馬海芬 肖維華 虞繼紅 余波 蔣茂芬

肝星狀細(xì)胞（HSC）是肝纖維化發(fā)生的關(guān)鍵細(xì)胞，在肝纖維化過(guò)程中對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的生成與降解均有重要的意義。肝內(nèi)參與ECM 降解主要是基質(zhì)金屬蛋白酶類(lèi)（MMPs）。MMPs 是被廣泛認(rèn)為對(duì)基質(zhì)重塑起重要作用的一種I 型膠原酶，在肝纖維化發(fā)生機(jī)制的研究中具有重要意義，在癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中具有重要的地位。成纖維細(xì)胞激活蛋白（fibroblast activation protein，F(xiàn)AP）是一種間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的跨膜絲氨酸蛋白酶，在組織重塑中發(fā)揮重要的作用，現(xiàn)在已經(jīng)成為一個(gè)激活的成纖維細(xì)胞的特異性標(biāo)記物，對(duì)腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移有重要意義。目前國(guó)內(nèi)對(duì)FAP 和MMPs 與纖維化的研究多集中在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及體外培養(yǎng)方面［1］。在人體內(nèi)肝纖維化和肝癌組織中的表達(dá)意義尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究擬檢測(cè)乙肝相關(guān)性肝纖維化和肝癌組織中FAP 和MMP-9 的表達(dá)水平，為肝纖維化的預(yù)防和治療提供理論基礎(chǔ)，并為臨床早期診斷肝癌的發(fā)生與發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集近3 年本院病理證實(shí)肝纖維化的肝穿刺標(biāo)本42 例和肝癌手術(shù)切除標(biāo)本32 例，共74 例入組，血清乙肝表面抗原陽(yáng)性，除外合并HCV、HDV、HIV 等病毒感染，除外自身免疫性肝病、藥物性肝炎等其它可能導(dǎo)致肝實(shí)質(zhì)病變的慢性疾病。肝硬化組織取自距腫瘤邊緣＞1cm。同時(shí)收集非乙肝相關(guān)性肝病組織11 例（包括5 例脂肪性肝病、2 例自身免疫性肝病和3 例原因不明的肝功能異常）和因外傷切除的臨床和病理證實(shí)為正常肝組織的病例13 例作為對(duì)照。乙肝相關(guān)性肝病患者包括男51 例，女23 例；年齡25～82 歲，中位年齡49.5 歲。炎癥分級(jí)和纖維化分期結(jié)合HE 和Masson 染色結(jié)果，按簡(jiǎn)化的慢性肝炎的評(píng)分系統(tǒng)，S0：無(wú)纖維化；S1：匯管區(qū)擴(kuò)大，輕度纖維化；S2：匯管區(qū)周?chē)w維化或纖維分隔形成，但小葉結(jié)構(gòu)保留；S3：纖維化伴小葉結(jié)構(gòu)紊亂，但無(wú)明顯的肝硬化；S4：可能或肯定的肝硬化。74 例患者中S1=18，S2=23，S3=10，S4=23。所有肝癌病例均有詳細(xì)的臨床資料、手術(shù)記錄。術(shù)前未行任何抗腫瘤治療。腫瘤直徑＞3cm 者14 例，≤3cm 者18 例；組織學(xué)分級(jí)顯示高中分化20 例，低分化12 例；伴肝硬化20 例，無(wú)肝硬化12 例。實(shí)驗(yàn)中23 例S4 期標(biāo)本包括穿刺組織3 例和肝癌周?chē)斡不M織20 例。所有標(biāo)本經(jīng)2 名病理主治醫(yī)師復(fù)習(xí)。收集的臨床數(shù)據(jù)包括術(shù)前血清AFP、術(shù)前血清HBV-DNA、腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、分化程度、脈管癌栓等數(shù)據(jù)。

1.2 主要試劑 Fibroblast activation protein（Abcam，ab207178）兔單克隆抗體（稀釋度為1：200）購(gòu)自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司、MMP-9（56-2A4）鼠單克隆抗體（稀釋度為1：100）購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)有限公司；鼠兔通用型二抗PV6000 免疫組化試劑盒（Dako，K5007）購(gòu)自Dako 公司。

1.3 方法 采用免疫組化PV-6000 二步法?；顧z組織經(jīng)石蠟包埋切片，石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化后行免疫組化染色，抗原采用枸櫞酸緩沖液高壓鍋高溫高壓修復(fù)，余步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。用免疫組化方法檢測(cè)組織中FAP 和MMP-9 的表達(dá)水平。陽(yáng)性對(duì)照選用已知陽(yáng)性片，陰性對(duì)照選用因外傷切除的正常組織，并用TBS 代替一抗作陰性試劑對(duì)照。

1.4 陽(yáng)性結(jié)果判斷 肝纖維化組織中FAP 的陽(yáng)性表達(dá)主要分布于門(mén)管區(qū)內(nèi)血管壁周?chē)靶∪~周?chē)w維間隔內(nèi)的成纖維細(xì)胞的胞漿中，MMP-9 的陽(yáng)性表達(dá)也分布于成纖維細(xì)胞的胞漿中，與FAP 表達(dá)重疊的區(qū)域在門(mén)管區(qū)及纖維間隔中。肝癌組織中FAP 的陽(yáng)性表達(dá)分布于枯否細(xì)胞、間質(zhì)成纖維細(xì)胞的胞漿中，MMP-9 的陽(yáng)性表達(dá)主要分布于癌細(xì)胞的胞漿中，間質(zhì)細(xì)胞中有少量表達(dá)。FAP、MMP-9 染色陽(yáng)性物質(zhì)呈黃色、棕黃色細(xì)顆粒狀。免疫組織化學(xué)結(jié)果判定被相對(duì)量化為陽(yáng)性染色間質(zhì)面積和切片中選擇的整個(gè)間質(zhì)區(qū)域的百分比：強(qiáng)陽(yáng)性，＞30%間質(zhì)細(xì)胞中等到強(qiáng)染色；弱陽(yáng)性，5%～30%間質(zhì)細(xì)胞中等到強(qiáng)染色或＞30%弱染色；陰性，＜5%間質(zhì)細(xì)胞染色弱或未著色。強(qiáng)陽(yáng)性染色結(jié)果定義為高表達(dá)，弱陽(yáng)性和陰性染色結(jié)果定義為低表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0 統(tǒng)計(jì)軟件。采用χ2檢驗(yàn)和Fisher 確切概率法，觀察FAP 和MMP-9 兩指標(biāo)在肝纖維化S1-S4 期和肝癌組織中的表達(dá)。FAP 和MMP-9 蛋白的相關(guān)性分析采用Spearman 等級(jí)相關(guān)分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FAP 和MMP-9 在肝纖維化不同分期的表達(dá) 見(jiàn)表1 和圖1。

表l FAP和MMP-9在人乙肝相關(guān)性肝纖維化分期的表達(dá)（n）

圖1 不同分期肝纖維化組織中FAP和MMP-9的表達(dá)（PV-6000二步法×200）。A-C：隨著肝纖維化1-3期進(jìn)展，F(xiàn)AP表達(dá)有增強(qiáng)趨勢(shì)。D：纖維化4期FAP表達(dá)明顯減弱。E-G：隨著肝纖維化1-3期進(jìn)展，MMP-9表達(dá)有增強(qiáng)趨勢(shì)。H：纖維化4期MMP-9表達(dá)明顯減弱。

2.2 FAP 和MMP-9 在肝癌組織中的表達(dá) 32 例肝癌組織中均可見(jiàn)FAP 和MMP-9 的表達(dá)，分布于枯否細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞團(tuán)周?chē)扒忠u前沿的鄰近間質(zhì)。肝癌組織中FAP 和MMP-9 高表達(dá)率分別為50%（16/32），43.8%（14/32）。而肝硬化組織中FAP 和MMP-9 基本上弱表達(dá)或不表達(dá)，其高表達(dá)率僅為3.1%（1/32），6.3%（2/32）。FAP 和MMP-9 在肝癌組織中的表達(dá)顯著高于肝硬化組織（P=0.000）。

2.3 FAP 和MMP-9 在非乙肝相關(guān)性肝病和正常肝組織中的免疫組化結(jié)果 對(duì)照組中11 例非乙肝相關(guān)性肝病的FAP和MMP-9高表達(dá)率分別為54.5%（6/11），9.1%（1/11）。正常肝組織的FAP 和MMP-9 表達(dá)均呈陰性。

2.4 FAP 和MMP-9 表達(dá)與肝癌臨床病理特征的關(guān)系 FAP 的高表達(dá)與肝癌患者的術(shù)前血清AFP、腫瘤數(shù)目、分化程度有關(guān)（P＜0.05），而與術(shù)前血清HBVDNA、腫瘤大小、脈管癌栓和周?chē)斡不療o(wú)關(guān)（P＞0.05）。

2.5 FAP 和MMP-9 表達(dá)的相關(guān)性 Spearman 相關(guān)性分析顯示在人乙肝相關(guān)性肝纖維化和肝癌組織中FAP和MMP-9 的表達(dá)呈正相關(guān)，其中S2 和S4 期中呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。Spearman 相關(guān)性分析顯示在肝癌組織中FAP 和MMP-9 的表達(dá)有相關(guān)性，兩者成正相關(guān)（P＜0.05）。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)人乙肝肝纖維化不同分期中FAP 和MMP-9 表達(dá)強(qiáng)度也有一定規(guī)律。正常肝組織FAP 和MMP-9 表達(dá)呈陰性，肝纖維化期FAP 和MMP-9 有不同程度陽(yáng)性表達(dá)，隨著肝纖維化程度的增加FAP 和MMP-9 表達(dá)均有增強(qiáng)趨勢(shì)。另外，本實(shí)驗(yàn)觀察到在纖維化4 期及肝硬化階段FAP 和MMP-9 表達(dá)均明顯減弱，與近癌周肝纖維化組織的FAP 和MMP-9 有較強(qiáng)的陽(yáng)性表達(dá)形成了鮮明的對(duì)比。

同時(shí)作者發(fā)現(xiàn)在不同分期中MMP-9 的表達(dá)強(qiáng)度和范圍弱于FAP?？紤]這可能與MMPs 隨著纖維化的進(jìn)展，被金屬蛋白酶組織抑制物（TIMP）抑制有關(guān)。因?yàn)樵缬醒芯繄?bào)道，TIMP 是MMP 的特異性抑制因子，以1：1 的比例形成MMP-TIMP 復(fù)合物，從而阻止MMP9 與底物結(jié)合，抑制其降解活性，在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中起負(fù)性調(diào)節(jié)作用［2］。

最近有作者通過(guò)克羅恩病黏膜的研究，觀察了纖維化組織中FAP、MMPs 及TIMP 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)狹窄型黏膜肌成纖維細(xì)胞FAP 表達(dá)上調(diào)，抗FAP 抗體治療狹窄組織時(shí)，膠原蛋白產(chǎn)生劑量依賴(lài)性下降，尤其是對(duì)I 型膠原蛋白的影響。治療還能減少克羅恩病狹窄時(shí)的TIMP-1 的產(chǎn)生，而不會(huì)改變MMP-3 和MMP-12 的分泌。提示了FAP、MMPs 及TIMP 在纖維化中導(dǎo)致平衡改變的作用［3］。

近年來(lái)，隨著腫瘤上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的研究不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)FAP 還表達(dá)于間葉組織來(lái)源的惡性腫瘤細(xì)胞中和上皮源性惡性腫瘤的成纖維細(xì)胞（TAFs）中，幾乎不表達(dá)于正常組織及良性上皮腫瘤間質(zhì)中靜息成纖維細(xì)胞，且罕見(jiàn)于上皮性腫瘤細(xì)胞。Sukowati 等在人肝癌細(xì)胞株HuH-7 和JHH-6 培養(yǎng)中，癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）上調(diào)了TGFB1、FAP 的基因表達(dá)，提示CAF 作為間質(zhì)干細(xì)胞，在肝癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移過(guò)程中與肝癌細(xì)胞相互轉(zhuǎn)換的依據(jù)［4］。

在人肝癌的研究中，張等［5］采用PCR 方法檢測(cè)了33 例肝癌患者的肝癌組織、癌旁組織、遠(yuǎn)隔相對(duì)正常肝組織以及13 例對(duì)照組的FAP mRNA 結(jié)果，均為陽(yáng)性，但肝癌組織FAP mRNA 表達(dá)明顯高于癌旁及其余肝組織。另外，F(xiàn)AP mRNA 隨著肝癌臨床病程的進(jìn)展以及分化程度的下降表達(dá)增多。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化方法檢測(cè)蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示肝癌組織中均可見(jiàn)FAP 和MMP-9 的表達(dá)，且顯著高于周?chē)谓M織。FAP的高表達(dá)與肝癌患者的術(shù)前血清AFP、腫瘤數(shù)目、分化程度有關(guān)。

綜合以上研究結(jié)合文獻(xiàn)，推測(cè)乙肝肝纖維化不同分期中FAP 和MMP-9 的作用機(jī)制。肝損傷早期，位于肝竇周?chē)腍SCs 增殖并激活，F(xiàn)AP 和MMPs 都被誘導(dǎo)表達(dá)。活化的HSCs 分泌多種因子，趨化HSC 向肝損傷部位遷移和增殖。因此，F(xiàn)AP 和MMPs 隨著纖維化發(fā)展表達(dá)增強(qiáng)，中期達(dá)到高峰。在肝纖維化后期包括肝硬化組織，IL-10 通過(guò)下調(diào)炎癥反應(yīng)并增加組織間隙膠原酶的活性，使HSC 趨于靜止?fàn)顟B(tài)，F(xiàn)AP 表達(dá)明顯減弱。因?yàn)镸MPs 能被金屬蛋白酶組織抑制物抑制，所以表達(dá)比FAP 更弱。伴隨肝癌的發(fā)生，肝實(shí)質(zhì)內(nèi)固有的HSCs 被激活，活化HSCs 數(shù)量增多，所以近癌周肝纖維化組織有明顯的FAP 和MMPs 陽(yáng)性表達(dá)。

兩者與肝癌發(fā)展的關(guān)系，目前尚不明確。有研究發(fā)現(xiàn)肝癌組織中HSC 的數(shù)量較正常肝組織明顯增多，且隨HCC 進(jìn)展，其數(shù)量逐漸增多。HSC 可能通過(guò)分泌FAP 間接促進(jìn)肝癌的發(fā)生與轉(zhuǎn)移。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)敲除FAP 基因可以間接抑制腫瘤生長(zhǎng)［6］。Huang 等［7］在乳腺癌體外研究發(fā)現(xiàn)，表達(dá)野生型FAP 或FAP（S624A）的細(xì)胞能更廣泛地降解細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），積累更高水平的MMP-9，更易侵襲I 型膠原。因此得出結(jié)論：FAP 的蛋白水解活性參與基質(zhì)降解，但蛋白的其他功能促進(jìn)腫瘤的增長(zhǎng)。另有研究發(fā)現(xiàn)在肝硬化和肝癌組織中，實(shí)質(zhì)-間質(zhì)界面附近的肝細(xì)胞中神經(jīng)肽Y 及其受體Y2R 增加，有機(jī)會(huì)與附近活化的間充質(zhì)細(xì)胞中的FAP 相互作用。新發(fā)現(xiàn)提示了FAP 的底物特異性，揭示了FAP 在肝臟神經(jīng)肽調(diào)節(jié)和癌癥生物學(xué)中的潛在功能。

綜上所述，F(xiàn)AP 和MMP-9 可能協(xié)同促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的活化，參與降解細(xì)胞外基質(zhì)，從而促進(jìn)肝纖維化和肝癌的發(fā)生發(fā)展。因此通過(guò)對(duì)FAP 和MMPs 的進(jìn)一步研究，有望以HSCs 為靶標(biāo)，為治療人乙肝相關(guān)肝纖維化和早期阻止肝癌侵襲轉(zhuǎn)移提供新的理論依據(jù)。