王愛媛，鄭立新，蒲文淵，楊 諾，曾紀(jì)鋒，郭桂英，李 遷，鄭繼平

( 1.海南大學(xué) 生命科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，海南 ?？?570228； 2.海南大學(xué) 校醫(yī)院，海南 ?？?570228； 3.海南大學(xué) 教務(wù)處，海南 ?？?570228； 4.海南大學(xué) 網(wǎng)絡(luò)與教育技術(shù)中心，海南 ?？?570228 )

無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)屬革蘭氏陽性菌，會(huì)對(duì)人類和動(dòng)物造成嚴(yán)重的侵入性感染。無乳鏈球菌不僅可引起人類腦膜炎、肺炎，新生兒敗血癥等，也會(huì)引起豬、牛、魚等動(dòng)物的鏈球菌病，這主要是因?yàn)樵摼哂卸喾N毒力因子，使其能夠在宿主中定殖，逃避宿主吞噬從而大量繁殖[1]，具有較高的致病性和致死性。高晶等[2]發(fā)現(xiàn)，該菌對(duì)紅霉素、左氧氟沙星、四環(huán)素、呋喃妥因等的耐藥率呈逐年上升趨勢(shì)，在健康婦女人群中帶菌率高達(dá)15%～35%，這大大增加了新生兒染病的風(fēng)險(xiǎn)；無乳鏈球菌還通過引起奶牛乳房炎導(dǎo)致產(chǎn)奶下降，通過感染魚類腦部、眼部、肝臟和脾臟等導(dǎo)致魚類死亡，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)和魚類養(yǎng)殖業(yè)造成重大損失[3-4]。王蓓等[5]連續(xù)兩年對(duì)華南地區(qū)患病莫桑比克羅非魚(Oreochromismossambicus)進(jìn)行采樣，確認(rèn)無乳鏈球菌是華南地區(qū)羅非魚鏈球菌病的主要病原之一，證明無乳鏈球菌對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物具有嚴(yán)重危害性。該菌毒力、耐藥性復(fù)雜多變，受地區(qū)、環(huán)境等因素變化影響明顯，為降低其危害，探明其致病機(jī)理，研究毒力因子，篩查其耐藥性必不可少。

為更全面地了解無乳鏈球菌的特性，本實(shí)驗(yàn)室自海南地區(qū)的人、羅非魚和奶牛源病料中分離到191株菌。經(jīng)鑒定，其中18株為無乳鏈球菌。本研究?jī)?nèi)容主要是對(duì)18株無乳鏈球菌進(jìn)行毒力基因和耐藥基因的檢測(cè)以及藥物敏感性測(cè)定，對(duì)防治無乳鏈球菌病具有參考意義。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

腦心浸出液培養(yǎng)基為英國(guó)OXOID公司產(chǎn)品；抗菌藥物藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(Bacterial DNA Isolation Kit)購自北京華越洋生物科技有限公司；2×F8 Fast Long PCR Master mix，DL2000 DNA Marker均為北京艾德萊生物科技有限公司產(chǎn)品；瓊脂糖為法國(guó)Biowest公司產(chǎn)品。

1.2 乳鏈球菌菌株

試驗(yàn)用4株人源無乳鏈球菌分離于海南大學(xué)校醫(yī)院婦產(chǎn)科中患婦科疾病女性的陰道和肛門分泌物樣品；14株羅非魚源無乳鏈球菌，其中8株無乳鏈球菌分離于患病羅非魚腦部，6株菌分離于眼部，發(fā)病羅非魚樣品來自海南省海口市澄邁羅非魚養(yǎng)殖場(chǎng)以及海南大學(xué)東坡湖。

1.3 提取基因組

利用細(xì)菌基因組提取試劑盒對(duì)18株無乳鏈球菌基因組進(jìn)行提取，通過NanoPhotometer儀器檢測(cè)基因組的含量和純度，然后保存于-20 ℃中。

1.4 毒力基因的檢測(cè)

將得到的18株無乳鏈球菌分別進(jìn)行14種毒力基因的檢測(cè)，毒力基因引物參考文獻(xiàn)[6-14](表1)。14種毒力基因分別為：黏附和毒力蛋白A基因(pavA)、C5α肽酶基因(scpB)、表面蛋白R(shí)ib基因(rib)、β-C蛋白基因(bac)、β-溶血素/溶細(xì)胞素基因(cylE)、α-C蛋白基因(bca)、CAMP因子基因(cfb)、層黏連蛋白結(jié)合蛋白基因(lmb)、透明質(zhì)酸酶基因(hylB)、纖維蛋白結(jié)合蛋白A基因(fbsA)、細(xì)菌免疫原性黏附素基因(bibA)、冷休克蛋白A基因(cspA)、表面免疫原性蛋白基因(sip)、侵襲相關(guān)基因(iagA)。

1.5 耐藥基因的檢測(cè)

將得到的18株無乳鏈球菌分別進(jìn)行13種耐藥基因的檢測(cè)，耐藥基因引物參考文獻(xiàn)[14-17](表2)。13種耐藥基因分別為：磺胺類抗生素耐藥基因sul1、sul2；氨基糖苷類藥物耐藥基因aacC2、aacC4；鏈霉素類藥物耐藥基因aadA；紅霉素藥物耐藥基因ermA、ermB；氟喹諾酮類耐藥基因gyrA、parC；四環(huán)素類藥物耐藥基因tetA、tetM；β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥基因pbp1A、pbp2B。

表1 無乳鏈球菌毒力基因引物Tab.1 Primers of virulence genes of S. agalactiae

表2 無乳鏈球菌耐藥基因引物Tab.2 Primers of drug resistance genes of S. agalactiae

1.6 藥敏試驗(yàn)

通過紙片擴(kuò)散法(Kirby-Bauer法)對(duì)18株無乳鏈球菌進(jìn)行藥物敏感測(cè)定，通過產(chǎn)生的抑菌圈直徑大小判定病原菌對(duì)藥物的敏感性，根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室藥敏操作標(biāo)準(zhǔn)[18]可分為耐藥、中度敏感和高度敏感。

2 結(jié) 果

2.1 毒力基因的鑒定結(jié)果

將18株無乳鏈球菌分別進(jìn)行14種毒力基因的PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)人源和魚源菌株中pavA、scpB、cylE、bca、cfb、hylB、fbsA、bibA、cspA、sip、iagA基因的發(fā)生頻率均為100%。其中，人源菌株中未檢測(cè)到bac基因，而魚源菌株中檢測(cè)率為100%；rib基因在人源菌株中檢測(cè)率為100%，在魚源中則為71.4%；lmb基因在人源菌株中陽性率為75%，魚源中則為50%(表3)。

2.2 耐藥基因的鑒定結(jié)果

將18株無乳鏈球菌分別進(jìn)行13種耐藥基因的PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)人源和魚源無乳鏈球菌中氟喹諾酮類耐藥基因gyrA、parC以及β-內(nèi)酰胺類耐藥基因pbp1A、pbp2B陽性率均為100%；磺胺類耐藥基因sul1、sul2陽性檢出率為55.6%～72.2%，其中魚源(64.3%～71.4%)的概率比人源(25%～75%)偏高；同樣，鏈霉素類耐藥基因aadA和紅霉素類耐藥基因ermA、ermB陽性率均較高，分別是83.3%和88.9%～100%，相比來看魚源檢出概率(78.6%～100%)比人源(50%～100%)高；而氨基糖苷類耐藥基因aacC2、aacC4和四環(huán)素類耐藥基因tetA、tetM在人源和魚源病原菌中均未檢測(cè)到(表4)。

表3 毒力基因鑒定結(jié)果 %Tab.3 Identification results of virulence genes

表4 耐藥基因鑒定結(jié)果 %Tab.4 Identification results of drug resistance genes

2.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

本次藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離得到的18株無乳鏈球菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素具有較高的耐藥性，其中對(duì)青霉素G具有100%耐藥率；同樣，這些無乳鏈球菌對(duì)于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素(66.7%～83.3%)以及林可胺類抗生素(100%)的耐藥率較高，其中人源菌株比魚源菌株耐藥率要高；相反，無乳鏈球菌菌株對(duì)于氨基糖苷類抗生素(61.1%～100%)、喹諾酮類抗生素(72.2%～100%)、四環(huán)素類抗生素(100%)以及復(fù)方新諾明(100%)、多黏菌素B(66.7%)則具有高度敏感性，總體上人源菌株比魚源菌株敏感率高(表5)。

表5 無乳鏈球菌的藥敏試驗(yàn) %Tab.5 Drug susceptibility test of S. agalactiae

(續(xù)表5)

藥品名稱Drug藥敏程度Drug sensitivity敏感Sensitivity中度敏感Medium sensitivity耐藥Resistance氧氟沙星Ofloxacin人源Human100.0魚源Tilapia71.477.80.028.622.20.00.00.0諾氟沙星Norfloxacin人源Human100.0魚源Tilapia64.372.20.035.727.80.00.00.0林可霉素Lincomycin人源Human0.0魚源Tilapia0.00.00.00.00.0100.0100.0100.0四環(huán)素Tetracycline人源Human100.0魚源Tilapia100.0100.00.00.00.00.00.00.0復(fù)方新諾明Trimethoprim and sulphame-thoxazole人源Human100.0魚源Tilapia100.0100.00.00.00.00.00.00.0多黏菌素BPolymyxin B人源Human75.0魚源Tilapia64.366.725.021.422.20.014.311.1

3 討 論

3.1 無乳鏈球菌毒力基因檢測(cè)分析

本次研究中，對(duì)18株無乳鏈球菌進(jìn)行PCR檢測(cè)毒力基因發(fā)現(xiàn)，人源和魚源中pavA、scpB、cylE、bca、cfb、hylB、fbsA、bibA、cspA、sip、iagA基因的發(fā)生頻率均為100%。其中β-C蛋白基因(bac)作用是與免疫球蛋白A結(jié)合，與免疫逃避有關(guān)，在人源菌株中陽性率為0%，而魚源中卻是100%。有研究報(bào)道[2,19]，在巴西、伊朗分離的人源菌株中測(cè)得bac基因陽性檢出率分別為7.3%和4.9%。對(duì)比本次研究結(jié)果可知，bac基因可能并未在本次采集的人源病料的發(fā)病原中發(fā)揮作用。目前，已有研究發(fā)現(xiàn)[2,19-20]，在人源無乳鏈球菌中，hyl、scpB、bca等毒力基因陽性檢測(cè)率均在76.8%以上；在魚源無乳鏈球菌中，Kayansamruaj等[21]在泰國(guó)檢測(cè)到cylE、hylB、bibA、fbsA 4種毒力基因陽性率為100%，但scpB和lmb基因陽性率僅為5%；Liu等[22]在巴西和洪都拉斯采集的魚源無乳鏈球菌中檢測(cè)到cylE、bca基因陽性率高達(dá)50%。而在本次試驗(yàn)中十幾種重要毒力因子陽性檢出率高達(dá)100%，且人源和魚源菌株中個(gè)別毒力因子攜帶率不同，已有研究鮮有報(bào)道。本次研究中的分離菌株均攜帶有多種毒力因子，其存在無疑會(huì)增強(qiáng)病原菌毒力，此次結(jié)果對(duì)于無乳鏈球菌的研究具有一定的參考意義。

3.2 無乳鏈球菌耐藥特性分析

將耐藥基因鑒定結(jié)果和藥物敏感性的篩查結(jié)果比較，發(fā)現(xiàn)總體上耐藥基因檢出概率高，則對(duì)應(yīng)藥敏檢測(cè)的耐藥率偏高；耐藥基因檢出率低，則藥敏檢測(cè)的敏感率偏高。但從個(gè)體菌株進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)并不是嚴(yán)格對(duì)應(yīng)的，例如β-內(nèi)酰胺類耐藥基因陽性率為100%，但對(duì)應(yīng)的頭孢氨芐抗生素耐藥率僅為50.0%，并非全部耐藥。這可能與機(jī)體內(nèi)復(fù)雜的作用機(jī)制有關(guān)，一些耐藥基因存在但不一定被表達(dá)。目前大多研究推薦青霉素等β-內(nèi)酰胺類藥物作為治療無乳鏈球菌的一線藥物，在國(guó)內(nèi)的北京、上海、武漢等地區(qū)[23-24]還有國(guó)外的伊朗[2]、美國(guó)[25]、葡萄牙[26]等地，都普遍發(fā)現(xiàn)人源無乳鏈球菌對(duì)青霉素敏感。但隨著抗生素的大量使用，已有研究者發(fā)現(xiàn)青霉素耐藥菌株[27-28]。本次分離得到的無乳鏈球菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥率較高，相比魚源菌株比人源菌株的耐藥率還要高；而紅霉素作為二線藥物，有研究[24-25]發(fā)現(xiàn)，近年來耐藥率逐漸上升，本次研究得到的紅霉素耐藥率高達(dá)66.7%，這與已有的研究結(jié)果一致。耐藥情況的出現(xiàn)可能與臨床藥物的濫用從而導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生不同程度的耐藥性有關(guān)，因此，臨床應(yīng)加強(qiáng)對(duì)無乳鏈球菌的流行病學(xué)及耐藥情況監(jiān)測(cè)，選擇合理有效的抗菌藥物。

4 結(jié) 論

本次采集的病料中的人源和魚源無乳鏈球菌中毒力因子檢出率較高，對(duì)于臨床首選藥物青霉素、紅霉素等具有耐藥性，但對(duì)四環(huán)素、喹諾酮類藥物敏感，推測(cè)這與當(dāng)?shù)乜咕幬镩L(zhǎng)時(shí)間的使用會(huì)導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生不同程度的耐藥性有關(guān)。本研究結(jié)果對(duì)防控?zé)o乳鏈球菌感染、臨床治療具有參考意義。