李小鳳，伏彭輝，黃永軍，鄧 凱，陸鳳花，石德順

（廣西大學動物科學技術(shù)學院，亞熱帶農(nóng)業(yè)資源保護與利用國家重點實驗室，廣西南寧 530004）

卵母細胞體外成熟是充分利用未成熟卵母細胞生產(chǎn)胚胎的重要過程，在動物繁殖中有重要價值且已得到廣泛應(yīng)用。然而，卵母細胞體外成熟的質(zhì)量不如體內(nèi)成熟[1-2]，原因之一是體外環(huán)境與體內(nèi)環(huán)境的氧濃度不同，氧氣在參與新陳代謝、線粒體呼吸和氧化磷酸化產(chǎn)生能量的同時也會產(chǎn)生副產(chǎn)物——活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS），這是ROS 產(chǎn)生的內(nèi)在因素，外源性因素則包括氧濃度、金屬離子（如鐵離子、銅離子）、光照誘導(dǎo)、胺氧化酶（加到培養(yǎng)液中的血清中含有大量胺氧化酶）。大氣中的氧濃度遠遠大于輸卵管的氧濃度，這可能是造成氧化應(yīng)激的主要原因[3-6]?；⒄溶眨≒olydatin，PD）的化學結(jié)構(gòu)為3，4'-5-三羥基芪-3-β-D-葡糖苷，也稱白藜蘆醇苷[7]，是白藜蘆醇與葡萄糖的結(jié)合物，均屬于中草藥虎杖成分中的芪類化合物，具有多種生物活性。據(jù)報道，虎杖苷對受到氧化應(yīng)激的細胞具有抗氧化作用，從而起到保護作用[8-10]。目前，關(guān)于虎杖苷對卵母細胞體外成熟的影響報道不多。本研究通過探究虎杖苷對牛卵母細胞體外成熟的影響，為改善卵母細胞體外成熟培養(yǎng)體系，提高卵母細胞體外成熟效率提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑 牛卵巢由南寧市某特定的屠宰場每天定時提供。

卵母細胞成熟、胚胎培養(yǎng)基所用試劑無特別說明均購自美國Sigma 公司。TCM199 試劑、胎牛血清（Fetal boving serum，F(xiàn)BS）購自美國Gibico 公司。細胞裂解液（cellysis）購于美國Ambion 公司。二氯熒光素二乙酸（2′，7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）購于美國Sigma 公司。DNase I 購于美國Thermo scientific公 司，Mixture dNTP、Random Primer、RNase inhibitor購于日本TaKaRa 公司，ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 購于南京Vazyme 公司。其中，成熟培養(yǎng)液（M液）由TCM-199 為基礎(chǔ)添加激素、FBS 等組成?；⒄溶召徲诿绹鳶igma 公司，純度95%（HLPC），以二甲基亞砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO）溶解，再以M液配置成終濃度為（0.5、1.0、2.0 μmol/L）的工作液。牛精液購于購于廣西畜禽品種改良站。

1.2 引物合成 根據(jù)NCBI 上找到中已公布的牛的相關(guān)基因和內(nèi)參基因的 RNA 序列，用 Oligo6.71 軟件設(shè)計適用于qPCR 反應(yīng)的2 對特異性上、下游引物。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成?；蛞镄蛄屑胺磻?yīng)條件見表1。

表1 用于qPCR 反應(yīng)的引物序列和反應(yīng)條件

1.3 牛卵母細胞的采集 將從屠宰場獲得的卵巢置于盛有37℃ 0.9%的滅菌生理鹽水（90 g NaCl，2 g KCl，2 g 無水CaCl2，1 g MgCl2，定容到10 L，不加抗生素）的保溫瓶中，4 h 內(nèi)運回實驗室。先用75%的酒精浸泡清洗卵巢30 s，后用37℃生理鹽水清洗3 遍，并用剪刀減去卵巢所附帶的組織，后將卵巢置于滅菌紗布上，用10 mL 注射器抽取卵巢表面2～8 mm 的卵泡，并將卵泡液與洗卵液混勻后置于35 mm 皿中，在體視顯微鏡下?lián)爝x出具有2 層或以上顆粒層包裹，且胞質(zhì)均勻的卵丘-卵母細胞復(fù)合體（Cumulus Oocyte Complexes，COCs）。

1.4 牛卵母細胞的體外成熟 COCs 經(jīng)過洗卵液CCM（以TCM-199 為基礎(chǔ)，1 L 需補充0.9 g NaCl，1.2 g Hepes，0.4 g NaHCO3，0.1 g 鏈霉素，0.06 g 青霉素，用NaOH 調(diào)pH 至7.2～7.4）清洗3 遍，再過1 遍M 液，后將COCs 隨機分為4 組，分別移到含不同濃度（0、0.5、1.0、2.0 mol/L）PD 的M 液的四孔板中，750 μL/孔。輕輕晃動四孔板，以便卵母細胞聚在皿的中央。放入38.5℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22～24 h。統(tǒng)計牛卵母細胞第一極體排出情況，計算成熟率。備用于相關(guān)的實驗操作。

1.5 精子獲能 取出保存在液氮罐中牛的凍精細管，每管0.25 mL，于裝有2 mL 受精液（F 液：TALP 基礎(chǔ)液+2.5 mmol/L 咖啡因+0.6% BSA+50 mg/L 肝素）的5 mL尖底離心管中，于38.5℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中上游獲能30 min。

1.6 體外受精（IVF） 成熟培養(yǎng)22～24 h 的牛COCs 用移液槍輕輕吹掉卵丘細胞后，挑選有第一極體排出且胞質(zhì)均勻的卵母細胞放入受精盤中，每滴15～20 枚細胞。待精子獲能完成后，取上清液，1 500 r/min 離心5 min，棄上清液，取活力好的精液注入受精滴中，使兩者受精24 h 后再轉(zhuǎn)盤。

1.7 胚胎培養(yǎng) 將受精卵取出，用移液槍輕輕吹掉受精卵表面的精子，再轉(zhuǎn)到事先準備好的胚胎培養(yǎng)盤中培養(yǎng)，每個20 μL 滴放入15 枚胚胎。每隔24 h 半量換液。胚胎培養(yǎng)48 h 記錄統(tǒng)計卵裂情況，第8 天記錄統(tǒng)計囊胚數(shù)。

1.8 囊胚細胞數(shù)檢測 收集各組第8 天囊胚，在PBS 中清洗3 遍，再在含 10μg/L Hoechst 33342 的胚胎培養(yǎng)液中室溫避光孵育20 min，然后用PBS 清洗3 遍，在載玻片中央滴加抗猝滅劑和四周涂上凡士林，每個蓋玻片放入3～5 枚囊胚進行壓片，熒光顯微鏡下觀察，最后用ImageJ 軟件進行統(tǒng)計細胞數(shù)。

1.9 ROS 檢測 試驗之前用胚胎培養(yǎng)液將DCFH-DA 稀釋到10 μmol/L 的工作液，在培養(yǎng)箱中平衡30 min。用移液槍輕輕掉卵丘細胞，挑選有第一極體排出且胞質(zhì)均勻的卵母細胞放入平衡好的微滴中，在培養(yǎng)箱避光孵育30 min。孵育完成用PBS 洗3 遍。再將其放到平衡好的由PBS 做成的微滴里，在多光子激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察，最后用ImageJ 軟件分析每個卵母細胞的熒光密度值。

1.10 微量反轉(zhuǎn)及熒光定量 PCR 收集好成熟的卵母細胞，每一組20 枚，加入裂解液。置于PCR 儀中75℃、15 min，使RNase 滅活，瞬離，置于冰上。加入DNase Ⅰ1.0 μL、DNase Ⅰ Buffer 1.2 μL、RNase Inhibitor 0.1 μL，瞬離，37℃、30 min 去除DNA。瞬離置于冰上，各加入EDTA、Random Primer、Mixture dNTP 1.0 μL，瞬離，65 ℃、15 min。加 入5×Buffer 4 μL、DTT 2 μL、RNase Inhibitor 0.5 μL、Fast 酶SS Ⅱ0.25 μL，瞬 離 后，PCR條 件：25 ℃、10 min，42 ℃、90 min，95 ℃、15 min，注意以上操作均在冰上進行。將得到的產(chǎn)物進行熒光定量PCR，體系與反應(yīng)程序按照說明書進行。

1.11 成熟后卵母細胞內(nèi)總谷胱甘肽的檢測 實驗方法參照說明書推薦與實際條件進行。按上述做體外受精用的卵母細胞原則，每組挑選30 枚卵母細胞，加入3 倍體積的蛋白去除試劑S，混勻后用液氮和37℃快速凍融細胞，冰浴5 min，4℃，10 000 r/min 離心10 min，取上清用于測定總谷胱甘肽。按比例加入各試劑后，避光室溫反應(yīng)25 min，酶標儀A412 測定OD 值，樣品中的結(jié)果總谷胱甘肽按照標準曲線算出。

1.12 統(tǒng)計分析 用IMageJ 軟件對囊胚細胞數(shù)，卵母細胞的ROS 水平進行統(tǒng)計，采用SPSS 21 進行單因素ANOVA 分析后作圖。每個實驗至少重復(fù)3 次，P＜0.05表示差異顯著，P＞0.05 表示差異不顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的PD 對體外成熟牛卵母細胞第一極體排出的影響 由表2 可知，牛卵母細胞經(jīng)不同濃度PD 處理22～24 h 后極體排出率均顯著高于對照組（0 μmol/L PD），其中1.0 μmol/L PD 處理組最高，提示在成熟液添加一定量PD 對牛卵母細胞體外成熟有積極影響。

表2 PD 對牛COCs 第一極體排出率的影響

2.2 成熟液添加不同濃度PD 對牛IVF 胚胎發(fā)育的影響如表3 所示，不同濃度PD 處理組卵裂率與對照組均無顯著差異，但1.0 μmol/L PD 處理組IVF 胚胎的囊胚率顯著高于對照組。

表3 成熟培養(yǎng)中添加PD 對牛早期胚胎發(fā)育的影響

2.3 成熟液添加不同濃度PD 對牛IVF 囊胚細胞數(shù)的影響 將IVF 所得的第8 天囊胚進行Hoechst 33342 染色，結(jié)果顯示成熟液中添加PD 有利于提高囊胚的細胞數(shù)，尤其是1.0、2.0 μmol/L 組較對照組有顯著提高，提示一定量成熟液有助于胚胎發(fā)育（圖1，表4）。

表4 成熟液添加PD 對牛囊胚細胞數(shù)的影響

2.4 成熟液添加PD 對牛卵母細胞中ROS 水平的影響由以上結(jié)果可知，1.0 μmol/L PD 為最佳處理濃度。由圖2 可知，1.0 μmol/L PD 處理組ROS 水平較對照組顯著降低，說明PD 能顯著降低細胞內(nèi)的ROS 水平。

2.5 成熟液中添加 PD 對牛卵母細胞抗氧化基因表達水平的影響 如圖3 所示，1.0 μmol/L PD 處理的卵母細胞可以顯著提高GPX4、SOD1的mRNA 表達水平。

2.6 成熟液添加PD 對牛卵母細胞總谷胱甘肽（GSH）含量的影響 如圖4 所示，PD 處理組卵母細胞內(nèi)的總谷胱甘肽水平極顯著高于對照組。

3 討 論

近年來，隨著胚胎移植的發(fā)展不斷商業(yè)化，卵母細胞的體外成熟作為體外獲取胚胎的主要來源備受關(guān)注。然而體外成熟的卵母細胞質(zhì)量與體內(nèi)自然成熟的卵母細胞質(zhì)量有很大差距，原因之一是體外培養(yǎng)產(chǎn)生的ROS沒有得到及時清除，培養(yǎng)條件也影響卵母細胞質(zhì)量和胚胎發(fā)育能力[11]。

本實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，在成熟液中添加PD 處理牛卵母細胞22～24 h 的第一極體排出率顯著提高。Dominko 等[12]報道，排出第一極體的卵母細胞與未排出極體的卵母細胞相比，發(fā)育到囊胚的潛力更高，第一極體的排出說明卵母細胞已經(jīng)完成核成熟，添加PD 提高了牛卵母細胞第一極體率的排出，可能是PD的抗氧化能力使卵母細胞在一個ROS 含量更低的環(huán)境下成熟。

胚胎質(zhì)量（囊胚細胞數(shù)、囊胚細胞凋亡率）對于牛胚胎成功植入非常重要。研究發(fā)現(xiàn)，最高質(zhì)量（I 級）胚胎的妊娠率約為53%，而II 級囊胚的妊娠率僅為36%[13-14]。本實驗結(jié)果表明，PD 提高牛卵母細胞囊胚率與囊胚細胞數(shù)，與最近Khan 等[15]的研究結(jié)果相似，其結(jié)論為在成熟液中添加1.0 μmol/L PD 可提高囊胚率和囊胚細胞數(shù)。本實驗表明，在體外成熟液中添加1.0 μmol/L PD有利于促進囊胚的形成和通過提高囊胚細胞數(shù)來提高囊胚質(zhì)量。

Qiao[16]將PD 加到由H2O2誘導(dǎo)氧化損傷的人臍靜脈內(nèi)皮細胞，細胞存活率黏附性和遷移能力被提高，乳酸脫氫酶（LDH）和ROS 的釋放被抑制，GSH-Px 和SOD 含量提高。也有研究表明，PD 通過提高抗氧化酶基因的表達、抑制氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生，保護由疾病引起的細胞損傷[10,17-20]，說明PD 具有強的抗氧化性。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，1.0 μmol/L PD 處理組顯著提高成熟后的卵母細胞抗氧化酶基因GPX4、SOD1的表達水平，同時降低細胞內(nèi)的ROS 含量。這與PD 在保護氧化損傷的細胞的效果一致。因此，猜測1.0 μmol/L PD處理組的ROS 水平降低，可能與上調(diào)內(nèi)源性抗氧化酶的表達水平有關(guān)，也可能與PD 本身的羥基化學結(jié)構(gòu)有關(guān)。

卵母細胞內(nèi)ROS 和GSH 水平是影響其體外成熟質(zhì)量及隨后的胚胎發(fā)育重要因素[21]。許多學者認為GSH含量是卵母細胞胞質(zhì)成熟的一項有效指標[22-24]。此外，GSH 可以與自由基、氧化型的中間產(chǎn)物反應(yīng)，使細胞免受氧化損傷[24]，如GSH 作為輔酶，通過調(diào)節(jié)氧化還原反應(yīng)，調(diào)節(jié)蛋白和DNA 合成。在豬[25]、牛[23-24]等哺乳動物中，卵母細胞成熟過程中合成GSH。卵母細胞在卵巢的成熟過程中，GSH 會隨排卵臨近而升高，卵母細胞成熟質(zhì)量在高濃度GSH 下得到改善，同時會為后續(xù)的胚胎發(fā)育“保駕護航”?？偣入赘孰陌ㄟ€原型谷胱甘肽和氧化性谷胱甘肽2 種，但在哺乳動物細胞中，約90%的GSH 以還原型存在。還原型和氧化型谷胱甘肽可以在谷胱甘肽過氧化物酶類和還原酶的作用能相互轉(zhuǎn)化。本實驗分析了1.0 μmol/L PD 處理組與對照組成熟后的卵母細胞內(nèi)總谷胱甘肽含量，發(fā)現(xiàn)實驗組顯著提高了總谷胱肽含量，換言之，實驗組的還原型谷胱甘肽比對照組高。與對照組相比，虎杖苷處理組卵母細胞內(nèi)GSH 得到提高，原因可能是卵母細胞在PD 處理下，抗氧化酶基因的表達水平提高，卵母細胞的抗氧化能力增強，從而提高了卵母細胞成熟質(zhì)量。

4 結(jié) 論

在牛卵母細胞成熟液中添加1.0 μmol/L PD 可提高卵母細胞的抗氧化能力，有助于卵母細胞的體外成熟。