萬樹威，李震，曹輝

（鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 腔內(nèi)血管外科，河南 鄭州 450000）

移植靜脈再狹窄的主要原因是血管內(nèi)膜的過度增生，這是一個(gè)多因素參與的病理生理過程，具體的細(xì)胞和分子機(jī)制目前尚不清楚[1-2]。microRNA（miRNA）是一類小的非編碼RNA，它們?cè)谵D(zhuǎn)錄后基因調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用，在多種生物過程中調(diào)控基因表達(dá)，包括細(xì)胞分化，增殖，新陳代謝和炎癥反應(yīng)等[3]。miRNA與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展也密切相關(guān)，多種心血管疾病中都有miRNA的異常表達(dá)[4-5]。近年來，以miRNA干預(yù)為基礎(chǔ)的基因治療方法已經(jīng)成為心血管疾病研究中的一個(gè)新興領(lǐng)域，并在相關(guān)的動(dòng)物模型中取得了一定進(jìn)展；比如miRNA介導(dǎo)的抗血管生成基因沉默可以有效促進(jìn)缺血心肌局部新血管形成[6]。鑒于此，本研究通過構(gòu)建大鼠自體靜脈移植模型，采用高通量測(cè)序技術(shù)獲取移植靜脈的miRNA表達(dá)譜，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，希望能為移植靜脈再狹窄的防治工作提供更多線索。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（武漢博士德公司）；10%水合氯醛溶液（美國(guó)Sigma公司）；4%多聚甲醛溶液（美國(guó)Sigma公司）；TRIzol試劑（美國(guó)Invitrogen公司）；mirVana RNA分離試劑盒（美國(guó)Applied Biosystems公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

無特定病原體的雄性Sprague-Dawley大鼠30只，體質(zhì)量250～300 g，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)碼：SCXK（滬）2018-0006，合格證編號(hào)：20180006004335。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的操作及飼養(yǎng)均符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》相關(guān)規(guī)定，并通過鄭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審查和批準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)大鼠被隨機(jī)分為3組：對(duì)照組、術(shù)后3 d組（POD 3組）、術(shù)后14 d組（POD 14組），每組10只。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物模型的制作術(shù)前禁食12 h。10%水合氯醛（0.4 mL/100 g）行腹腔注射麻醉，待麻醉滿意后，四肢固定，仰臥于恒溫墊上，維持肛溫在36.5～37.5 ℃之間。備皮，碘伏消毒手術(shù)區(qū)域，鋪巾。取左側(cè)胸鎖乳突肌前緣切口，顯露并分離左側(cè)頸外靜脈截取中間靜脈約0.8 cm備用。取腹正中切口約3～4 cm長(zhǎng)，游離、顯露腹主動(dòng)脈。無創(chuàng)血管夾將其阻斷，精細(xì)剪離斷腹主動(dòng)脈，使用10-0無損傷縫線，采用間斷縫合的方法，將頸外靜脈移植到腎下腹主動(dòng)脈上并縫合后腹膜。還納胃和腸管，6-0線逐層縫合腹膜、肌肉、皮下組織和皮膚。關(guān)腹完畢，碘伏消毒傷口。術(shù)后動(dòng)物房分籠飼養(yǎng)，勤換墊料，注意觀察。分別于術(shù)后3、14 d取材，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。對(duì)照組大鼠僅分離出左側(cè)頸外靜脈，不做移植處理。

1.3.2 總RNA的抽提與測(cè)序使用mirVana RNA試劑盒從移植血管中提取總RNA，Nanodrop ND-2000對(duì)總RNA進(jìn)行定量處理，Agilent Bioanalyzer 2100評(píng)估RNA質(zhì)量。合格樣本交由上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司進(jìn)行測(cè)序工作。

1.3.3 miRNA的表達(dá)與差異分析對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，通過火山圖評(píng)估所檢測(cè)到的miRNA整體分布情況，然后對(duì)miRNA進(jìn)行非監(jiān)督層次聚類分析。最后按照|fold change|＞2且P＜0.05的條件篩選出差異表達(dá)的基因。

1.3.4 靶基因的功能分析基因本體論（GO）富集分析，即對(duì)該物種差異表達(dá)的miRNA靶基因進(jìn)行功能注釋和歸類，將該物種所有基因作為背景列表，差異表達(dá)的miRNA靶基因作為從背景列表中篩選出來的候選列表，利用超幾何分布檢驗(yàn)計(jì)算代表GO功能集在差異miRNA靶基因列表中是否顯著富集的P值，并檢驗(yàn)糾正。京都基因與基因組百科全書（KEGG）信號(hào)通路富集分析，KEGG是有關(guān)細(xì)胞通路的公共數(shù)據(jù)庫(kù)，利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異 miRNA靶基因進(jìn)行細(xì)胞通路分析，并計(jì)算每條通路條目中差異miRNA靶基因富集的顯著性。計(jì)算所得小的P值表示差異miRNA靶基因在該通路中出現(xiàn)了富集。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，均數(shù)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)及單因素方差分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模結(jié)果

HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠頸外靜脈血管壁較薄，內(nèi)膜僅為單層的內(nèi)皮細(xì)胞，無內(nèi)膜增生；POD 3組內(nèi)膜未見明顯增生；POD 14組可見明顯的內(nèi)膜增生，血管壁開始增厚（圖1）。

圖1 各組靜脈內(nèi)膜變化情況（HE×200）Figure 1 Changes in venous intima of each group(HE×200)

2.2 miRNA的表達(dá)與差異分析結(jié)果

POD 14組與對(duì)照組比較，明顯上調(diào)的miRNA數(shù)目為183，明顯下調(diào)的miRNA數(shù)目為82；POD 14組與POD 3組比較，明顯上調(diào)miRNA數(shù)目為94，明顯下調(diào)的miRNA數(shù)目為64。繪制火山圖了解差異表達(dá)的miRNA整體分布情況（圖2）。對(duì)差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行非監(jiān)督層次聚類分析，同一類樣本能通過聚類出現(xiàn)在同一個(gè)簇中，而聚在同一個(gè)簇中的miRNA可能具有相似的生物學(xué)功能（圖3）。

2.3 靶基因功能分析結(jié)果

GO富集分析篩選出了生物學(xué)過程（BP）、細(xì)胞組分（CC）、分子功能（MF）3種分類中富集基因數(shù)目排在前10位的GO條目，結(jié)果提示富集的基因主要參與了對(duì)DNA轉(zhuǎn)錄過程的調(diào)節(jié)、對(duì)細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控和對(duì)蛋白質(zhì)磷酸化過程的調(diào)節(jié)（圖4）。繪制topGO有向無環(huán)圖，直觀展示靶基因富集的GO節(jié)點(diǎn)及其層級(jí)關(guān)系；分支代表的包含關(guān)系，從上至下所定義的功能描述范圍越來越具體，對(duì)GO的3大分類（CC，BP，MF）的每一類都取富集程度最高的前10位作為無環(huán)圖的主節(jié)點(diǎn)，用矩形表示，并通過包含關(guān)系將相關(guān)聯(lián)的GO條目一起展示，顏色的深淺表示富集程度，顏色越深代表富集程度越高（圖5）。KEGG信號(hào)通路分析篩選結(jié)果見圖6（圖中每個(gè)小點(diǎn)對(duì)應(yīng)一個(gè)通路，顏色按紅，橙，黃，綠，藍(lán)，靛，紫對(duì)應(yīng)P值從小到大排序，P值越小，顏色越趨向于紅色，點(diǎn)越大表示該通路中基因個(gè)數(shù)越多），結(jié)果顯示，最有可能參與移植靜脈內(nèi)膜增生過程的信號(hào)通路有MAPK信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路、緊密連接、cGMP-PKG信號(hào) 通路。

圖2 反應(yīng)各組間差異表達(dá)miRNA整體分布情況的火山圖Figure 2 Volcano plots representing the general distributions of the diff erentially expressed miRNAs

圖3 差異性表達(dá)miRNA的聚類分析（紅色表示高表達(dá)，藍(lán)色表示低表達(dá)）Figure 3 Cluster analysis of the diff erentially expressed miRNAs(red color representing high expression,and blue color representing low expression)

圖4 差異表達(dá)miRNA的靶基因的GO富集分析Figure 4 GO enrichment analysis of the target genes of the diff erentially expressed miRNAs

圖5 部分差異表達(dá)miRNA靶基因topGO有向無環(huán)圖Figure 5 The topGO-directed acyclic graph for some target genes of the diff erentially expressed miRNAs

圖6 差異表達(dá)miRNA靶基因進(jìn)行KEGG通路分析Figure 6 KEGG pathway analysis of the target genes of the diff erentially expressed miRNAs

3 討論

miRNA常通過與靶基因發(fā)生特異性結(jié)合發(fā)揮調(diào)控作用[7-8]。一種miRNA可調(diào)節(jié)多種靶基因，而一種靶基因也可分別被多種miRNA所結(jié)合[9-10]。多項(xiàng)研究[11-13]表明miRNA是心血管疾病重要的調(diào)控因子。有報(bào)道[14]稱miRNA參與了頸動(dòng)脈損傷后的內(nèi)膜增生過程，過表達(dá)miR-146a可促進(jìn)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖，改善頸動(dòng)脈損傷后的內(nèi)膜增生。Zhang等[15]認(rèn)為miR-451可以通過MAPK通路緩解血管平滑肌細(xì)胞損傷從而保護(hù)新生內(nèi)膜。這些證據(jù)提示miRNA能夠參與了血管內(nèi)膜增生過程。實(shí)際上，在防治移植靜脈再狹窄的研究中，基于miRNA干預(yù)的基因治療方法已經(jīng)被證明是可行有效的[16]。Wen等[17]開發(fā)了一種可以搭載TMC-g-PEG-VAPG/miRNA-145復(fù)合物的新型功能性電紡膜，實(shí)現(xiàn)了miRNA-145的定向傳遞，能夠持久抑制血管平滑肌細(xì)胞過度增殖和血管內(nèi)膜增生。Cao等[18]通過慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)實(shí)現(xiàn)了let-7a在大鼠移植靜脈中的高表達(dá)從而抑制大鼠靜脈移植術(shù)后內(nèi)膜的過度增生。miR-221在調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞增殖和表型轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用，腺病毒介導(dǎo)的miR-221基因治療可以抑制靜脈移植物新生內(nèi)膜增生[19]。

大鼠靜脈移植模型是研究移植靜脈再狹窄機(jī)制重要工具。移植靜脈在術(shù)后的早期階段以細(xì)胞壞死凋亡、基質(zhì)分解為主；術(shù)后第3天，血管中的平滑肌細(xì)胞開始由收縮型向合成型轉(zhuǎn)變。術(shù)后第7～28天是細(xì)胞增殖高峰時(shí)期，這個(gè)階段血管平滑肌細(xì)胞發(fā)生增殖和遷移、細(xì)胞外基質(zhì)合成，靜脈的內(nèi)膜厚度增加[20-21]。本研究選取術(shù)后3、14 d兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序，能夠較好地反映移植靜脈在內(nèi)膜增生過程中的miRNA表達(dá)變化情況。

POD 14組與對(duì)照組比較，顯著上調(diào)的miRNA數(shù)目為183，顯著下調(diào)的miRNA數(shù)目為82；POD 14組與POD 3組相比較，顯著上調(diào)miRNA數(shù)目為94，顯著下調(diào)的miRNA數(shù)目為64。其中部分差異表達(dá)的miRNA已被證實(shí)與血管平滑肌細(xì)胞的增殖遷移過程相關(guān)[22-25]。有研究報(bào)道m(xù)iRNA-92a可促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移[26-27]；本研究還發(fā)現(xiàn)某些未報(bào)道過的miRNA在大鼠的移植血管中表達(dá)升高，參與了移植靜脈內(nèi)膜增生過程，但具體的調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。通過對(duì)miRNA靶基因進(jìn)行功能分析，我們發(fā)現(xiàn)富集的信號(hào)通路有MAPK信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路、緊密連接結(jié)構(gòu)、cGMP-PKG信號(hào)通路等，這顯示出miRNA調(diào)控作用的廣泛性和機(jī)制的復(fù)雜性。

總之，本研究通過測(cè)序技術(shù)檢測(cè)了大鼠移植靜脈miRNA差異表達(dá)情況，這將為防治移植靜脈再狹窄的研究提供更多有價(jià)值的信息。