張 靜 ，馬景林，孫丹丹，李峰娟，張夢玲，黃柳英，張建云，馬秋剛，計 成，趙麗紅*

（1.動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，中國農業(yè)大學動物科學技術學院，北京 100193；2.廣東海納川生物科技股份有限公司，廣東廣州 510275；3.福建豐澤農牧飼料有限公司，福建福州 350007）

抗生素在畜禽養(yǎng)殖中發(fā)揮了非常重要的作用，但隨之產生的耐藥性以及抗生素殘留問題愈發(fā)突出[1]。因此，尋找高效和安全的抗生素替代品迫在眉睫。

抗菌肽作為一類廣泛存在于自然界中的小分子肽類物質，是動物機體先天免疫的重要組成成分?？咕木哂袕V譜抗菌活性以及不易產生耐藥性等特點[2]，近年來被認為是極具潛力的抗生素替代品。研究表明，抗菌肽PR39、乳鐵蛋白、天蠶素、防御素及菌絲霉素能夠提高斷奶仔豬的生長性能，增強免疫力[3-5]。菌絲霉素作為一種真菌防御素，能夠有效抑制革蘭氏陽性致病菌的生長繁殖，且能夠在畢赤酵母中高效表達[6]。Ma 等[7]研究表明，菌絲霉素對肉雞生長性能、腸道健康及先天免疫具有有益的作用。李延等[5]研究發(fā)現，在斷奶仔豬日糧中添加0.2%重組菌絲霉素能夠改善仔豬的生長性能。本試驗旨在探究菌絲霉素對生長育肥豬的生長性能、腸道健康以及血清抗氧化指標的作用效果，為其在生豬生產上的推廣應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 試驗用菌絲霉素由廣東海納川生物科技股份有限公司提供，含有40 個氨基酸（GFGCNGPWD EDDMQCHNHCKSIKGYKGGYCAKGGFVCKCX），分子量約為4.4 ku，純化后的菌絲霉素純度大于95%。由菌絲霉素制成的抗菌肽產品普樂特，其菌絲霉素含量為2%；吉他霉素預混劑的有效成分含量為50%。參照Ma 等[7]方法制備菌絲霉素，將來自腐生子囊菌的菌絲霉素基因克隆至載體pPICZαA 中以構建重組質粒，通過電轉將重組質粒轉入畢赤酵母中，并將陽性轉化子在10 mL 含100 μg/mL 博來霉素的酵母浸出粉胨葡萄糖（YPD）培養(yǎng)基中培養(yǎng)，30℃，250 r/min 培養(yǎng)24 h。之后將陽性轉化子在4℃，4 000 r/min 條件下離心5 min，棄上清液，用1 L YPD 培養(yǎng)基重懸菌體。最后，通過高密度發(fā)酵在含基礎鹽培養(yǎng)基（BSM）的2 t 發(fā)酵罐中制備重組菌絲霉素，其中溶氧量保持在30% 以上。先把培養(yǎng)基中原有的碳源消耗掉，再加甲醇37℃誘導表達72 h，上清液總蛋白濃度為4 g/L。離心去除酵母細胞，將發(fā)酵液上清濃縮后，經離子交換層析純化，即可得重組菌絲霉素。

1.2 試驗設計及日糧 試驗采用單因素完全隨機化設計。選取44 頭90 日齡、平均體重為（43.51±0.56）kg的長× 大二元生長母豬隨機分為4 個處理，每個處理11 個重復，每個重復1 頭豬，各處理間豬的初始體重差異不顯著。負對照組（NC 組）飼喂基礎日糧，基礎日糧按照NRC（1998）豬營養(yǎng)需要標準配制，其原料組成和營養(yǎng)成分見表1；正對照組（PC 組）在基礎日糧中添加30 mg/kg 吉他霉素；菌絲霉素低劑量組（LPle組）和高劑量組（HPle 組）分別在基礎日糧添加100、200 mg/kg 菌絲霉素，試驗期70 d。

表1 基礎日糧組成和營養(yǎng)成分（風干基礎）

1.3 飼養(yǎng)管理 試驗豬采用全自動飼喂系統(tǒng)自由采食，每個處理在同一欄，試驗豬有電子耳號，進入系統(tǒng)的采食倉后，系統(tǒng)自動識別耳號，并記錄采食前的料重，退出采食倉后，再次記錄料重，兩者之差為本次采食量，并且記錄試驗豬的體重。當料槽重量小于設定的最小值時系統(tǒng)自動加料。每個欄中配有鴨嘴式飲水器，豬自由飲水。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 生長性能 分別于試驗第1 天（90 日齡）和2 個階段的最后1 天（128 日齡和159 日齡）記錄每頭豬的體重，全自動飼喂系統(tǒng)自動記錄每頭豬每天的耗料量，計算各階段的平均日采食量（ADFI）、平均日增重（ADG）和耗料增重比（F/G）。

1.4.2 血清生化指標及抗氧化指標測定 于試驗第70天，每個處理隨機選取6 頭接近該處理平均體重的豬，前腔靜脈采血10 mL，靜置30 min 后，于4℃，3 000 r/min條件下離心15 min 分離血清，用Eppendorf 管分裝后放入-20℃保存。使用日立7600 全自動生化分析儀測定血清中總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、尿素（UREA）和堿性磷酸酶（ALP）含量；采用免疫比濁法測定血清中免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）和免疫球蛋白M（IgM）含量，試劑盒由南京建成生物功能研究所提供；總超氧化物歧化酶（T-SOD）、總抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）以及溶菌酶（LZM）的測定所用試劑盒購自南京建成生物功能研究所，具體操作步驟嚴格按照說明書進行。

1.4.3 十二指腸腸絨毛形態(tài)觀察 在試驗第70 天，提前1 d 晚上給豬結料，空腹12 h，每處理隨機選取4 頭豬處死后迅速打開腹腔，結扎各個腸段，取十二指腸腸管約2 cm，用PBS 緩沖液沖洗后放入4% 多聚甲醛固定，之后進行脫水、石蠟包埋、切片及HE 染色。使用顯微鏡觀察HE 染色后的腸道組織切片，用VENTANA Image Viewer 軟件隨機選取5 根完整絨毛測量其絨毛高度和隱窩深度，計算絨毛高度與隱窩深度比值，取平均值用于數據統(tǒng)計分析。絨毛長度是指絨毛頂端到隱窩開口的長度，隱窩深度是指腸腺底部到兩絨毛之間基部開口處的距離。

1.4.4 腸道酶活 分別取5 g 結腸、回腸食糜放入無菌離心管中，按1:4 的比例加入預冷的生理鹽水后充分勻漿，4℃，2 500 r/min 離心10 min，取上清液存放于-20℃待測。采用碘-淀粉法測定淀粉酶活力；采用化學比濁法測定脂肪酶活性；用比色法測定胰蛋白酶和糜蛋白酶活性，測定所用試劑盒購自南京建成生物功能研究所。

1.5 統(tǒng)計分析 試驗數據經Excel 2016 處理后，采用SPSS 21.0 軟件的單因素ANOVA 程序進行顯著性分析，用 Duncan′s 法進行組間的多重比較，以P＜0.05 作為差異顯著性判斷標準，試驗結果以平均值±標準誤表示。

2 結果與分析

2.1 菌絲霉素對生長育肥豬生長性能的影響 由表2 可知，在整個試驗期，吉他霉素和菌絲霉素對試驗豬的末體重、ADG、ADFI 和F/G 均無顯著影響。

2.2 菌絲霉素對生長育肥豬血清生化指標的影響 由表3 可知，HPle 組豬的血清ALP、IgA、IgG、IgM 和LZM 含量均高于其他3 組（P＜0.05），但NC 組、PC 組、LPle 組間差異均不顯著。各組間豬的血清TP、ALB 和UREA 含量差異均不顯著，但HPle 組TP 和ALB 含量均為最高。相較于NC 組，HPle 組豬的血清IgA、IgG、IgM 含量分別提高了29.41%、10.06%和24.64%（P＜0.05）。相較于PC 組，HPle 組豬的血清IgA、IgG、IgM 含量分別提高了20.88%、15.16%和26.47%（P＜0.05）。

2.3 菌絲霉素對生長育肥豬血清抗氧化指標的影響 由表4 可知，HPle 組豬的血清T-SOD 和T-AOC 含量均高 于NC 組（P＜0.05），NC 組、PC 組、LPle 組間差異不顯著。與NC 組相比，HPle 組豬的血清MDA 含量顯著降低。各組間血清中GSH 的含量無顯著差異。

2.4 菌絲霉素對生長育肥豬十二指腸形態(tài)的影響 由表5 可知，相較于NC 組，LPle 組和HPle 組豬的十二指腸絨毛高度分別提高了54.29%和37.49%（P＜0.05）；相較于PC 組，LPle 組和HPle 組豬的十二指腸絨毛高度分別提高41.78%和26.34%（P＜0.05）。除LPle 組外，其他各組間豬的隱窩深度差異不顯著。與NC 組相比，PC 組、LPle 組和HPle 組未見對十二指腸絨毛高度/隱窩深度產生顯著影響。

表2 菌絲霉素對生長育肥豬生長性能的影響（n=11）

表3 菌絲霉素對生長育肥豬血清生化指標的影響（n=6）

2.5 菌絲霉素對生長育肥豬回腸和結腸消化酶活性的影響 由表6 可知，與NC 組相比，LPle 組豬的回腸胰蛋白酶活性顯著提高，LPle 組和HPle 組豬的回腸淀粉酶活性均有升高的趨勢（P=0.09）；與PC 組相比，LPle 組、HPle 組以及NC 組豬的結腸淀粉酶活性顯著提高，其余各組間回腸和結腸的消化酶活性無顯著差異。

3 討 論

3.1 菌絲霉素對生長育肥豬生長性能的影響 許多研究表明，飼糧中添加抗菌肽能夠促進豬的生長[4,8-9]，但有關菌絲霉素在生長育肥豬生產中應用效果的研究很少。本試驗結果表明，與不添加抗生素組相比，飼糧中添加100 mg/kg 和200 mg/kg 菌絲霉素增加了豬的末體重，F/G 有降低趨勢?；潞Ａ盏萚10]研究表明，飼糧中添加天蠶素抗菌肽CAD 能夠一定程度上提高仔豬ADG、ADFI，降低F/G，但差異均不顯著。Xiong 等[3]報道，飼糧中添加復合抗菌肽能夠顯著提高斷奶仔豬的ADG和ADFI，并且顯著降低F/G。侯改鳳等[9]發(fā)現，飼料中添加50 mg/kg 抗菌肽制劑顯著提高了育肥豬ADG 及飼料轉化率，促進了育肥豬生長。李延等[5]研究表明，與對照組相比，抗菌肽（重組菌絲霉素）組能夠顯著提高斷奶仔豬ADFI 和ADG，顯著降低F/G，并且菌絲霉素對生長性能的促進作用與抗生素效果類似。本試驗中，菌絲霉素組豬的生長性能相較于對照組有提高的趨勢，可能是各處理樣本數量較少，組內差異相對較大，掩蓋了組間差異。

3.2 菌絲霉素對生長育肥豬血清生化指標的影響 血清生化指標可反映動物機體的代謝情況，并且血清生化指標與機體的營養(yǎng)狀況以及疾病有著密切聯系。臨床上，ALP、谷草轉氨酶（AST）、ALB 以及UREA 含量是反映肝臟、胰腺以及腎臟功能的重要指標[11]；TP 和ALB 含量則反映機體蛋白和氨基酸的吸收代謝情況。本試驗中，飼糧中添加菌絲霉素能一定程度上提高ALP含量，各組間血清TP、ALB 和UREA 含量差異不顯著，表明各組豬的機體代謝功能相近且無異常。IgA、IgG 和IgM 是廣泛存在于動物機體內參與體液免疫反應的球蛋白，IgA 和IgG 具有抗病毒、抑真菌等免疫活性，IgM 具有激活補體等作用[4]。動物血清中免疫球蛋白含量的變化與其健康狀態(tài)、生長狀況密切相關。溶菌酶由巨噬細胞合成并快速釋放，作用于細菌細胞壁可水解其中的黏多糖，導致細菌裂解死亡，從而發(fā)揮殺菌作用。盧俊鑫等[4]研究表明，飼糧中添加天蠶素可以提高血清中IgG 和IgM 含量，添加抗菌肽PR39 可顯著增加血清中IgG 含量。在肉仔雞飼糧中添加抗菌肽可顯著提高血清中IgA 含量[12]。本試驗中，與不添加抗生素組和吉他霉素組相比，飼料中添加菌絲霉素提高了血清中IgA、IgG 和IgM 含量，增強了體液免疫反應。范少本[13]研究表明，小肽類物質進入動物體內后形成與氨基酸合成有關的谷氨酰胺、α-酮戊二酸等重要中間代謝產物，而谷氨酰胺在動物體內通過脫氨基或轉氨基作用合成多種非必需氨基酸，參與并促進體內免疫球蛋白的合成。而血清中TP、ALB 含量增加說明機體蛋白質吸收、合成和代謝功能加強，而機體蛋白質的增加可為免疫球蛋白合成提供原料，這在一定程度上也反映了機體免疫力的增強。抗生素在殺死體內病原菌的同時也會殺死有益菌，并且可進入動物體內的血液循環(huán)系統(tǒng)，對免疫系統(tǒng)造成一定的不良影響。

表4 菌絲霉素對生長育肥豬血清抗氧化指標的影響（n=6）

表5 菌絲霉素對生長育肥豬十二指腸形態(tài)的影響（n=4）

表6 菌絲霉素對生長育肥豬回腸和結腸酶活的影響（n=4）

3.3 菌絲霉素對生長育肥豬血清抗氧化指標的影響 機體在代謝過程中會產生活性氧自由基（ROS）。正常生理狀態(tài)下，動物體內活性氧的產生和清除處于動態(tài)平衡之中，氧自由基的清除機制主要分為酶促和非酶促兩類。酶促系統(tǒng)包括超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和過氧化物酶（POD）[14]。非酶促系統(tǒng)包括抗壞血酸（VC）、谷胱甘肽、維生素E、類胡蘿卜素等，T-AOC 可從總體上反映機體防御系統(tǒng)抗氧化能力的高低，從而體現機體的健康狀況[15]。MDA 是機體內ROS 攻擊生物膜中多不飽和脂肪酸產生的脂質過氧化產物的分解產物，具有細胞毒性，其含量可顯示機體內脂質過氧化的程度，從而間接地反映細胞氧化損傷的嚴重性[16]。但啟雄等[17]研究發(fā)現，在基礎日糧中添加不同濃度復合抗菌肽可顯著提高斷奶仔豬血清中T-SOD、GSH-Px 活力和T-AOC水平，且MDA 含量顯著降低。本試驗中，飼糧中添加菌絲霉素能夠提高血清T-SOD、T-AOC 含量，說明菌絲霉素能夠提高生長育肥豬的抗氧化能力，減少氧化應激，MDA 含量的減少表明菌絲霉素可保護細胞膜結構的完整性，減弱動物機體的氧化損傷[17]。目前關于菌絲霉素對豬血清抗氧化機理的報道較少，其發(fā)揮作用的機制可能是菌絲霉素的氨基酸殘基可與機體內陽離子結合或者抑制氫離子的釋放，延緩脂質過氧化反應，從而發(fā)揮抗氧化作用[18]；與此同時，菌絲霉素中谷氨酸（Glu）和天冬氨酸（Asp）殘基可螯合金屬離子，降低機體內氧化反應速度[13]。

3.4 菌絲霉素對生長育肥豬十二指腸形態(tài)的影響 小腸是消化道內營養(yǎng)物質消化和吸收的主要部位，其功能單位是絨毛，腸黏膜表面有無數絨毛（長度約為300～500 μm），從而極大地增加了腸道吸收營養(yǎng)物質的面積[19]。小腸的絨毛高度、隱窩深度以及絨毛高度/隱窩深度都是衡量小腸消化吸收功能以及腸黏膜結構形態(tài)完整性的重要指標[20]。絨毛高度/隱窩深度綜合反映了腸黏膜結構形態(tài)的完整性，比值增大說明小腸消化吸收能力增強；比值下降則表明黏膜受損，消化吸收功能下降。本試驗中，在飼糧中添加菌絲霉素均能提高十二指腸絨毛高度，并且在一定程度上提高其絨毛高度/隱窩深度，這與馬衛(wèi)明等[21]和宦海琳等[10]報道的抗菌肽能夠提高十二指腸絨毛高度的結果吻合。LPle 組的十二指腸隱窩深度變深，這與宦海琳等[10]報道的抗菌肽能夠降低隱窩深度的結果相反；但李延[22]研究表明，添加菌絲霉素對斷奶仔豬十二指腸隱窩深度沒有影響。造成這種差異的原因可能是低劑量菌絲霉素對豬的作用效果沒有高劑量菌絲霉素顯著?？咕哪軌蛲ㄟ^抑制有害菌的生長，減少內毒素的產生及腸道有害菌對其腸黏膜的破壞作用，同時還可促進有益菌的生長，維持腸道健康的微生物區(qū)系，從而有效改善生長育肥豬十二指腸的腸黏膜形態(tài)結構。吉他霉素組可降低腸道有害菌數量，但同時也會殺害有益菌，因此吉他霉素能夠提高生長育肥豬的絨毛高度，但效果不如菌絲霉素。

3.5 菌絲霉素對生長育肥豬回腸和結腸消化酶活性的影響腸道內消化酶主要起吸收和消化營養(yǎng)物質的功能[23]。消化酶活性的升高有利于促進營養(yǎng)物質在體內的消化利用。Wan 等[24]發(fā)現，在斷奶仔豬日糧中添加菌絲霉素能夠刺激并促進雙糖酶等消化酶的分泌。本試驗獲得了與其相似的結果，在飼糧中添加菌絲霉素能顯著提高回腸胰蛋白酶和結腸淀粉酶的活性，且具有提高回腸淀粉酶活性的趨勢，但吉他霉素對其消化酶活性沒有影響。消化酶活性的提高表明豬的吸收能力增強，飼喂菌絲霉素的豬的吸收能力增強很有可能與菌絲霉素提高腸絨毛高度和絨毛高度/ 隱窩深度有關[25]。綜上所述，在飼料中添加菌絲霉素能夠提高生長育肥豬腸道消化酶的活性，促進其對營養(yǎng)物質的消化吸收。

4 結 論

本試驗條件下，飼糧中添加菌絲霉素對生長育肥豬的生長性能有提高的趨勢，顯著改善了腸道形態(tài)、血清生化指標、免疫性能以及抗氧化能力。綜合考量以添加200 mg/kg 菌絲霉素的效果最佳，抗菌肽菌絲霉素在提高動物生產性能、促進消化吸收方面具有一定替代抗生素的潛力。