李 坤 峰， 孫 西 同， 李 僉， 石 峰，徐 杰， 羅 健， 田 晶， 費 旭

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院， 遼寧 大連 116034；2.中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所， 遼寧 大連 116023；3.大連工業(yè)大學(xué) 實驗儀器中心， 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

柑橘類飲料目前在市面上較為常見，而在加工生產(chǎn)時會遇到一個難題，果汁中會產(chǎn)生一種獨特的苦味，在一定程度上影響其品質(zhì)和風(fēng)味，這種主要的苦味物質(zhì)是柚皮苷[1]。去除苦味的方式很多，較為常見的是采用柚苷酶進(jìn)行生物降解處理，目前工業(yè)化生產(chǎn)的酶制劑過程復(fù)雜且價格昂貴，阻礙了一系列的產(chǎn)業(yè)發(fā)展。有相關(guān)文獻(xiàn)報道，柚苷酶目前主要由微生物發(fā)酵獲得，國內(nèi)外關(guān)于柚苷酶的研究也主要集中在發(fā)酵菌株篩選[2-3]、發(fā)酵相關(guān)條件優(yōu)化[4-5]和酶的分離純化[6-7]等方面。

通過FDA安全認(rèn)證的黑曲霉是主要的生產(chǎn)菌，目前通過發(fā)酵生產(chǎn)的柚苷酶酶活依舊處于較低水平，少數(shù)較高的酶活水平也處于實驗室階段，工業(yè)化生產(chǎn)方面有很大的提升空間。有相關(guān)研究表明，熱激是可能會增高酶或部分代謝產(chǎn)物的有效策略[8-9]，突增溫度會影響菌體內(nèi)部代謝，進(jìn)而可能改變酶的代謝水平，但目前關(guān)于熱激提高黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶的相關(guān)研究較少。本實驗利用自主保藏的多株產(chǎn)柚苷酶的菌株進(jìn)行篩選并進(jìn)行初步發(fā)酵工藝研究，在最優(yōu)發(fā)酵條件下研究熱激對提高柚苷酶發(fā)酵酶活的影響，以期為探索并建立柚苷酶高效發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

黑曲霉FFCC uv-11、米曲霉FFCC 3102、黑曲霉FFCC 3111、黑曲霉FFCC 3112、黑曲霉FFCC 848、黑曲霉FFCC 48，均由大連工業(yè)大學(xué)菌種保藏中心提供；柚皮苷(w≥98%)，寶雞市方晟生物開發(fā)有限公司；脫脂豆粉，大連調(diào)味食品廠；其他化學(xué)試劑均為分析純。

斜面培養(yǎng)基(g/L)：硫酸鐵0.01，磷酸氫二鉀1.0，磷酸二氫鉀1.0，硝酸鈉3.0，硫酸鎂0.5，氯化鉀0.5，蔗糖30.0，瓊脂30.0，柚皮苷2.0，pH 6.0；121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：硫酸鎂0.5，硫酸銨4.0，硫酸鋅0.09，磷酸氫二鉀1.5，磷酸二氫鉀1.5，氯化鈣0.1，豆粉2.0，蛋白胨2.0，酵母浸粉1.0，柚皮苷6.0，初始pH 6.0，121 ℃滅菌20 min。

1.2 方 法

1.2.1 高產(chǎn)柚苷酶菌株的篩選

將真菌種子液按10%接種量接種到30 mL培養(yǎng)基中，在30 ℃、180 r/min搖床中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，在發(fā)酵96 h時測定柚苷酶酶活，進(jìn)行復(fù)篩。

1.2.2 高產(chǎn)柚苷酶菌株發(fā)酵條件優(yōu)化

1.2.2.1 發(fā)酵時間的確定

在30 ℃、180 r/min搖床發(fā)酵培養(yǎng)菌株，分別在0、24、48、72、96、120、144 h取樣測定酶活。

1.2.2.2 接種量的確定

分別按4%、7%、10%、13%、16%的接種量接種到培養(yǎng)基中，在30 ℃、180 r/min搖床發(fā)酵培養(yǎng)至最佳發(fā)酵時間，測定酶活。

1.2.2.3 初始pH的確定

分別配制不同初始pH(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0)的發(fā)酵培養(yǎng)基，按最佳接種量接種到30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30 ℃、180 r/min搖床發(fā)酵培養(yǎng)至最佳發(fā)酵時間，測定酶活。

1.2.3 熱激工藝優(yōu)化

1.2.3.1 熱激溫度的確定

分別以不同的溫度(35、40、45和50 ℃)刺激60 min，在30 ℃下培養(yǎng)至最佳發(fā)酵時間，發(fā)酵結(jié)束檢測酶活、生物量和pH。

1.2.3.2 熱激時間的確定

在最優(yōu)發(fā)酵條件下培養(yǎng)至指數(shù)生長期，選擇不同時間點(12、18、24、30和36 h)，分別以最佳溫度熱激60 min，在30 ℃下培養(yǎng)至最佳發(fā)酵時間，發(fā)酵結(jié)束檢測酶活、生物量和pH。

1.2.3.3 熱激時長的確定

在其他最佳條件下分別熱激處理不同時長(30、60、90和120 min)，在30 ℃下培養(yǎng)至最佳發(fā)酵時間，發(fā)酵結(jié)束檢測酶活、生物量和pH。

1.2.4 柚苷酶活性的測定

將1.6 mL的0.8 mg/mL柚皮苷溶液和0.4 mL 粗酶液混合均勻，在50 ℃的條件下反應(yīng)0.5 h。取0.2 mL反應(yīng)酶解液，加入10 mL 90%一縮二乙二醇和0.2 mL 4 mol/L的NaOH溶液，搖勻后放置約15 min，測定溶液420 nm處的吸光度。

柚苷酶活力單位定義：在pH 4.5、50 ℃的條件下，1 min水解1 μg的柚皮苷所需的酶量為1個酶活力單位(U/mL)。

1.2.5 生物量的測定

將發(fā)酵液倒入50 mL離心管，冷藏溫度下5 000 r/min進(jìn)行離心20 min，取上清液用于測定柚苷酶活力，倒去多余上清液，用純化水洗滌菌體沉淀3次后，置于105 ℃烘箱烘干至恒重，稱重并計算生物量。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

每組進(jìn)行3次平行實驗，利用Origin進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 高產(chǎn)柚苷酶菌株的篩選

將6種真菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酶，測得其發(fā)酵酶活的結(jié)果見如圖1。由圖分析可明顯發(fā)現(xiàn)黑曲霉uv-11的發(fā)酵酶活最高，均高于其他菌株，酶活達(dá)到431.30 U/mL。最終確定黑曲霉uv-11為高產(chǎn)柚苷酶的實驗菌。

2.2 高產(chǎn)柚苷酶菌株的發(fā)酵工藝優(yōu)化

由圖2(a)可以看出，在發(fā)酵120 h時酶活達(dá)到最高，但隨后又略有下降，可能發(fā)酵時間過長導(dǎo)致的環(huán)境影響了酶的活性[10-11]，因此確定最佳的發(fā)酵時間為120 h。圖2(b)可以看出，接種量為10%時柚苷酶酶活最大。曲霉菌產(chǎn)酶的最適pH為5.4～6.4，由圖2(c)可以看出，當(dāng)初始pH為6.0時，最終發(fā)酵酶活達(dá)到最大。此最佳發(fā)酵工藝條件下的柚苷酶發(fā)酵酶活達(dá)到765.85 U/mL。

圖1 6種黑曲霉菌株的酶活比較

(a) 發(fā)酵時間

(b) 接種量

(c) 初始pH

圖2 柚苷酶發(fā)酵工藝優(yōu)化

Fig.2 Optimization of fermentation conditions of naringinase

2.3 熱激工藝優(yōu)化

2.3.1 熱激溫度

如圖3所示，柚苷酶酶活隨溫度升高逐漸提高，35 ℃時達(dá)到最大，與對照組相比酶活提高了13.89%左右；當(dāng)熱激溫度進(jìn)一步增大，酶活逐漸降低，說明熱激溫度過高不僅不利于酶活的提高，還可能導(dǎo)致柚苷酶性質(zhì)不穩(wěn)定甚至失活。高溫脅迫產(chǎn)生一系列熱激蛋白等分子會促進(jìn)相關(guān)蛋白的正確折疊表達(dá)[12]，對于提高酶產(chǎn)量或酶活起到重要作用。溫度的升高導(dǎo)致發(fā)酵終點pH的降低和過高的生物量，過高溫度會影響其正常的代謝，不利于菌株產(chǎn)酶。確定35 ℃為最適熱激溫度。

圖3 熱激溫度對柚苷酶活性、生物量和發(fā)酵終點pH的影響

Fig.3 Effects of heat-shock temperature on naringinase activity, biomass and terminal pH

2.3.2 熱激時機(jī)

如圖4所示，在12 h進(jìn)行熱激，其柚苷酶酶活明顯低于其他實驗組，說明指數(shù)前期的熱激效果作用不明顯。在30 h時熱激，柚苷酶酶活最高。不同熱激時機(jī)對發(fā)酵最終pH與生物量也沒有明顯影響。綜合考慮30 h為最佳熱激時機(jī)。

圖4 熱激時機(jī)對柚苷酶活性、生物量和發(fā)酵終點pH的影響

Fig.4 Effects of heat-shock time on naringinase activity, biomass and terminal pH

2.3.3 熱激時長

如圖5所示，在熱處理30 min后發(fā)酵酶活最高，但隨著熱激時長的增加，柚苷酶發(fā)酵酶活逐漸降低，這說明熱激時長的增加不利于提高發(fā)酵酶活，并可能會使細(xì)胞受熱過度導(dǎo)致?lián)p傷[8]。熱激時長對發(fā)酵最終pH和生物量的影響不大，因此確定30 min為最佳熱激時長。

圖5 熱激時長對柚苷酶活性、生物量和發(fā)酵終點pH的影響

Fig.5 Effects of heat-shock duration on naringinase activity, biomass and terminal pH

2.4 驗證實驗

在黑曲霉發(fā)酵最佳條件下進(jìn)行驗證實驗，結(jié)果如圖6所示。結(jié)果表明，經(jīng)過熱處理后實驗組的發(fā)酵酶活(970.90 U/mL)是對照組的1.27倍，最終pH和生物量差距不大。

圖6 熱激處理前后柚苷酶活性、生物量和發(fā)酵終點pH的比較

Fig.6 Comparison of naringinase activity, biomass and terminal pH before and after heat-shock treatment

3 結(jié) 論

對AspergillusnigerFFCC uv-11進(jìn)行產(chǎn)酶最佳的發(fā)酵工藝條件優(yōu)化，柚苷酶發(fā)酵酶活達(dá)到765.85 U/mL。進(jìn)一步探究了熱激對該菌發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶的影響，通過實驗確定最佳熱激條件：熱激溫度35 ℃，時間30 h，熱激時長30 min，在此條件下柚苷酶酶活達(dá)到970.09 U/mL，是初始酶活(765.85 U/mL)的1.27倍。