增長乙酰膽堿含量會有所下降，補充卵磷脂，可以減緩記憶力衰退的進程，預防或推遲老年癡呆癥的發(fā)生。嬰幼兒補充磷脂有利于神經(jīng)發(fā)育和認知能力的提高[9-10]。此外，卵磷脂還可以增強胰臟機能，促進胰島素的分泌，能分解油脂，清除過氧化物，降低血液中的膽固醇和脂肪，具有調(diào)節(jié)血脂、防治糖尿病和動脈硬化等保健功能[11-14]。目前，卵磷脂已較多添加于各類保健品和功能性食品中。

貴州省大力發(fā)展中藥材的標準化種植，有天麻、杜仲、石斛、何首烏、太子參、白芨等，而目前2015年版《中國藥典》中只有二苯乙烯苷和蒽醌的含量測定方法，何首烏的卵磷脂含量測定方法沒有記載，并且有關卵磷脂含量測定的報道比較少。目前有報道采用分光光度法、薄層色譜法和超臨界流體萃取-高效液相色譜法測定卵磷脂的含量，但方法較繁瑣，難以滿足現(xiàn)代科技發(fā)展和物質(zhì)水平對質(zhì)量檢測的要求。本試驗采用高效液相-蒸發(fā)光散色檢測器，對貴州不同產(chǎn)地的何首烏藥材的卵磷脂成分進行分析，并建立了卵磷脂的測定方法，為貴州何首烏藥材的質(zhì)量標準提升、標準化種植、以及后期相關功能性食品和保健品的開發(fā)和利用提供科學依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1260型高效液相色譜儀，蒸發(fā)光散色檢測器(Alltech ELSD 2000ES)，F(xiàn)A2004分析天平(上海良平儀器儀表有限公司)，SF8200HPT型超聲波清洗器(上海冠特超聲儀器有限公司)，F(xiàn)1AA29498型純水儀(艾威儀器有限公司)。

1.2 試藥

甲醇(A.R，天津市富寧精細化工有限公司)、三氯甲烷(A.R，重慶京東化工有限公司化學試劑廠)、三乙胺(色譜純，Tedia公司)、異丙醇(色譜純，SK Chemicals Uisan公司)、正己烷(色譜純，Honewell Burdicke Jackion公司)，磷脂酰膽堿對照品(又名：卵磷脂)(批號：P3556)購于美國sigma公司，何首烏藥材樣品來源見表 1，經(jīng)貴州大學熊源新教授鑒定均為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorum Thunb的塊根。

表1 何首烏藥材的來源

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent SIL柱(5μm，4.6×250mm)；以甲醇-水-冰醋酸-三乙胺(85∶15∶0.45∶0.05)為流動相A，以正己烷-異丙醇-流動相A(20∶48∶32)為流動相B，梯度洗脫，柱溫40℃；流速1mL/min；進樣量10μL，記錄時間20min，漂移管溫度為90℃；載氣流量為2.8L/min。梯度洗脫條件見表2。

表2 梯度洗脫條件

2.2 對照品溶液的制備

取磷脂酰膽堿0.0024g，置10mL的容量瓶中，用三氯甲烷-甲醇(2∶1)溶解并稀釋至刻度，配置成240μg/mL的溶液。

2.3 提取條件的考察

2.3.1 提取溶劑的考察

精密稱取何首烏粉末(過五號篩)24份，每份0.2g，分成4組，置250mL具塞錐形瓶中，分別精密加入甲醇、氯仿、乙酸乙酯和Folch試劑(氯仿∶甲醇為2∶1) 25mL，密塞，稱重，于冷水中超聲提取60min，取出稱重并補重，靜置后取上清液用0.45μm微孔濾膜濾過，即得。所得供試品溶液照“2.1”項下色譜條件進行測定，計算磷脂的含量見表3。

表3 不同溶劑卵磷脂含量

由結果可知，用Folch試劑作為溶劑提取的峰面積最大，故選擇Folch試劑為提取溶劑。

2.3.2 提取時間的考察

精密稱取同一批何首烏粉末(過五號篩)18份，每份0.2g，分成3組，置250mL具塞三角瓶中，分別精密如入Folch試劑25mL，密塞，稱重，按組分別于冷水中超聲30，60，90min，取出稱重并補重，靜置后取上清液用0.45μm微孔濾膜濾過，即得。所得供試品溶液照"2.1"項下色譜條件進行測定，計算磷脂的含量見表4。

表4 不同提取時間卵磷脂含量

結果表明60min和90min的含量相差不大，考慮卵磷脂超聲時間過長，水溫易熱，使卵磷脂降解，最后選擇超聲提取60min作為提取時間。

2.3.3 提取用量的考察

精密稱取同一批何首烏粉末(過五號篩)18份，每份0.2g，分成3組，置250mL具塞三角瓶中，分別精密如入Folch試劑25，50，75mL，密塞，稱重，于冷水中超聲提取60min，取出稱重并補重，靜置后取上清液用0.45μm微孔濾膜濾過，即得。所得供試品溶液照"2.1"項下色譜條件進行測定，計算磷脂的含量見表5。

表5 不同提取用量卵磷脂含量

由結果可知， 提取溶劑量為25mL卵磷脂含量最高，因此提取溶劑用量選25mL。

2.3.4 供試品溶液的制備

藥材樣品低溫干燥后粉碎(過五號篩)，精密稱取粉末0.5g，置250mL錐形瓶中，精密加入Folch試劑25mL，密塞，稱定重量，于冷水中超聲提取60min，取出稱重并補重，靜置后取上清液用0.45μm微孔濾膜濾過，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系的考察

分別吸取上述對照品溶液2，4，6，8，10μL，照“2.1”項下色譜條件進行測定，以濃度C的對數(shù)值為橫坐標，峰面積A的對數(shù)值為縱坐標計算回歸方程，回歸方程為lgA=1.12lgC+4.66，r=0.9974。表明卵磷脂在48 ～240μg/mL之間呈良好的線性關系。

2.4.2 精密度試驗

精密吸取磷脂酰膽堿標準溶液(240μg/mL)10μL，照“2.1”色譜條件下連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，計算RSD值，如表6。

表6 精密度試驗結果

2.4.3 重復性試驗

精密取第四批施秉何首烏藥材樣品6份,分別按“2.3”項下方法進行制備，并按“2.1”項下色譜條件進行測定，計算各份樣品的含量，并計算RSD%，如表7。

表7 重復性試驗結果

2.4.4 穩(wěn)定性試驗

取第四批施秉何首烏藥材的樣品溶液，分別在0、1、2 、3 、 4h內(nèi)進樣，按“2.1”項下色譜條件進行測定。記錄峰面積，計算RSD值，如表8。

表8 穩(wěn)定性試驗結果

2.4.5 加樣回收率試驗

取已知卵磷脂含量的何首烏粉末0.1g，過五號篩，平行取6份，精密稱定重量，置250mL具塞錐形瓶中，分別加入對照品，分別按“2.3”項下方法進行制備，并按“2.1”項下色譜條件進行測定，計算回收率和RSD%，結果見表9。

表9 加樣回收率試驗結果

2.5 含量測定

稱取16批何首烏粉末(過五號篩)，每批何首烏平行稱量3份，每份約0.2g，照“2.3.4”項下的方法制備，照“2.1”項的色譜條件進行測定，計算各供試品卵磷脂的含量，結果見表10。

表10 16批何首烏藥材卵磷脂含量(驗次數(shù)n=3)

備注：1-都勻，2-都勻，3-貴陽，4-施秉，5-德江，6-印江，7-湄潭，8-鳳崗，9-赫章，10-六枝，11-水城，12-安龍，13-興義，14-興仁，15-關嶺，16-寧谷。

3 討論

本研究運用高效液相色譜儀-蒸發(fā)光散色檢測器測定了貴州省各產(chǎn)地何首烏中卵磷脂的含量，所選藥材覆蓋整個貴州省，具有一定的代表性。本研究通過對供試品溶液制備方法在提取溶劑、提取時間和提取用量方面進行了考察，結果表明，采用超聲提取方法，加Folch試劑25mL，提取60min，能夠達到良好的測定效果，經(jīng)方法學考察平均回收率達到100.01%。經(jīng)方法學考察，該方法穩(wěn)定可靠，與文獻報道的采用分光光度法、薄層色譜法和超臨界流體萃取-高效液相色譜法測定卵磷脂含量的方法相比，此方法簡便且精密度高，滿足現(xiàn)代中藥材對質(zhì)量檢測的要求。由于卵磷脂具有較高的藥用價值，該方法可增加到何首烏的質(zhì)量檢測指標中，為貴州何首烏藥材的質(zhì)量標準提升、質(zhì)量控制 、標準化種植以及后期產(chǎn)品的開發(fā)和利用提供科學依據(jù)。