夏 青 ，王翔宇，胡文萍，馬 琳，張效生，張金龍，狄 冉*，儲(chǔ)明星*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381）

世界上絕大多數(shù)綿羊?yàn)榧竟?jié)性發(fā)情品種，僅有少數(shù)品種為常年發(fā)情[1-2]。季節(jié)性發(fā)情是限制綿羊生產(chǎn)效率的重要因素之一，因此，找到參與季節(jié)性發(fā)情調(diào)控機(jī)制的關(guān)鍵基因，研究其參與季節(jié)性發(fā)情的分子機(jī)制并應(yīng)用于育種實(shí)踐，是提高綿羊繁殖力的有效方法之一。季節(jié)性發(fā)情基因-眼缺失基因（Eyes Absent，EYA）可編碼一類眼缺失家族蛋白，EYA 家族蛋白具有磷酸酶活性，對(duì)于視網(wǎng)膜的發(fā)育具有重要調(diào)控作用[3-5]，其中EYA3作為晝夜節(jié)律基因?qū)d羊季節(jié)性發(fā)情具有間接調(diào)控作用[6-8]。本實(shí)驗(yàn)室前期選取了常年發(fā)情組（湖羊、小尾寒羊和策勒黑羊）和季節(jié)性發(fā)情組（灘羊、蘇尼特羊和草原型藏羊）共6 個(gè)品種[9-10]，對(duì)這6 個(gè)綿羊品種進(jìn)行全基因組重測(cè)序，發(fā)現(xiàn)EYA3基因編碼區(qū)上游調(diào)控區(qū)存在突變位點(diǎn)g.238191128G＞C。

本研究選擇常年發(fā)情的小尾寒羊和季節(jié)性發(fā)情的蘇尼特羊，檢測(cè)在發(fā)情相關(guān)組織中EYA3基因的表達(dá)特征并分析2 個(gè)不同品種之間的表達(dá)差異。利用Sequenom Mass ARRAY?SNP 技術(shù)對(duì)EYA3基因g.238191128G＞C位點(diǎn)在2 組不同品種綿羊中分型，分析該位點(diǎn)的多態(tài)性，并與季節(jié)性發(fā)情性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)，以揭示EYA3基因g.238191128G＞C 位點(diǎn)與綿羊季節(jié)性發(fā)情的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)樣品采集 實(shí)驗(yàn)羊來(lái)自天津市畜牧獸醫(yī)研究所畜禽繁育基地人工控光條件下飼養(yǎng)的2～3 周歲的健康卵巢切除（Ovariectomised,OVX）母羊。人工控光模型為兩品種母羊在短光照（白天8 h，黑夜16 h）（人工模擬發(fā)情季節(jié)）下，飼養(yǎng)42 d 后，轉(zhuǎn)至長(zhǎng)光照（白天16 h，黑夜8 h）（人工模擬非休情季節(jié)）飼養(yǎng)49 d，并根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[7,11-12]選擇在長(zhǎng)光照條件下49 d 的小尾寒羊（Small Tail Han sheep，STH）母羊和蘇尼特羊（Sunite sheep，SNT）母羊各3 只。屠宰后，迅速采集垂體、下丘腦和大腦共3種新鮮組織樣品，裝入2 mL凍存管，并儲(chǔ)存在-80℃冰箱中備用。

1.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中綿羊EYA3基因序列（GenBank 登錄號(hào)：XM_004002368），用Primer 3軟件設(shè)計(jì)1 對(duì)熒光定量引物，內(nèi)參基因選用β-actin，引物信息見表1。

1.3 組織RNA 提取和cDNA 合成 利用動(dòng)物組織總RNA 提取試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）采用Trizol（Invitrogen，美國(guó)）法提取各組織總RNA，并用Nanodrop 2000 檢測(cè)提取的RNA 濃度和OD 值，用1.0% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 完整性。使用PrimerScriptTMRT Reagent Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈，按照說(shuō)明書進(jìn)行操作。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋后，用內(nèi)參基因β-actin進(jìn)行PCR 檢測(cè)，檢測(cè)合格后，-20℃保存。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR） 根據(jù)課題組前期設(shè)置的qPCR 體系和程序[13-14]，其中qPCR 體系總體積為20 μL：SYBR?Premix ExTaqTMⅡ 10 μL，RNase-Free ddH2O 6.4 μL，上、下 游 引 物(10 nmol/L) 各0.8 μL，cDNA 2 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 s；95℃變性5 s，60℃退火30 s，40 個(gè)循環(huán)。建立和繪制目的基因及持家基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測(cè)引物擴(kuò)增效率和熔解曲線狀態(tài)，并進(jìn)行qPCR 反應(yīng)以檢測(cè)目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 基因分型 對(duì)EYA3基因g.238191128G＞C 位點(diǎn)在不同發(fā)情性狀的綿羊品種中進(jìn)行分型，采用Sequenom MassARRAY?SNP 技術(shù)對(duì)該位點(diǎn)進(jìn)行基因型檢測(cè)。分型樣品選擇：小尾寒羊407 只、湖羊101 只、策勒黑羊52 只、灘羊22 只、蘇尼特羊21 只和草原型藏羊161 只，其中小尾寒羊、湖羊、策勒黑羊?yàn)槌Ｄ臧l(fā)情品種，其他為季節(jié)性發(fā)情品種。分型樣品為DNA，每個(gè)樣品需要量為20 μL，DNA 濃度為40～80 ng/μL。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 根據(jù)2-ΔΔCt法[13,15]計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量；借助Excel 計(jì)算EYA3基因g.238191128G＞C 位點(diǎn)的基因型頻率、等位基因頻率、多態(tài)信息含量（PIC）、雜合度（He）及有效等位基因數(shù)（Ne），并進(jìn)行Hardy-Weinberg 檢測(cè)。利用SPSS 19.0 軟件中卡方獨(dú)立性檢驗(yàn)進(jìn)行常年發(fā)情組和季節(jié)性發(fā)情組間基因頻率與基因型頻率差異顯著性檢驗(yàn)，所得數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果

2.1EYA3基因在不同特征綿羊品種季節(jié)性發(fā)情相關(guān)組織中的表達(dá) 如圖1 所示。EYA3基因在小尾寒羊和蘇尼特羊大腦、下丘腦和垂體3 種組織中均有表達(dá)，其中蘇尼特羊EYA3基因在垂體中表達(dá)量極顯著高于大腦；且長(zhǎng)光照條件下蘇尼特羊垂體組織EYA3表達(dá)量顯著高于小尾寒羊垂體組織，而大腦和下丘腦EYA3表達(dá)量在小尾寒羊和蘇尼特羊之間均無(wú)顯著差異。

2.2EYA3基因的多態(tài)性分析 通過(guò)基因分型發(fā)現(xiàn)EYA3基因g.238191128G＞C 位點(diǎn)在常年發(fā)情和季節(jié)性發(fā)情綿羊品種中均存在3 種基因型，分別是GG、GC 和CC（圖2）。

表1 引物信息

由表2 可知，綿羊EYA3基因g.238191128G＞C 位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率在常年發(fā)情和季節(jié)性發(fā)情綿羊品種間差異均達(dá)到極顯著水平，且無(wú)論在常年發(fā)情還是季節(jié)性發(fā)情品種中C 均是優(yōu)勢(shì)等位基因。

如表3 所示。綿羊EYA3基因g.238191128G＞C 位點(diǎn)在小尾寒羊、湖羊、策勒黑羊、灘羊、蘇尼特羊和草原型藏羊中表現(xiàn)為低度多態(tài)（PIC＜0.25）。卡方適合性檢驗(yàn)結(jié)果表明，該位點(diǎn)在小尾寒羊、策勒黑羊、灘羊、蘇尼特羊和草原型藏羊5 個(gè)群體中均處于哈代溫伯格平衡狀態(tài)（P＞0.05）。

3 討 論

3.1EYA3基因表達(dá)與綿羊發(fā)情之間的關(guān)系 有研究報(bào)道，EYA3基因在綿羊多種組織中廣泛表達(dá)，且長(zhǎng)光照表達(dá)量高于短光照[14,16]；EYA3基因在大鼠下丘腦中有表達(dá)[17]；EYA3基因在人類骨髓、胚胎、肝、肌肉、大腦和腸中均有表達(dá)[18]。本研究發(fā)現(xiàn)無(wú)論在小尾寒羊還是蘇尼特羊中，EYA3基因在3 種組織中均廣泛表達(dá)，與上述相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道相一致。本實(shí)驗(yàn)中，EYA3基因在蘇尼特羊垂體的表達(dá)量高于大腦和下丘腦，結(jié)合相關(guān)報(bào)道[11,19-20]，推測(cè)EYA3基因可能主要在蘇尼特羊垂體部位發(fā)揮作用，而垂體直接參與下丘腦-垂體-性腺軸（Hypothalamic-pituitary-gonadal Axis，HPGA）的 生理調(diào)控過(guò)程。在長(zhǎng)光照條件下，外界光照刺激綿羊松果體分泌褪黑素，褪黑素與褪黑素受體結(jié)合促使季節(jié)性發(fā)情的蘇尼特羊垂體結(jié)節(jié)部的EYA3基因表達(dá)量上升[12,21]，高濃度EYA3上調(diào)TSHβ的表達(dá)量，最終導(dǎo)致T3 濃度升高，蘇尼特羊進(jìn)入休情狀態(tài)[22]。由于本實(shí)驗(yàn)采取的是在長(zhǎng)光照下飼養(yǎng)的蘇尼特羊和小尾寒羊組織，即長(zhǎng)光照下蘇尼特羊垂體EYA3表達(dá)量顯著高于小尾寒羊，蘇尼特羊中高濃度的EYA3 間接促使蘇尼特羊進(jìn)入休情狀態(tài)，而小尾寒羊中EYA3 濃度較低，在長(zhǎng)光照下依舊可維持發(fā)情狀態(tài)。

3.2EYA3基因多態(tài)性及其與綿羊發(fā)情之間的關(guān)系 目前，關(guān)于綿羊EYA3基因的多態(tài)性及其與綿羊季節(jié)性發(fā)情之間關(guān)系的研究鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，綿羊EYA3基因g.238191128G＞C 位點(diǎn)在小尾寒羊、湖羊、策勒黑羊、灘羊、蘇尼特羊和草原型藏羊中表現(xiàn)為低度多態(tài)（PIC＜0.25），說(shuō)明其多態(tài)性較低，選擇潛力不大。卡方適合性檢驗(yàn)結(jié)果表明，該位點(diǎn)在小尾寒羊、策勒黑羊、灘羊、蘇尼特羊和草原型藏羊5 個(gè)群體中均處于哈代溫伯格平衡狀態(tài)，說(shuō)明種群未受到人工或自然選擇、遷移和遺傳漂變的影響。該位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率在常年發(fā)情和季節(jié)性發(fā)情綿羊品種間差異均達(dá)到極顯著水平，推測(cè)該位點(diǎn)突變?cè)谝欢ǔ潭壬吓c季節(jié)性發(fā)情有關(guān)。

表2 EYA3 基因g.238191128G＞C 位點(diǎn)在常年發(fā)情和季節(jié)性發(fā)情綿羊品種中的基因型頻率和等位基因頻率

表3 EYA3 基因g.238191128G＞C 位點(diǎn)在不同綿羊品種中的群體遺傳學(xué)分析

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)初步提示EYA3基因表達(dá)可能與綿羊季節(jié)性發(fā)情有關(guān)，該基因的高表達(dá)能促使蘇尼特羊進(jìn)入休情狀態(tài)，g.238191128G＞C 位點(diǎn)與綿羊季節(jié)性發(fā)情性狀存在顯著相關(guān)，推測(cè)該基因是綿羊季節(jié)性發(fā)情調(diào)控基因之一。