魏建仝 錢 軍* 蘇秦柳曄 劉志俠 王徐龍 王勇平 謝瑞敏 李 想

（1.河西學(xué)院附屬張掖人民醫(yī)院；2.河西學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院；3.河西學(xué)院骨與關(guān)節(jié)研究所；4.張掖市骨科質(zhì)量控制中心，甘肅 張掖 734000；5.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000）

人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后PJI發(fā)生率約1%，是其災(zāi)難性并發(fā)癥［1］.因PJI導(dǎo)致髖關(guān)節(jié)置換失敗而需翻修的比例約15%，在膝關(guān)節(jié)更高達(dá)約25%，嚴(yán)重影響患者健康［2］.盡管隨著層流手術(shù)室的普及、術(shù)中無菌觀念及技術(shù)的進(jìn)步、關(guān)節(jié)假體表面的改性、術(shù)中抗生素骨水泥的應(yīng)用、術(shù)后預(yù)防性使用抗生素、感染傷口的更有效處理等使術(shù)后PJI的發(fā)生率下降，但隨著我國人口的老齡化，人工關(guān)節(jié)置換術(shù)開展總量增多，術(shù)后PJI的發(fā)生量亦隨之增加［3］.高川渤等［4］分析引起術(shù)后PJI的病原菌譜，耐藥的高毒力革蘭陰性細(xì)菌占62.54%.致病菌定植黏附于假體表面形成生物膜，在PJI致病機(jī)制中扮演著重要角色并使得PJI 遷延難愈，治療困難.LL-37 作為Cathelicidin 家族的一員，具有來源廣泛、抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)和不產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)［5］.本文對生物膜引起致病菌耐藥機(jī)制及抗菌肽LL-37對生物膜的抑制作用進(jìn)行綜述.

1 生物膜與致病菌耐藥

1.1 臨床致病菌耐藥現(xiàn)狀及與生物膜關(guān)聯(lián)性

大樣本數(shù)據(jù)表明骨科臨床感染致病菌金黃色葡萄球菌（SA）中59%為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）［6］.左祥等［7］報(bào)道SA對甲氧芐啶和慶大霉素的耐藥率為70.27%和24.32%.錢衛(wèi)東等［8］研究70例臨床來源的SA的耐藥性和生物膜形成能力，結(jié)果菌株對青霉素耐藥率為95.71%，對苯唑西林耐藥率為74.29%，對克林霉素耐藥率為52.86%，對利奈唑胺耐藥率為27.14%，對甲氧芐啶耐藥率為21.43%，對慶大霉素耐藥率為2.86%，對環(huán)丙沙星耐藥率為21.43%，對頭孢唑啉耐藥率為37.14%，對哌拉西林耐藥率為38.57%，菌株中25.71%為耐藥菌株，71.43%為多重耐藥菌株，表明SA多重耐藥情況嚴(yán)重.而菌株成膜能力結(jié)果表明所有SA菌株均能形成生物膜，且其中強(qiáng)生物膜菌株占71.43%、中等強(qiáng)度生物膜菌株占18.57%，提示SA有普遍且強(qiáng)烈的生物膜形成能力.

致病菌黏附于假體表面形成高度組織化的膜樣聚合物并包繞致病菌自身，在生物膜的保護(hù)下膜內(nèi)致病菌對微環(huán)境壓力、對抗菌藥物的殺滅能力及對宿主免疫系統(tǒng)攻擊的耐受力均增強(qiáng)，提高其耐藥性，其較浮游態(tài)菌提高10～1000倍.可見生物膜是導(dǎo)致PJI早期難明確診斷，治療難保留假體，治療后反復(fù)感染、持續(xù)感染的關(guān)鍵因素之一［9，10］.

1.2 耐藥機(jī)制

1.2.1 屏障作用

（1）生物膜為一復(fù)雜的、高度組織化的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)且成熟后有一定厚度，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定不易被破壞，其形成膜內(nèi)致病菌的物理屏障.（2）三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)內(nèi)部為迂曲通道，是抗菌藥物大分子進(jìn)入膜內(nèi)受限、受阻的原因之一［11］.（3）即使抗菌藥物進(jìn)入膜內(nèi)，其擴(kuò)散速度受到明顯影響，深層致病菌甚至接觸不到抗菌藥物.（4）生物膜為帶負(fù)電的POPG膜（1-棕櫚?；?2-油酰基磷脂酰甘油），能吸收多肽鏈中帶正電荷的氨基側(cè)鏈，構(gòu)成電荷屏障，阻礙親水性抗菌藥物進(jìn)入菌體發(fā)揮殺菌作用，降低抗菌藥物的殺滅能力［12］.（5）生物膜聚合物發(fā)揮分子篩選效應(yīng)，增加抗菌藥物的最低抑菌濃度（MIC），提高致病菌的耐藥性［13］.總之，生物膜通過對抗菌藥物的屏障，對膜內(nèi)致病菌起到保護(hù)作用，增加感染治療難度.

1.2.2 微環(huán)境調(diào)節(jié)

生物膜具有不均質(zhì)性，呈分層結(jié)構(gòu)，膜不同層面微環(huán)境存在差異，使不同層面的致病菌理化特性差異顯著.Lenz等［14］發(fā)現(xiàn)生物膜分表里兩層，表層致病菌代謝活躍、分裂快，里層則反之.黃曉晶等［15］通過激光共聚焦掃描顯微鏡觀察亦發(fā)現(xiàn)抗菌藥物對生物膜外各時(shí)段變異鏈球菌（SM）均有殺傷作用，但對膜內(nèi)深層SM僅在早期產(chǎn)生影響（3h）.分層結(jié)構(gòu)使得自膜外向內(nèi)營養(yǎng)成分、代謝產(chǎn)物濃度、滲透壓和氧濃度等呈梯度下降，膜內(nèi)為低營養(yǎng)物質(zhì)、低氧濃度微環(huán)境，深層致病菌很難獲得養(yǎng)分和氧氣，酸性代謝產(chǎn)物堆積，代謝活性低甚至處于休眠狀態(tài)，對各種理化刺激、應(yīng)激反應(yīng)及藥物均不敏感，使得感染難以控制［15］.

1.2.3 QS系統(tǒng)作用

致病菌通過互相傳遞信息素調(diào)節(jié)自身基因表達(dá)使其黏附、聚集、形成完整生物膜，當(dāng)膜內(nèi)菌種群密度達(dá)到閾值時(shí)細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)（QS系統(tǒng)）會使一部分致病菌從膜內(nèi)脫離.唐婕［16］的研究表明鮑曼不動(dòng)桿菌（AB）的QS 系統(tǒng)由AbaI/AbaR 二組分系統(tǒng)組成，77.5%的臨床株攜帶AbaI 及AbaR 基因，與AB 耐藥顯著相關(guān)且表現(xiàn)出更強(qiáng)的細(xì)胞侵襲能力.PA 的QS 系統(tǒng)包括LasI/LasR 信號系統(tǒng)、RhlR 信號系統(tǒng)與喹諾酮信號分子（PQS），三者相互關(guān)聯(lián)調(diào)控誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞因子，進(jìn)而調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答提高自身生存能力并調(diào)控生物膜黏附、群聚、形成等生物學(xué)行為增加耐藥性［17，18］. 總之，QS系統(tǒng)使致病菌由膜內(nèi)態(tài)轉(zhuǎn)換為浮游態(tài)，導(dǎo)致感染擴(kuò)散或復(fù)發(fā).

1.2.4 激活應(yīng)激反應(yīng)

應(yīng)激反應(yīng)也稱SOS反應(yīng)，指致病菌DNA受到嚴(yán)重?fù)p傷時(shí)多種基因誘導(dǎo)的DNA修復(fù)以維持DNA的完整性.劉敏［19］的PA 抑菌實(shí)驗(yàn)表明，低于MIC 劑量的抗生素在短時(shí)間內(nèi)就會引起PA 的SOS 反應(yīng).其機(jī)制是致病菌DNA受損后與激活蛋白（RecA）結(jié)合，結(jié)合后促使阻遏蛋白（LexA）發(fā)生自我切割，然后SOS 修復(fù)酶類相繼合成，即SOS 反應(yīng)激活一系列基因轉(zhuǎn)錄，使膜內(nèi)細(xì)菌適應(yīng)低營養(yǎng)、低氧濃度、代謝酸性產(chǎn)物堆積的微環(huán)境并維持活力；此外，SOS 反應(yīng)被激活時(shí)亦可增強(qiáng)QS 系統(tǒng)增強(qiáng).總之，激活應(yīng)激反應(yīng)后啟動(dòng)一系列保護(hù)機(jī)制，促進(jìn)生物膜生成，增強(qiáng)膜內(nèi)致病菌耐藥性，不利于根治感染.

1.2.5 啟動(dòng)外排泵系統(tǒng)

外排泵系統(tǒng)是膜內(nèi)致病菌的一種自我保護(hù)手段.趙亞運(yùn)等［20］檢測26株臨床分離的多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌（MDRAB）對18 種常用抗菌藥物的MIC，PCR 擴(kuò)增adeB、adeJ、macB、emrB、abeS、abeM、craA 外排泵基因，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 檢測外排泵基因的mRNA 表達(dá)水平，結(jié)果adeJ和abeM的檢出率達(dá)100%，abes、adeB、craA的檢出率分別為96.15%、92.31%、84.62%，macB、emrB檢出率在80%以上，認(rèn)為外排泵基因可引起B(yǎng)A廣泛的、多重耐藥性.劉獻(xiàn)清等［21］的研究表明BA耐藥結(jié)節(jié)化細(xì)胞分化家族（RND）外排泵基因adeB、adeB-like、adeFGH、adeIJK 對BA 耐藥性具有不同程度影響，其中adeB對BA的耐藥性影響最明顯.總之，外排泵系統(tǒng)通過及時(shí)排除透膜抗菌藥物，避免膜內(nèi)致病菌與之接觸，降低抗菌藥物的殺菌作用，增強(qiáng)膜內(nèi)致病菌的耐藥性.

1.2.6 影響機(jī)體免疫

（1）生物膜基質(zhì)成分遮蓋致病菌相關(guān)分子，使中性粒細(xì)胞無法激活［22］；（2）在有生物膜存在的情況下中性粒細(xì)胞從骨髓或周圍血管中向感染部位遷移的趨化作用減弱［22］；（3）Thurlow 等［23］研究發(fā)現(xiàn)SA生物膜菌株能夠阻斷巨噬細(xì)胞對SA進(jìn)行識別的經(jīng)典Toll樣受體2（TLR2）和TLR9途徑；減少巨噬細(xì)胞炎性介質(zhì)的產(chǎn)生和對生物膜的攻擊；巨噬細(xì)胞誘生一氧化氮合酶（iNOS）表達(dá)下降，反應(yīng)性M2 巨噬細(xì)胞增多但抗菌活性很低.因此，在生物膜存在情況下巨噬細(xì)胞雖仍有一定吞噬能力，但較低的iNOS 表達(dá)說明其對胞內(nèi)致病菌的殺傷能力大大減弱；（4）生物膜的抵抗性使機(jī)體無法識別致病菌表達(dá)的一系列病原相關(guān)分子，使致病菌無法及時(shí)清.總之，生物膜通過抑制、降低相關(guān)免疫細(xì)胞的表達(dá)，降低其對致病菌的殺滅，導(dǎo)致感染遷延不愈；而持續(xù)存在的致病菌刺激機(jī)體免疫，導(dǎo)致過于強(qiáng)烈的促炎反應(yīng)，造成組織損傷［22］.

2 抗菌肽LL-37與生物膜

2.1 抗菌肽LL-37結(jié)構(gòu)及抑制生物膜作用

抗菌肽LL-37是Cathelicidins家族的唯一成員，因包含37個(gè)氨基酸殘基，N端前兩個(gè)氨基酸殘基為亮氨酸（L）而得名組成，分子式為C205H340N60O53，分子量約4.5KD，pH中性條件下帶6個(gè)靜正電荷，中間2～31個(gè)氨基酸形成一個(gè)長的雙親性螺旋結(jié)構(gòu)［24］.其活性片段集中在5～32位的氨基酸殘基部位，30%活性片段是在13位異亮氨酸附近被水解而形成.其二級結(jié)構(gòu)含有75.7%的α螺旋和24.3%的無規(guī)則卷曲，親水性基團(tuán)和疏水性基團(tuán)呈對稱性分布兩側(cè)，C端和N端形成親水性和疏水性區(qū)域［25］.丁靜等［26］運(yùn)用微量肉湯稀釋法測定LL-37對臨床MRSA菌株的MIC為12.5μmol/L；在0.625μmol/L（僅1/20MIC）作用濃度下，LL-37對MRSA臨床株生物膜的抑制活性即為27%，而當(dāng)用藥濃度達(dá)到3.13μmol/L（僅1/4MIC）時(shí)，LL-37對MRSA生物膜形成的抑制率達(dá)63%；激光共聚焦顯微鏡掃描結(jié)果發(fā)現(xiàn)LL-37能減少生物膜成熟，使其結(jié)構(gòu)疏松，厚度為（5±2）μm，僅為對照組1/4，明顯偏薄，有較強(qiáng)的抑制MRSA生物膜形成作用.史鵬偉等［27］的研究也表明抗菌肽LL-37作用后，AB成熟生物膜結(jié)構(gòu)被破壞；當(dāng)LL-37濃度為2.5μg/ml時(shí)即可破壞生物膜結(jié)構(gòu)，且隨著LL-37濃度增加生物膜形成量逐漸減少.總之，抗菌肽LL-37不僅能殺滅浮游態(tài)致病菌還能抑制生物膜的形成、破壞已形成的生物膜，表現(xiàn)出“內(nèi)源性抗菌素”的作用.

2.2 作用機(jī)制

2.2.1 地毯模型機(jī)制

目前較公認(rèn)的LL-37殺菌模式為“地毯模型”［25］.LL-37中間的雙親性螺旋結(jié)構(gòu)在中性PH下帶6個(gè)正電荷.生物膜表面是磷脂的親水頭部與膜外部基質(zhì)接觸，帶負(fù)電荷［28］.在靜電作用下正負(fù)電荷吸引在生物膜表面排列，親水頭部朝向磷脂頭部基團(tuán)，形成“地毯”狀，當(dāng)分子排列達(dá)到飽和后，LL-37發(fā)生轉(zhuǎn)動(dòng)使疏水基朝向膜的磷脂尾部集團(tuán)，破壞脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞膜破裂.毛文超等［28］用分子動(dòng)力學(xué)模擬的方法研究LL-37與帶負(fù)電的POPG膜在原子水平的相互作用，結(jié)果顯示LL-37的核心肽段FK-13（殘基肽段17～29）離膜的質(zhì)心距離從4nm縮小到2.5nm左右，F(xiàn)K-13會自發(fā)插入到膜的頭基部分但并不會較深的插入到膜的內(nèi)部，三維結(jié)構(gòu)圖顯示FK-13會像地毯一樣覆蓋在膜的表面，并有部分殘基插入膜，F(xiàn)K-13保持了部分螺旋構(gòu)象，與上述結(jié)論符合.

2.2.2 擾動(dòng)機(jī)制

Frances Neville 等［29］研究了LL-37 與模擬人類紅細(xì)胞的細(xì)胞膜模型（DPPC、DPPE）、LL-37 與模擬生物膜模型（DPPG）的作用，結(jié)果沒有觀察到LL-37與DPPC、DPPE發(fā)生顯著的相互作用，但觀察到LL-37以“地毯模型”機(jī)制插入到DPPG模型中，提出LL-37破壞生物膜是通過膜擾動(dòng)的“地毯機(jī)制”.所謂膜擾動(dòng)是LL-37 覆蓋生物膜表面，直接導(dǎo)致膜破裂或形成環(huán)形孔.毛文超等［30］觀察FK-13與POPG相互作用前后膜的脂質(zhì)序參數(shù)，該參數(shù)通過脂質(zhì)Sn1鏈中?；湹奶荚拥臄_動(dòng)來表征，可用來描述FK-13在結(jié)合到膜上時(shí)對膜的擾動(dòng)情況，數(shù)值越大說明對膜的擾動(dòng)越大，對膜的破壞就越大.結(jié)果FK-13在未接觸到膜時(shí)的脂質(zhì)序參數(shù)值要顯著小于接觸后的值，說明FK-13在結(jié)合到膜后對膜的擾動(dòng)增加，并產(chǎn)生破壞作用.

2.2.3 跨膜孔洞機(jī)制

Lee等［31］指出，LL-37與生物膜的結(jié)合分兩種情況，其一是以中間的雙親性螺旋結(jié)構(gòu)平行于膜的表面，以“地毯模型”機(jī)制破壞生物膜.其二是LL-37引起跨膜孔的形成，其隨著LL-37雙親性螺旋方向調(diào)整到大致與膜的表面垂直，跨膜孔的半徑為23～33?，形成跨膜孔的條件是雙層膜的間隔大于70?.但Alessio Bonucci 等［32］的研究指出LL-37 與帶負(fù)電膜的相互作用是通過形成穩(wěn)定的類似于環(huán)形孔的聚集體結(jié)構(gòu)，而與中性膜發(fā)生相互作用時(shí)形成更高濃度的低聚物結(jié)構(gòu)，可見其對膜的破壞過程機(jī)制復(fù)雜.

2.2.4 抑制致病菌觸顫活動(dòng)機(jī)制

LL-37 可通過抑制治病菌的觸顫作用來影響生物膜的形成.丁靜等［26］的研究中僅僅1/4MIC 的LL-37 對MRSA 臨床株生物膜的抑制活性即可達(dá)到63%，且可減少生物膜生成，并使膜的結(jié)構(gòu)疏松，厚度變薄，缺少成熟生物膜的特征性結(jié)構(gòu).史鵬偉等［29］的研究與上述結(jié)論類似.有報(bào)道顯示在LL-37作用下表達(dá)下調(diào)的PA基因中存在參與細(xì)菌黏附及與鞭毛生物合成有關(guān)的基因，這些基因的改變影響了PA的觸顫活動(dòng)，從動(dòng)力學(xué)上減少了生物膜的生成、發(fā)展［5］.

綜上，生物膜通過多種因素的協(xié)同作用引起致病菌的耐藥性顯著增加，是造成術(shù)后PJI難治、遷延不愈的重要因素之一，而LL-37亦通過多種機(jī)制發(fā)揮其對生物膜的抑制作用，是治療術(shù)后PJI的可行思路.但PJI 的治療多個(gè)環(huán)節(jié)，LL-37在其中的機(jī)制尚需更進(jìn)一步明確；此外LL-37雖在體外模型中抗菌活性良好，但體內(nèi)模型的安全性乃至更進(jìn)一步作為治療藥物應(yīng)用仍需驗(yàn)證.