曹 猛，王盛林，劉平懷，潘孝妍，王秀海

( 海南大學 化學工程與技術學院，海南 ?？?570228 )

柵藻[Scenedesmus(Desmodesmus)armatus]作為微藻中的一類，又稱柵列藻，屬綠藻門、綠球藻目、柵藻科、柵藻屬。細胞常為橢圓形或紡錘形，以長軸排成1～2列或多列。細胞壁薄、光滑，或有顆粒、細齒、隆起線和刺等特殊構造[1]。柵藻中含有類胡蘿卜素、不飽和脂肪酸等功能性物質(zhì)[2]，為對環(huán)境污染耐受性較高的微藻。在適合的培養(yǎng)條件下還可獲得生物柴油、蛋白質(zhì)等高附加值產(chǎn)品。柵藻是研究水體污染的一種很好的試驗材料，是有機污水氧化塘生物相中的優(yōu)勢種類。柵藻進行光合作用時，一方面產(chǎn)生氧氣供細菌分解有機質(zhì)的需要，另一方面還可直接利用有機質(zhì)作為碳源和氮源，使水中有機物迅速降解，從而凈化水體[3]。針對柵藻的研究，目前主要集中于柵藻生長條件[4-6]、基因工程[7]及應用方面。凌善鋒等[8]考察了用紫外輻射和亞硝基胍復合脅迫的方法培育產(chǎn)蝦青素的斜生柵藻(S.obliguus)藻種，用于動物飼料的開發(fā)利用。Ho等[9]利用分離得到的7株斜生柵藻處理污水，氮去除效果顯著，去除率超過70%。在柵藻蛋白質(zhì)方面，目前的研究主要在蛋白質(zhì)的提取工藝[10-11]，包括液氮研磨破碎細胞法和超聲細胞破碎法等，而對柵藻蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值評價的研究較少。本研究對柵藻B38進行全營養(yǎng)素分析，通過必需氨基酸指數(shù)、必需氨基酸比值、氨基酸比值系數(shù)、比值系數(shù)分、貼合度等進行蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值評價，為該藻的綜合利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

試驗所用藻種由海南熱帶淡水區(qū)域分離所得的柵藻B38。

1.1.2 儀器設備

TU-1810紫外—可見分光光度計(北京普析有限責任公司)、TDL-5型離心機(常州中捷有限公司)、X0-5200DTD型超聲清洗儀(南京先歐有限公司)、HP6890型氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國惠普公司)、Waters 2695型液相色譜儀(美國Waters公司)、X7型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(美國熱電公司)、A320型電子順磁共振波譜儀(德國布魯克公司)

1.2 試驗方法

1.2.1 基本營養(yǎng)成分測定

分別參照測定柵藻中蛋白質(zhì)[12]、油脂[13]、灰分[14]、粗纖維[15]、水分[16]和總糖[17-18]的含量。

1.2.2 脂肪酸分析

樣品前處理參照文獻[19]的方法并加以改進，取藻粉0.5 g，加入0.5 mol/L的氫氧化鈉—甲醇溶液5 mL，振蕩混合10 min后加入1%硫酸—甲醇溶液8 mL，振蕩混合10 min，再依次加入2 mL水和3 mL正己烷，離心收集上層溶液，重復萃取3～5次，合并上層溶液，待溶液揮發(fā)濃縮至約1 mL用0.22 μm微孔濾膜過濾，置于氣相色譜樣品管中，封口待測。

氣相條件：色譜柱Agilent HP-5MS 5% Phenyl Methyl Silox 0～325 ℃(325 ℃),30 m×250 μm×0.25 μm,進樣口溫度,280 ℃；載氣,He；柱流量,2.25 mL/min；分流比，20∶1。質(zhì)譜條件，EI源；電離電壓，70 ev；離子源溫度，230 ℃；掃描范圍，10～500 amu；進樣量，1.0 μL。

1.2.3 氨基酸分析

1.2.3.1 樣品處理與測定

稱取試驗所用柵藻樣品2 g，向其中添加20 mL磺基水楊酸(10%)，用超聲波細胞破碎儀低溫下超聲處理后，4 ℃靜置15～17 h，5000 r/min離心10 min，取上清液，調(diào)整pH值至6.0，并用超純水定容至50 mL，取2 mL濾液用0.22 μm微孔濾膜過濾，置于樣品管中備用[19]。

色譜條件：色譜柱Agilent100 C18，4.0×125 mm；柱溫，40 ℃；流速，1.0 mL/min；波長，338 nm，262 nm；流動相A，20 mmol醋酸鈉液；流動相B，20 mmol醋酸鈉液∶甲醇∶乙腈=1∶2∶2(體積比)。

1.2.3.2 營養(yǎng)價值評價

將樣品中的必需氨基酸分別與聯(lián)合國糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織必需氨基酸模式[20]和全雞蛋蛋白模式[21]進行比較，按下式計算藻株中的必需氨基酸指數(shù)(EAAI)[22]、必需氨基酸比值(AAS)[23-24]、氨基酸比值系數(shù)(RC)[25]、比值系數(shù)分(SRC)[26]、貼合度[27]。

(1)必需氨基酸指數(shù)

式中，EAAI為必需氨基酸指數(shù)，uk為樣品中第k種必需氨基酸含量，Ak為雞蛋蛋白中相應的第k種必需氨基酸含量。

(2)氨基酸比值

式中，AASk為氨基酸比值(1≤k≤8)，uk為樣品中對應的第k種必需氨基酸含量，ak為標準蛋白模式的第k種必需氨基酸含量。

該比值的意義是一定量食物中的氨基酸含量，相當于模式氨基酸的多少倍。由于各氨基酸的比值不會相同，因此可計算各氨基酸比值之均數(shù)，表示食物中氮基酸含量是模式氨基酸的多少倍。

(3)氨基酸比值系數(shù)

式中，RCk為氨基酸比值系數(shù)(1≤k≤8)，AASk為樣品中第k種必需氨基酸的氨基酸比值，AAS為樣品中必需氨基酸比值的平均值。

(4)比值系數(shù)分

SRC=100-RSD×100

式中，SRC為待測物質(zhì)的氨基酸比值系數(shù)分，RSD為待測物質(zhì)RC的相對標準差。

(5)貼近度：待評價物質(zhì)的氨基酸品質(zhì)與模式蛋白的接近程度，其值越接近1，反映物質(zhì)的蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值越高。

式中，Uk(a,u)為貼近度(1≤k≤8)，ak為標準蛋白模式的第k種必需氨基酸含量，uk為樣品中對應的第k種必需氨基酸含量。

1.2.4 微量元素及重金屬測定

稱取樣品0.2 g干燥后的藻粉于消解內(nèi)罐中，加入5 mL硝酸和2 mL過氧化氫，蓋好內(nèi)蓋，放置1 h，旋緊不銹鋼外套，放入恒溫干燥箱120 ℃消解2 h后160 ℃繼續(xù)消解4 h，在箱內(nèi)自然冷卻至室溫，然后緩慢旋松不銹鋼外套，將消解內(nèi)罐取出，用少量水沖洗內(nèi)蓋，超聲脫氣2～5 min去除棕色氣體。將消化液轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，并定容至刻度，取2 mL用0.22 μm微孔濾膜過濾待測，同時作試劑空白試驗。

采用電感耦合等離子質(zhì)譜的方法，對柵藻B38中銅、鋰、鎂、錳、鋅、鈣等30種微量元素進行定量分析。工作參數(shù)見表1。

1.2.5 維生素的測定

分別參照國家標準測定柵藻中的維生素A、E[28]，維生素B1[29]，維生素B2[30]，維生素B3[31]，維生素B6[32]，維生素B12[33]，維生素C[34]的含量。

2 結果與分析

2.1 柵藻的一般營養(yǎng)成分

試驗所用柵藻B38的能量為1579.59 kJ(表2)，除低于大豆1632.15 kJ的能量外，均高于表2中所列出的其他幾種食物，其中包括多種藻類物質(zhì)，如螺旋藻(Spirulinasp.)能量為1536.73 kJ，膠網(wǎng)藻(Dictyosphaeriumsp.)能量為1552.64 kJ，而裙帶菜能量僅為838.38 kJ。柵藻B38蛋白質(zhì)含量為49.0%，除低于螺旋藻蛋白質(zhì)含量(69.30%)外，顯著高于小麥粉(11.2%)、雞蛋(13.3%)，且比作為高蛋白質(zhì)食物的大豆(35.0%)高出14%的含量，此外比同屬藻類的苔菜(Enteromorphaprolifera)(19.0%)蛋白質(zhì)含量高出30%，高于膠網(wǎng)藻(18.55%)和裙帶菜(Undariapinnatifida)(16.0%)約30%。柵藻B38藻粉中油脂含量(14%)接近大豆中含量(16.0%)，高于螺旋藻(5.36%)，總糖含量(13.86%)高于螺旋藻(10.44%)。其粗纖維(3.52%)相比于膠網(wǎng)藻(12.31%)、裙帶菜(9.0%)、大豆(15.5%)、苔菜(干)(9.1%)較低，灰分(4.28%)也明顯低于膠網(wǎng)藻(12.43%)、裙帶菜(29.9%)、苔菜(干)(30.6%)，但接近與螺旋藻中的灰分含量(4.20%)。

表1 ICP-MS工作參數(shù)Tab.1 Operating parameters of ICP-MS

2.2 柵藻脂肪酸組成及其含量

柵藻B38含有脂肪酸種類多達23種，多不飽和脂肪酸含量占47.57%(表3)。其中十六碳的不飽和脂肪酸較多，且十六碳三烯酸(18.77%)占總不飽和脂肪酸的39.46%。此外，十六碳二烯酸(7.61%)、十六碳三烯酸(18.77%)、十六碳四烯酸(7.99%)和亞油酸含量(12.45%)占比較高，棕櫚酸占比為36.14%。

2.3 氨基酸測定

柵藻B38氨基酸總量為852.58 mg/g(每克蛋白質(zhì)中氨基酸的毫克數(shù))，必需氨基酸總量(404.51 mg/g)占總氨基酸的47.45%(表4)，其中蘇氨酸和亮氨酸相對含量較高，分別為75.51 mg/g和63.06 mg/g。非必需氨基酸總量(448.07 mg/g)占比52.55%，其中谷氨酸含量(143.27 mg/g)最高，組氨酸含量(21.73 mg/g)最低。鮮味氨基酸(195.31 mg/g)占比22.91%。必需氨基酸指數(shù)為85.42%。

表2 柵藻B38與其他食物的一般營養(yǎng)成分含量(以每100 g可食部計算)Tab.2 Approximate nutrient content of B38 and other foods (per 100 g edible portion calculated)

注：*.數(shù)據(jù)來自文獻[19，35]；—.表示未檢出或含量很少.

Note: *.data are derived from the reference [19,35]; —.no detectable or very low content.

表3 柵藻B38脂肪酸組成及含量 %Tab.3 Fatty acid composition and content of B38

注：—.未檢出或含量很少;*.單不飽和脂肪酸；#.多不飽和脂肪酸.

Note: —.undetected or low content; *.monounsaturated fatty acids; #.polyunsaturated fatty acids.

表4 柵藻B38的氨基酸組成及含量 mg/gTab.4 Amino acid composition and content of B38

注：*.必需氨基酸；#.鮮味氨基酸.

Note: *.essential amino acids; #.flavor amino acids.

聯(lián)合國糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織模式的氨基酸比值中，除蘇氨酸(1.89)和色氨酸(2.06)較高外，其余值均在1附近；氨基酸比值系數(shù)為0.72～1.64，其中蘇氨酸和色氨酸大于1，表明此兩種必需氨基酸相對過剩(表5)。此模式下比值系數(shù)分為65.68，貼合度為0.93。全雞蛋蛋白模式氨基酸比值中，除蘇氨酸(1.61)和色氨酸(1.21)大于1外，其他的值均在0.70附近。氨基酸比值系數(shù)為0.75～1.75，相對于聯(lián)合國糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織模式波動較大，此模式下比值系數(shù)分為65.13，貼合度為0.88。

2.4 微量元素及重金屬測定

礦物質(zhì)元素是構成機體組織的重要成分，具有維持機體的酸堿平衡及組織細胞滲透壓等作用。由表6可見，從柵藻中共檢測出23種礦物質(zhì)元素，其中鈉、鉀、鈣、鎂、鐵、鋁含量較為豐富，分別為4582.500、4552.833、4549.416、2514.049、560.583、475.283 mg/kg。重金屬鉛、鎘、汞、砷、錫、鎳、鉻的含量分別為0.682、0.047、0.021、0.080、1.619、0.840、0.420 mg/kg，均處于食品安全國家標準的安全范圍[36]。

表5 必需氨基酸比值、氨基酸比值系數(shù)、比值系數(shù)分及貼合度的計算Tab.5 Comparison of AAS, RC and SRC of essential amino acids and calculation of fit degree

表6 柵藻B38礦物質(zhì)元素種類及含量 mg/kgTab.6 Kind and content of mineral elements in B38

注：—.未檢出或含量很少,下同.

Note: —.undetected or low content，et sequentia.

2.5 柵藻中的維生素

由表7可見，柵藻B38中含有水溶性維生素B2、B3和脂溶性維生素E，且其中維生素B3(106.02 mg/100 g)和維生素E(540.77 mg/100 g)的量較高。

3 討 論

3.1 一般營養(yǎng)成分

柵藻B38含油脂較少，而蛋白質(zhì)(49.0%)含量較高，其蛋白質(zhì)含量相較于樊星等[10]提取油脂后藻渣中的蛋白質(zhì)含量(41.05%)高出約8%。本研究中所測得的蛋白質(zhì)含量為所收獲的藻粉原樣，而在Yang等[37]的研究中所用的柵藻為提取油脂后的藻渣，其蛋白質(zhì)含量為32.4%，柵藻B38高出其約17%，可見柵藻B38蛋白含量豐富，更具開發(fā)價值。蛋白質(zhì)作為維持養(yǎng)殖對象生長和生命活動的主要功能性物質(zhì)[38]，在動物養(yǎng)殖方面需求較大。在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面作為蛋白質(zhì)重要來源的魚粉，其也制約著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展，減少對其的使用可降低飼料成本。柵藻B38作為蛋白質(zhì)含量豐富的藻株，可考慮將進一步開發(fā)作為飼料蛋白源使用。陳曉清等[39]研究發(fā)現(xiàn)，所用兩種藻的蛋白質(zhì)與多糖提取物可不同程度地抑制細菌和真菌活性，且其中蛋白質(zhì)提取物對真菌的抑制作用大于對細菌的抑制作用。本研究只針對其各種基本營養(yǎng)素含量做了測定，由于其蛋白質(zhì)含量較高，可對其生物活性等作進一步研究，開發(fā)其利用價值。

表7 柵藻B38維生素含量 mg/100 gTab.7 Vitamin content of B38

3.2 脂肪酸組成及其含量

柵藻的脂肪酸組成中，23種不飽和脂肪酸含量占49.28%，其中單不飽和脂肪酸占總體脂肪酸的1.71%，多不飽和脂肪酸占總體的47.57%，由此可以看出其不飽和脂肪酸豐富。在脂肪酸中，亞油酸含量(12.45%)較高，其在降低膽固醇方面有重要的作用，它通過影響磷脂酰膽堿的重建來降低膽固醇的含量[40]。此外有研究表明，一定含量的亞油酸可促進肝星狀細胞增殖[41]。

3.3 氨基酸組成及評價

組成蛋白質(zhì)的氨基酸中，必需氨基酸的量與食物營養(yǎng)價值關系密切相關，其與人體必需氨基酸的組成比例接近程度決定其被吸收利用程度，因此其營養(yǎng)方面的價值更凸顯[42-43]。柵藻B38中氨基酸總含量為852.58 mg/g，其中必需氨基酸占氨基酸總量的47.45%，必需氨基酸與非必需氨基酸之比為90.28%，顯著高于萱藻(Scytosiphonlomentaria)(必需氨基酸占氨基酸總量的36.11%，必需氨基酸與非必需氨基酸之比56.51%)、囊藻(Colpomeniasinuosa)(必需氨基酸占氨基酸總量的37.18%，必需氨基酸與非必需氨基酸之比59.20%)、江蘺(Gracilaria)(必需氨基酸占氨基酸總量的39.06%，必需氨基酸與非必需氨基酸之比64.11%)、叉枝藻(Ahnfeltiopsisparadoxa)(必需氨基酸占氨基酸總量的34.11%，必需氨基酸與非必需氨基酸之比51.74%)[44]。聯(lián)合國糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織提出的理想蛋白質(zhì)條件：必需氨基酸總量與氨基酸總量之比為40%，必需氨基酸總量與非必需氨基酸總量之比為60%[45]。由此可見，柵藻符合標準。其中必需氨基酸與非必需氨基酸總量之比遠遠大于參考值，說明柵藻B38營養(yǎng)價值高。柵藻B38中鮮味氨基酸的含量為22.91%，說明試驗所用微藻味道鮮美。作為鮮味氨基酸，有研究表明，谷氨酸可經(jīng)一些途徑轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)，在緩解應激方面具有較大的作用[46]，而天冬氨酸可以改善腸道結構和功能[47]。必需氨基酸指數(shù)為85.42%。根據(jù)胡國宏等[48]利用必需氨基酸指數(shù)評價飼料原料的標準：必需氨基酸指數(shù)≥90%的為優(yōu)質(zhì)蛋白源，必需氨基酸指數(shù)在80%～90%的為良好蛋白源，必需氨基酸指數(shù)在70%～80%的為可用蛋白源，必需氨基酸指數(shù)<70%的為不適蛋白源。由此可見，本研究飼料中所用的微藻是一種良好的蛋白源。在與聯(lián)合國糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織模式和全雞蛋蛋白模式比較時發(fā)現(xiàn)，兩種模式下的第一限制性氨基酸分別為亮氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。兩種模式的比值系數(shù)分較接近，均在65以上；待評價物質(zhì)的氨基酸品質(zhì)與模式蛋白貼近度接近1，尤其是聯(lián)合國糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織模式，反映物質(zhì)的蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值較高。

3.4 微量元素及重金屬含量

礦物質(zhì)元素是構成機體組織的重要成分，具有維持機體的酸堿平衡及組織細胞滲透壓等作用。本研究所用柵藻共檢測出23種礦物質(zhì)元素，其中鈉、鉀、鈣、鎂、鐵、鋁含量為475～4600 mg/kg，而這些元素在動植物生長過程中起著重要的作用，飼料中鈣的含量會影響對其他礦物質(zhì)的吸收[49]，而飼料中鎂含量高有利于飼養(yǎng)動物對血清離子的調(diào)節(jié)[50]。柵藻B38中的微量元素含量與林建云等[51]所研究的幾種藻相差較小，試驗所用柵藻B38中重金屬元素含量均未超標。

3.5 維生素含量

B族維生素在生物代謝過程中有重要作用，主要是在鎮(zhèn)痛方面，臨床上用于輔助治療多種慢性疼痛[52]。作為機體內(nèi)的脂溶性維生素，維生素E在免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)[53]、抗氧化[54]和維持生育[55]等方面有重要的作用。柵藻B38中含有豐富的維生素B3和維生素E，由此看來有一定利用價值。