朱敏航，李紫薇，陳玄立，袁 瓊，周乾毅，張永忠

(武漢科技大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 新藥創(chuàng)制研究所 職業(yè)危害識(shí)別與控制湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430065)

糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是一種由于糖代謝紊亂引起心臟結(jié)構(gòu)和功能障礙為主要病理改變的心肌病變。隨著生活質(zhì)量的提高，糖尿病的發(fā)病率也逐漸增高，繼發(fā)于糖尿病的心血管并發(fā)癥逐漸成為糖尿病患者死亡的主要原因。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者70%以上死于心血管系統(tǒng)疾病，是非糖尿病患者心血管系統(tǒng)疾病病死率的2～3倍，許多研究證實(shí)心肌細(xì)胞焦亡可能參與其中[1]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)慢性炎癥和能量代謝異常的發(fā)生關(guān)系密切，認(rèn)為趨化因子和促炎性細(xì)胞因子誘導(dǎo)的慢性炎癥過(guò)程是糖尿病心肌病心肌損傷的重要發(fā)病機(jī)制之一[2-3]。

無(wú)患子皂苷(Soapnut Saponin)是從野生落葉喬木無(wú)患子(SapindusmukorossiGaertn.)果皮中提取出來(lái)的一類(lèi)皂苷類(lèi)化合物。其果皮提取物中主要活性成分為三萜皂苷類(lèi)(Ⅰ)、倍半萜糖苷類(lèi)(Ⅱ)、蛋白質(zhì)和脂肪油，其中三萜皂苷類(lèi)、倍半萜糖苷類(lèi)，已證實(shí)對(duì)人體皮膚有抗菌、殺菌、消炎和祛屑止癢功效，除此之外還含有多種有益于人體的物質(zhì)[4]。糖尿病引起的高血糖會(huì)促進(jìn)血小板聚集，又可引起脂質(zhì)過(guò)氧化物合成增加。大量研究表明，Ⅱ型糖尿病的氧化應(yīng)激能耗盡抗氧化防御系統(tǒng)的活性，導(dǎo)致氧自由基增多。同時(shí)，脂質(zhì)過(guò)氧化物的分解產(chǎn)物為一種很強(qiáng)的具有生物毒性的物質(zhì)[5]。有研究表明大多數(shù)皂苷具有顯著的抗氧化作用，可清除體內(nèi)氧自由基，顯示出抗血小板聚集的活性。采用乳酸脫氫酶泄露分析方法測(cè)定無(wú)患子皂苷，沒(méi)有明顯的細(xì)胞毒活性，還表現(xiàn)出比阿司匹林具有更強(qiáng)的抗血小板聚集的活性[6]。

本研究擬探究無(wú)患子皂苷對(duì)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷保護(hù)作用機(jī)制，為糖尿病性心肌病的治療提供新思路。

1 材料

1.1 藥材

成熟無(wú)患子果實(shí)(SapindusmukorossiGaertn′s fruit)：2017年收取于武漢科技大學(xué)黃家湖校區(qū)無(wú)患子樹(shù)，果實(shí)由張永忠副教授鑒定并存放于武漢科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院。

1.2 細(xì)胞株

H9C2心肌細(xì)胞株(上海ATCC細(xì)胞庫(kù))，經(jīng)復(fù)蘇后，于含有10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3 試劑

齊墩果酸對(duì)照品(上海阿拉丁生化科技有限公司)；二甲雙胍(源葉生物技術(shù)有限公司，LOT：Y12J7C16020)；caspase-1及β-actin抗體(鼠抗，Santa Cruz Blotechnology)；IL-1β及NLRP3抗體(兔抗，Cell Signaling Technology)；抗鼠及抗兔二抗(武漢科瑞生物技術(shù)有限公司)；SP免疫組化檢測(cè)試劑盒及DAB工作液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.4 儀器

CO2培養(yǎng)箱(力康Heal Force)；超凈工作臺(tái)(SW-CJ-1FD，蘇州凈化設(shè)備有限公司)；倒置相差顯微鏡(日本Olympus)；酶標(biāo)儀(Biotek Epoch)；CCD成像系統(tǒng)(Laica Microsystems，型號(hào)DM750)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf，型號(hào) 5427R)。

2方法

2.1 無(wú)患子皂苷的提取和純化

無(wú)患子果皮洗凈、晾干、粉碎，稱(chēng)取無(wú)患子藥材粉末(過(guò)三號(hào)篩)約2.5 g。精密測(cè)定，加6倍量85%乙醇回流提取3次，每次2 h，得無(wú)患子皂苷的提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇至無(wú)醇味，加150 mL蒸餾水溶解，水飽和的醋酸乙酯萃取3次，每次80 mL，棄去醋酸乙酯層，合并水層。再用D101大孔樹(shù)脂純化，以3BV/H的速度進(jìn)行洗脫，收集50%的洗脫液，洗脫液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮。制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)過(guò)計(jì)算，無(wú)患子皂苷濃度以齊墩果酸計(jì)為12.58 mg/mL。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組

H9C2心肌細(xì)胞株常規(guī)復(fù)蘇后加入DMEM培養(yǎng)基(含糖量15 mmol/L)、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)(37 ℃，5 % CO2)。實(shí)驗(yàn)共分六組：正常對(duì)照組、高糖損傷組、低劑量無(wú)患子皂苷處理組(3 μmol/L)、中劑量無(wú)患子皂苷處理組(10 μmol/L)、高劑量無(wú)患子皂苷處理組(30 μmol/L)以及二甲雙胍處理組(50 μmol/L)。正常對(duì)照組細(xì)胞采用含糖量15 mmol/L的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，高糖損傷組細(xì)胞采用含糖量50 mmol/L的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，無(wú)患子皂苷處理組和二甲雙胍處理組則在高糖損傷組的基礎(chǔ)上給予不同劑量的無(wú)患子皂苷和二甲雙胍進(jìn)行處理，處理時(shí)間均為48 h。

2.3 Western blot實(shí)驗(yàn)

各組處理后的細(xì)胞使用RIPA裂解液裂解并提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，TBST洗膜3次，封閉后孵育相應(yīng)目的蛋白的抗體：caspase-1及β-actin抗體(鼠抗，1∶2000)、IL-1β及NLRP3抗體(兔抗，1∶2 000)4 ℃過(guò)夜，TBST洗膜3次后室溫孵育Ⅱ抗，HRP-抗兔(1∶1 000)、HRP-抗鼠(1∶2 000)1 h，洗膜3次，ECL顯影。

2.4 細(xì)胞爬片制作

DMEM培養(yǎng)基(含糖量15 mmol/L)培養(yǎng)的H9C2心肌細(xì)胞胰酶消化后按8×104個(gè)/孔的密度種于放有多聚賴(lài)氨酸包被的無(wú)菌圓形蓋玻片的24孔板內(nèi)，置于二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h待細(xì)胞貼壁后分組給藥，繼續(xù)培養(yǎng)48 h用4%的多聚甲醛固定備用。

2.5 SP免疫組化實(shí)驗(yàn)

取出細(xì)胞爬片后PBS洗兩次，0.5% Triton通透處理15 min，采用SP法嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作檢測(cè)caspase-1(1∶100)、IL-1β(1∶100)及NLRP3(1∶200)蛋白表達(dá)情況，DAB顯色，PBS代替一抗做陰性對(duì)照。顯色完畢后，90%甘油封片，在CCD成像系統(tǒng)下觀察并采集圖像，每組隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行平均光密度測(cè)量，并計(jì)算其均值后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，所取得的數(shù)據(jù)均采用IBM SPSS Statistics 19.0和GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。采用單因素方差分析進(jìn)行多組比較，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 高糖損傷H9C2細(xì)胞模型建立

采用免疫組化和Western Blot檢測(cè)細(xì)胞中caspase-1、IL-1β蛋白表達(dá)情況，結(jié)果見(jiàn)圖1。免疫組化結(jié)果顯示高糖損傷組caspase-1、IL-1β兩種蛋白表達(dá)水平相較于正常對(duì)照組均明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Western Blot結(jié)果同樣顯示高糖損傷組caspase-1、IL-1β兩種蛋白表達(dá)水平相較于正常對(duì)照組明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01)。結(jié)果提示高糖誘導(dǎo)了H9C2心肌細(xì)胞的焦亡，高糖損傷細(xì)胞焦亡模型建立成功。

3.2 無(wú)患子皂苷抑制高糖誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞焦亡

采用免疫組化和Western Blot檢測(cè)細(xì)胞中caspase-1、IL-1β蛋白表達(dá)情況，結(jié)果見(jiàn)圖1。免疫組化和Western Blot結(jié)果均顯示無(wú)患子皂苷處理組caspase-1及IL-1β兩種蛋白表達(dá)水平相較于高糖損傷組均降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01)，呈劑量依賴(lài)現(xiàn)象。與高糖損傷組相比，二甲雙胍處理組caspase-1及IL-1β兩種蛋白表達(dá)水平降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01)。高劑量無(wú)患子皂苷處理組與二甲雙胍處理組效果相當(dāng)。

(a)免疫組化光鏡圖(DAB顯色，400×)；(b)免疫組化結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖；(c)Western Blot檢測(cè)結(jié)果及統(tǒng)計(jì)圖。+P< 0.05，++P< 0.01 VS 對(duì)照組；*P< 0.05，**P< 0.01 VS 高糖組；△P< 0.05 VS 低劑量組，▲P< 0.05 VS 中劑量組。

圖1 各實(shí)驗(yàn)組Caspase-1、IL-1β蛋白的表達(dá)

3.3 無(wú)患子皂苷抑制高糖誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞NLRP3表達(dá)

采用免疫組化和Western Blot檢測(cè)六組細(xì)胞中NLRP3蛋白表達(dá)水平，結(jié)果見(jiàn)圖2。免疫組化及Western Blot結(jié)果均顯示高糖組NLRP3蛋白表達(dá)水平相較于正常對(duì)照組均明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01)。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示NLRP3蛋白在無(wú)患子皂苷治療組中的表達(dá)水平明顯低于高糖組，且三種給藥劑量呈現(xiàn)出不同的降低程度。高劑量無(wú)患子皂苷對(duì)高糖誘導(dǎo)損傷后的NLRP3表達(dá)抑制作用與二甲雙胍治療組相當(dāng)。

(a)免疫組化光鏡圖(DAB顯色，400×)；(b)免疫組化結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖；(c)Western Blot檢測(cè)結(jié)果及統(tǒng)計(jì)圖。+P< 0.05，++P< 0.01 VS 高糖組；*P< 0.05，**P< 0.01 VS 對(duì)照組；△P< 0.05 VS 皂苷低劑量組，▲P< 0.05 VS 皂苷中劑量組。

圖2 實(shí)驗(yàn)各組NLRP3蛋白的表達(dá)

4 討論

細(xì)胞焦亡是一種程序性細(xì)胞死亡，又稱(chēng)細(xì)胞炎性壞死，表現(xiàn)為細(xì)胞不斷脹大直至細(xì)胞膜破裂，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物的釋放，進(jìn)而激活強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)。細(xì)胞焦亡在抗擊感染中具有重要作用，是機(jī)體一種重要的天然免疫反應(yīng)。細(xì)胞焦亡是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)并證實(shí)的一種以依賴(lài)于半胱天冬酶-1(caspase-1)，并伴有大量促炎癥因子釋放為特征的新的程序性細(xì)胞死亡方式。細(xì)胞焦亡的形態(tài)學(xué)特征、發(fā)生及調(diào)控機(jī)制等均不同于凋亡、壞死等其他細(xì)胞死亡方式。細(xì)胞焦亡相比于細(xì)胞凋亡(apoptosis)發(fā)生得更快，并會(huì)伴隨大量促炎癥因子的釋放，因此可以通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)炎癥因子的表達(dá)水平以及caspase-1蛋白的表達(dá)水平來(lái)判斷細(xì)胞是否發(fā)生了焦亡。本研究發(fā)現(xiàn)，在高糖誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞損傷組中，caspase-1、IL-1β兩種蛋白表達(dá)水平相較于正常對(duì)照組均明顯升高，表明細(xì)胞產(chǎn)生了焦亡。

炎癥小體是由胞漿內(nèi)模式識(shí)別受體(PRRs)參與組裝的一類(lèi)多蛋白復(fù)合物，是天然免疫系統(tǒng)中十分重要的組成部分。炎癥小體具有識(shí)別病原相關(guān)分子模式(PAMPs)或者宿主來(lái)源的危險(xiǎn)信號(hào)分子(DAMPs)的能力，并能夠招募和激活促炎癥蛋白酶Caspase-1?；罨腃aspase-1切割I(lǐng)L-1β和IL-18的前體，產(chǎn)生相應(yīng)的成熟細(xì)胞因子。炎癥小體的激活還能夠誘發(fā)導(dǎo)致細(xì)胞的炎癥壞死(pyroptosis)。目前已經(jīng)有多種炎癥小體被確定參與了針對(duì)多種病原體的宿主防御反應(yīng)，病原體也已經(jīng)進(jìn)化出多種相應(yīng)的機(jī)制來(lái)抑制炎癥小體的活化。在本實(shí)驗(yàn)中，NLRP3蛋白表達(dá)水平的改變與caspase-1、IL-1β兩種蛋白表達(dá)水平的改變趨勢(shì)一致，表明無(wú)患子皂苷抑制高糖誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞焦亡可能是通過(guò)NLRP3信號(hào)通路來(lái)進(jìn)行調(diào)控的。

本研究對(duì)無(wú)患子皂苷的這種保護(hù)作用機(jī)制的探究也為糖尿病心肌病的治療提供了一個(gè)新思路。自古以來(lái)，無(wú)患子一直是我國(guó)民間常用的洗滌用品，尤其常用于潔面和洗發(fā)。本實(shí)驗(yàn)中無(wú)患子皂苷治療組細(xì)胞中Caspase-1、IL-1β蛋白的表達(dá)水平相較于高糖損傷組均有下降，表明無(wú)患子皂苷對(duì)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞焦亡產(chǎn)生了抑制作用。無(wú)患子皂苷在糖尿病細(xì)胞模型中表現(xiàn)出來(lái)的保護(hù)作用為糖尿病心肌病的治療提供了一個(gè)新的方案。無(wú)患子皂苷作為一種天然產(chǎn)物，其毒副作用較小，具有抗真菌、抗細(xì)菌多種生物活性，并且在本研究中顯示出了對(duì)高糖誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞焦亡的抑制作用，可能作為一種新型糖尿病性心肌病的治療藥物，抑制心肌細(xì)胞的焦亡，減輕和延緩糖尿病的心血管并發(fā)癥。但是本研究?jī)H對(duì)無(wú)患子皂苷的藥理活性進(jìn)行了探究，還未進(jìn)行藥物代謝動(dòng)力學(xué)、毒理學(xué)等體內(nèi)分析，是否可以正式作為臨床治療糖尿病的新藥還有待進(jìn)一步探究。

綜上所述，高糖能夠誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞產(chǎn)生焦亡，無(wú)患子皂苷對(duì)高糖誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，且該作用通過(guò)NALP3調(diào)控caspase1、IL-1β等下游基因來(lái)實(shí)現(xiàn)。