劉 磊，陳 婷，成旭東，孟思思，唐 樑*

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬蘇州市中醫(yī)醫(yī)院 制劑室，江蘇 蘇州 215009；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京市中醫(yī)院 藥學(xué)部，江蘇 南京 210001)

三黃洗劑是蘇州市中醫(yī)醫(yī)院的院內(nèi)制劑，是根據(jù)《肘后備急方》中的黃連解毒湯為基本方加減組方而成，由大黃、生黃芩、生黃柏三味中藥組成。三黃洗劑具有清熱解毒、消腫止痛的功效，用于治療急性濕疹、膿皰瘡及抗皮膚感染。

現(xiàn)行的三黃洗劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)項(xiàng)目較簡(jiǎn)單，為了更好把控不同批次制劑的質(zhì)量，本研究通過高效液相色譜法測(cè)定三黃洗劑中5個(gè)成分的含量，為科學(xué)評(píng)價(jià)和有效控制其質(zhì)量提供可靠依據(jù)，增強(qiáng)該制劑的可控性。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)；AG285型電子分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；KQ-100VDE型超聲儀(昆山市超聲儀有限公司)；KDC-140HR型超速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)；Milli-Q Synthesis 108超純水儀(美國(guó)密理博公司)。

1.2 試藥

黃芩苷(批號(hào)：Lot.No.20161110)；漢黃芩苷(批號(hào)：Lot.No.20140722)(均由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供)；鹽酸小檗堿對(duì)照品(批號(hào)：110713-201212)；蘆薈大黃素(批號(hào)：110795-201710)；大黃酸(批號(hào)：110757-200206)(均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供)；三黃洗劑(由蘇州市中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供，批號(hào)：180829；181105；181206)；大黃(180806)，黃芩(180106)，黃柏(181010)均由蘇州市博源藥業(yè)有限公司提供；甲醇(色譜純)；水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 色譜條件

ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相甲醇(A)-0.1%磷酸溶液(B)梯度洗脫，見表1；體積流量1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)265 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

2.2 對(duì)照品溶液制備

精密稱取鹽酸小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃酸對(duì)照品各適量，加甲醇配制成每1 mL分別含142.8、136.3、44.2、7.54、3.21 μg的混合對(duì)照品溶液，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 供試品溶液制備

取待測(cè)樣品適量，搖勻，精密量取2.5 mL，置于100 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，離心，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性對(duì)照溶液制備

按三黃洗劑的處方比例分別稱取大黃，生黃芩，生黃柏這三味藥材各2份，按照三黃洗劑的制備工藝分別制成不含大黃，不含生黃芩及不含生黃柏的陰性樣品，并按“2.3”項(xiàng)下操作方法，制得陰性樣品溶液。

3結(jié)果

3.1 專屬性考察

按上述色譜條件，分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。供試品溶液、混合標(biāo)準(zhǔn)品和陰性對(duì)照品溶液在265 nm波長(zhǎng)條件下的HPLC色譜圖如圖1所示。由圖1可知，供試品溶液中待測(cè)成分與對(duì)照品在相同的保留時(shí)間有對(duì)應(yīng)的色譜峰。

注：峰1：鹽酸小檗堿；峰2：黃芩苷；峰3：漢黃芩苷；峰4：蘆薈大黃素；峰5：大黃酸

注：峰1：鹽酸小檗堿；峰2：黃芩苷；峰3：漢黃芩苷；峰4：蘆薈大黃素；峰5：大黃酸

3.2 線性關(guān)系考察

取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品混合溶液，精密吸取2、4、6、8、10、12 μL進(jìn)樣，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。以質(zhì)量濃度對(duì)色譜峰面積進(jìn)行線性回歸，分別繪制各對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，各對(duì)照品的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍見表2，結(jié)果表明各成分在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分的線性關(guān)系

3.3 精密度試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下同一混合對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，計(jì)算鹽酸小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃酸峰面積的RSD分別為1.33%、1.15%、1.61%、1.30%、1.37%。結(jié)果表明儀器精密度良好。

3.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次三黃洗劑(180829)，按照“2.3 供試品溶液制備”項(xiàng)下方法平行制備5份供試品溶液，進(jìn)樣，測(cè)得鹽酸小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃酸峰面積的RSD分別為2.93%、2.16%、2.02%、2.01%、2.58%。結(jié)果表明方法的重復(fù)性良好。

3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批次三黃洗劑(180829)，按照“2.3 供試品溶液制備”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于0、2、4、8、12 h進(jìn)樣，測(cè)得鹽酸小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃酸峰面積的RSD分別為0.25%、0.10%、1.34%、0.20%及0.51%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.6 加樣回收率試驗(yàn)

精密移取已知含量的6份樣品溶液各1.25 mL，分別置100 mL容量瓶中，加入適量混合對(duì)照品溶液，混勻，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，分別計(jì)算各成分的平均回收率和RSD，結(jié)果見表3。

表3加樣回收率結(jié)果 (n=6)

續(xù)表3加樣回收率結(jié)果 (n=6)

3.7 樣品測(cè)定

取3批次三黃洗劑樣品(180829，181105，181206)，分別按照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下條件測(cè)定，記錄峰面積，并進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果見表4。

表43批樣品含量測(cè)定結(jié)果 (n=2)

4 討論

4.1 含量測(cè)定組分的選擇

三黃洗劑是由大黃、生黃芩、生黃柏三味中藥組成的外用液體制劑，用于治療急性濕疹、膿皰瘡及抗皮膚感染?，F(xiàn)代藥理研究證明，大黃、黃柏、黃芩均具有抗炎抗病原微生物的作用[1-3]。

大黃具多類藥效活性成分，其中以蒽醌類、蒽酮類、鞣質(zhì)等報(bào)道較多。有大量文獻(xiàn)報(bào)道大黃中蒽醌類衍生物為其抗菌的有效成分，其中以蘆薈大黃素、大黃素、大黃酸作用最好[4]。黃柏化學(xué)成分以生物堿為主，并認(rèn)為是黃柏的主要藥效成分之一，其中以小檗堿含量最多[5]?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃芩苷具有抗多種微生物活性[6]，漢黃芩苷具有較好的抗炎作用[7]。因此，選擇鹽酸小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、蘆薈大黃素和大黃酸為指標(biāo)評(píng)價(jià)三黃洗劑的質(zhì)量更為全面合理。

4.2 流動(dòng)相的選擇

本實(shí)驗(yàn)中考察了甲醇-水、乙腈-水系統(tǒng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇-水系統(tǒng)干擾較少，且各個(gè)成分的分離度較好，為改善峰形，在水相中加入磷酸，結(jié)果表明甲醇-0.1%磷酸水溶液系統(tǒng)作為流動(dòng)相時(shí)，出峰快，基線較穩(wěn)定，分離度高，峰對(duì)稱且峰形理想。

4.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

參考文獻(xiàn)并結(jié)合對(duì)照品溶液紫外全波長(zhǎng)掃描圖發(fā)現(xiàn)，在265 nm下，基線較為平滑且色譜峰的峰形較好，各目標(biāo)成分的色譜峰可與共存組分達(dá)到較好的分離，各峰的峰高合適，故選擇265 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

本實(shí)驗(yàn)建立HPLC-DAD法同時(shí)測(cè)定三黃洗劑中鹽酸小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、蘆薈大黃素和大黃酸5種成分的分析方法，該方法提取流程少，分析快速，定量準(zhǔn)確，為科學(xué)評(píng)價(jià)和有效控制三黃洗劑的質(zhì)量提供可靠依據(jù)。