殷朝敏 范秀芝 劉純友 陳浙婭 馬 昆 史德芳程 薇 高 虹

(1湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所,湖北武漢 430064；2國(guó)家食用菌加工技術(shù)研發(fā)分中心,湖北武漢 430064；3廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院,廣西柳州 545006；4華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,湖北武漢 430070)

高血脂是困擾人們的一種富貴病,主要由飲食中脂肪或膽固醇攝入過(guò)多等所致,高血脂及其引發(fā)的多種心腦血管疾病已成為危及人類健康的頭號(hào)殺手[1]。據(jù)《中國(guó)健康大數(shù)據(jù)》統(tǒng)計(jì),我國(guó)高血脂患病人數(shù)已高達(dá)1.6億。目前,已有多種降血脂藥物,如脂必妥、血脂康等,這些藥物的主要成分均為他汀類化合物。早在1976年,Endo等[2]發(fā)現(xiàn)產(chǎn)自橘青霉(Penicillum citrinum)的一種化合物能有效抑制膽固醇的合成,并將此化合物命名為美伐他汀。隨著研究的不斷深入,人們發(fā)現(xiàn)高劑量的美伐他汀會(huì)產(chǎn)生一定的副作用,如促成淋巴瘤的形成等[3],從而限制了美伐他汀的應(yīng)用。幾年后,研究者從土曲霉(Aspergillus terreus)中分離出另一種化合物,該化合物對(duì)膽固醇合成的抑制能力遠(yuǎn)高于美伐他汀,且無(wú)副作用,并將其命名為洛伐他汀[4]。研究表明,洛伐他汀能競(jìng)爭(zhēng)性地抑制膽固醇生物合成限速酶——HMG-CoA還原酶(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase),繼而抑制內(nèi)源性膽固醇合成,調(diào)節(jié)體內(nèi)異常血脂的生成[5]。洛伐他汀除可以降低體內(nèi)膽固醇外,還對(duì)過(guò)度興奮和癲癇發(fā)作有一定的抑制作用[6]；此外,小鼠試驗(yàn)表明,洛伐他汀對(duì)神經(jīng)內(nèi)分泌疾病、癌癥、阿爾茨海默氏病、骨質(zhì)疏松癥以及內(nèi)臟異常性疼痛等也有一定的治療效果[7-9]。

目前,已在側(cè)耳屬(Pleurotusspp.)[10]、紅曲霉屬(Monascusspp.)[11-12]、青霉菌(Penicilliumspp.)[13]、曲霉屬(Aspergillusspp.)[14-15]等多種真菌中發(fā)現(xiàn)了洛伐他汀。工業(yè)上常用曲霉屬真菌液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)洛伐他汀,但絲狀真菌在發(fā)酵過(guò)程中易產(chǎn)生多種次級(jí)代謝產(chǎn)物,如色素前體、硫赭曲菌素(Sulochrin)、曲地酸(Asterric acid)和地曲霉素(Geodin)等,不利于下游的提取純化[1]。側(cè)耳屬食用菌不產(chǎn)生真菌毒素,但遺傳背景復(fù)雜,工程菌構(gòu)建困難,因此在洛伐他汀工業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用較少。前期,湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌課題組測(cè)定了12株側(cè)耳屬食用菌常見(jiàn)栽培種菌絲中洛伐他汀的含量,其中糙皮側(cè)耳(Pleurotus ostreatus)P380、PH2和P49菌株菌絲中洛伐他汀含量分別為42.10、38.09和35.83 μg·g-1,遠(yuǎn)高于其他菌株中洛伐他汀的含量[16]。本試驗(yàn)選擇高產(chǎn)洛伐他汀的糙皮側(cè)耳菌株并優(yōu)化其發(fā)酵培養(yǎng)基以提高糙皮側(cè)耳發(fā)酵產(chǎn)物的洛伐他汀產(chǎn)量,旨在為糙皮側(cè)耳液體發(fā)酵菌質(zhì)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株與培養(yǎng)基

糙皮側(cè)耳(P.ostreatus)P380菌株、PH2菌株、P49菌株均保藏于湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所。

馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar,PDA):馬鈴薯 200 g·L-1, 葡萄糖 20 g·L-1,瓊脂 20 g·L-1,蒸餾水1 000 mL。液體完全培養(yǎng)基(liquid complete culture medium,LCYM):葡萄糖 20.0 g·L-1,蛋白胨 2.0 g·L-1,酵母膏 2.0 g·L-1,KH2PO40.5 g·L-1,K2HPO41.0 g·L-1,MgSO40.5 g·L-1,蒸餾水1 000 mL。 基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基(basic fermentation medium,M0):葡萄糖20.0 g·L-1,蛋白胨 2.0 g·L-1,KH2PO42.0 g·L-1,MgSO41.0 g·L-1,蒸餾水 1 000 mL。

1.2 主要試劑與儀器

洛伐他汀(純度≥98%)標(biāo)準(zhǔn)品,上海源葉生物科技有限公司；乙腈(色譜級(jí)),美國(guó)Sigma公司；純凈水,杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司；黃豆,滕州市興龍食品有限公司；糙米,湖北思源農(nóng)貿(mào)有限責(zé)任公司；麩皮、蔗糖,市售；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。試驗(yàn)前將黃豆、糙米和麩皮粉碎并過(guò)80目篩,過(guò)篩部分4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

LC-20AT高效液相色譜儀(配SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器、SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器)、UV-1800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),日本島津公司；Sunfire C18色譜柱(5 μm,4.6 mm×250 mm),美國(guó) Waters公司；HH-2數(shù)字顯示恒溫水浴鍋,常州市國(guó)華儀器有限公司；KQ5200E超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司；RE5205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器廠。

1.3 糙皮側(cè)耳液體培養(yǎng)

將3株糙皮側(cè)耳菌株試管種接種到PDA平板,25℃培養(yǎng)4 d活化,取2 cm×2 cm的菌塊接種到裝有100 mL LCYM培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,25℃、120 r·min-1避光培養(yǎng)5 d后勻漿制備種子液。取6 mL種子液接種于裝有600 mL MO培養(yǎng)基的1 L三角瓶中,25℃、120 r·min-1避光發(fā)酵10 d,在第 5～第 10 天,每天取發(fā)酵液2 mL,3 000 r·min-1離心10 min后取上清液,測(cè)定洛伐他汀產(chǎn)量,每次試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.4 洛伐他汀產(chǎn)量測(cè)定

洛伐他汀產(chǎn)量的測(cè)定參考Lin等[17]和Chen等[18]的方法并作修改。采用Inert-Sustain C18色譜柱(250 mm × 4.6 mm,5 μm)；流動(dòng)相為乙腈 ∶水(70 ∶30,v/v)；流速 0.8 mL·min-1；柱溫 30℃；進(jìn)樣量 10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)238 nm；檢測(cè)時(shí)間20 min。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:精密稱量20 mg洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品,用色譜級(jí)甲醇定容至100 mL,即得洛伐他汀貯存液。吸取上述貯存液配置成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液(1、5、10、20、50、100 μg·mL-1),過(guò) 0.45 μm 微孔濾膜后取10 μL進(jìn)樣測(cè)定。 以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度x(μg·mL-1)為橫坐標(biāo),峰面積y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線。

樣品測(cè)定:無(wú)菌條件下,用移液槍取100 mL發(fā)酵液,1 435×g離心5 min,收集上清液,按照體積比1∶1加入乙酸乙酯后磁力攪拌萃取2 h,取有機(jī)相過(guò)0.22 μm微孔慮膜后進(jìn)樣測(cè)定。

1.5 生物量測(cè)定

在發(fā)酵的第5～第10天,每天取100 mL發(fā)酵液,雙層濾紙抽濾后,菌絲球用蒸餾水沖洗3次,于80℃烘箱中烘干至恒重,記錄菌絲干重。

1.6 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

將10 mL種子液加入到裝有600 mL MO培養(yǎng)基的錐形瓶中(1 L),進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)優(yōu)化試驗(yàn)。發(fā)酵8 d后測(cè)定生物量和發(fā)酵上清液中洛伐他汀產(chǎn)量,所有試驗(yàn)均設(shè)3次平行測(cè)定,結(jié)果取平均值。

1.6.1 單因素試驗(yàn) 碳源試驗(yàn):分別用20.0 g·L-1的蔗糖、乳糖、麥芽糖、甘油、醋酸鈉代替MO培養(yǎng)基中的葡萄糖,篩選最佳碳源；碳源濃度設(shè)12.0、16.0、20.0、24.0、28.0 g·L-1,篩選最佳濃度。

氮源試驗(yàn):分別取2.0 g黃豆粉、大米粉、玉米粉和麩皮,加500 mL蒸餾水,煮沸10 min后過(guò)濾；取濾液,添加MO培養(yǎng)基中除蛋白胨外其他成分。氯化銨試驗(yàn)組,配置高濃度MO培養(yǎng)基(不加蛋白胨),添加40.0 g·L-1氯化銨無(wú)菌液至終濃度為 2.0 g·L-1。氮源濃度設(shè) 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g·L-1,優(yōu)化最佳濃度。

無(wú)機(jī)鹽的影響:分別用2.0 g·L-1的氯化亞鐵、硫酸鹽、硫酸鋅、硫酸銅、硫酸鎂代替MO培養(yǎng)基中硫酸鎂,篩選最佳無(wú)機(jī)鹽；無(wú)機(jī)鹽濃度設(shè) 1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 g·L-1,并篩選最佳濃度。

發(fā)酵液初始pH的影響:調(diào)節(jié)MO培養(yǎng)基pH值分別為 5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0,確定培養(yǎng)基的最佳初始pH。

玉米粉/氯化銨比例的影響:在MO培養(yǎng)基基礎(chǔ)上用玉米粉和氯化銨代替蛋白胨,并調(diào)整玉米粉/氯化銨比例為 0.25∶1、0.5 ∶1、1∶1、1.5 ∶1和 2 ∶1。

硫酸鎂/磷酸二氫鉀比例的影響:在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基基礎(chǔ)上調(diào)整硫酸鎂和磷酸二氫鉀比例為1∶1、1.5∶1、2 ∶1、2.5 ∶1和 3 ∶1。

1.6.2 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,采用正交試驗(yàn)對(duì)碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽和發(fā)酵液初始pH 4個(gè)因素開(kāi)展L9(34)正交試驗(yàn)(表1),確定產(chǎn)洛伐他汀最優(yōu)培養(yǎng)基組成。

表1 L9(34)正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 L9(34)factors and levels of orthogonal experiments

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,采用Origin 8.0軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌株發(fā)酵液中洛伐他汀產(chǎn)量曲線

由圖1可知,從發(fā)酵第5天開(kāi)始,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),PH2、P380、P49菌株發(fā)酵液中洛伐他汀產(chǎn)量逐漸增加,至發(fā)酵第8天,P380菌株和P49菌株發(fā)酵液中洛伐他汀產(chǎn)量均達(dá)到最大值,分別為9.63、4.81 μg·mL-1；PH2菌株在發(fā)酵第9天時(shí)洛伐他汀產(chǎn)量達(dá)到最大值(7.86 μg·mL-1),隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)洛伐他汀產(chǎn)量逐漸降低。這可能是由于洛伐他汀等次級(jí)代謝產(chǎn)物的積累以及生長(zhǎng)環(huán)境的進(jìn)一步惡化,在某種程度上抑制了菌絲生長(zhǎng)[19]。綜合3株糙皮側(cè)耳菌株發(fā)酵液中洛伐他汀產(chǎn)量以及發(fā)酵周期長(zhǎng)短,選取P380菌株作為后續(xù)試驗(yàn)的研究對(duì)象。

2.2 不同碳源對(duì)洛伐他汀產(chǎn)量的影響

研究表明碳源對(duì)真菌中洛伐他汀的產(chǎn)生具有重要的影響[20]。由圖2-A可知,蔗糖為碳源時(shí),菌絲生長(zhǎng)旺盛,生物量最高；乳糖為碳源時(shí),生物量比蔗糖組稍低,但洛伐他汀產(chǎn)量比蔗糖組高,產(chǎn)量達(dá)到 10.24 μg·mL-1。試驗(yàn)選取乳糖作為最佳碳源。由圖2-B可知,當(dāng)乳糖濃度為24.0 g·L-1時(shí),發(fā)酵液中洛伐他汀產(chǎn)量達(dá)到最高,為 11.56 μg·mL-1。

2.3 不同氮源對(duì)洛伐他汀產(chǎn)量的影響

圖1 不同菌株發(fā)酵液中洛伐他汀產(chǎn)量Fig.1 The yield of lovastatin produced by different P.ostreatus strains

除了碳源,氮源對(duì)菌絲合成洛伐他汀也有重要影響。Porcel等[21]發(fā)現(xiàn)氮源對(duì)土曲霉(A.terreus)產(chǎn)洛伐他汀的影響遠(yuǎn)大于碳源。由圖3-A可知,發(fā)酵8 d后,添加有機(jī)氮源的發(fā)酵液中生物量都明顯高于添加氯化銨組,但黃豆粉、大米粉和麩皮組中洛伐他汀產(chǎn)量均低于添加氯化銨組(6.68 μg·mL-1),添加玉米粉組洛伐他汀產(chǎn)量最高,為9.98 μg·mL-1。選定玉米粉作為最佳有機(jī)氮源。由圖3-B可知,當(dāng)玉米粉添加量為2.5 g·L-1時(shí),發(fā)酵液中洛伐他汀產(chǎn)量最高(11.25 μg·mL-1)。

2.4 不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)洛伐他汀產(chǎn)量的影響

影響菌絲中洛伐他汀合成的另外一個(gè)重要因素是無(wú)機(jī)鹽離子[1]。由圖4-A可知,氯化亞鐵組發(fā)酵液中幾乎無(wú)菌絲生長(zhǎng)；硫酸鋅組發(fā)酵液中有少量菌絲生長(zhǎng),生物量較低,發(fā)酵液中未檢測(cè)到洛伐他汀。硫酸錳和硫酸銅組發(fā)酵液中有一定菌絲生長(zhǎng),但洛伐他汀產(chǎn)量和生物量均低于硫酸鎂組。硫酸鎂組洛伐他汀產(chǎn)量和生物量最高,分別為 10.28 μg·mL-1和 13.54 g·L-1,選取硫酸鎂作為外加無(wú)機(jī)鹽離子。由圖4-B可知,當(dāng)硫酸鎂添加量為2.5 g·L-1時(shí),發(fā)酵液中洛伐他汀產(chǎn)量最高,達(dá) 12.86 μg·mL-1。

圖2 不同碳源(A)和不同乳糖濃度(B)對(duì)洛伐他汀產(chǎn)量和生物量的影響Fig.2 Effect of carbon source(A)and lactose concentration(B)on the yield of lovastatin and content of biomass

2.5 發(fā)酵液不同初始pH對(duì)洛伐他汀產(chǎn)量的影響

由圖5可知,在pH值6.0～7.0之間,發(fā)酵液中洛伐他汀產(chǎn)量和生物量相差不大。當(dāng)pH值為6.5時(shí),洛伐他汀產(chǎn)量和生物量最大,分別為8.86 μg·mL-1和10.88 g·L-1。

2.6 不同玉米粉/氯化銨比例對(duì)洛伐他汀產(chǎn)量的影響

研究表明,適當(dāng)?shù)牡础梆囸I”有助于洛伐他汀的形成和積累[1]。無(wú)機(jī)氮源,如氯化銨等小分子,可被糙皮側(cè)耳菌絲快速利用。當(dāng)以氯化銨為氮源時(shí),發(fā)酵液中檢測(cè)到的洛伐他汀產(chǎn)量高于黃豆粉、大米粉和麩皮組。由圖6可知,當(dāng)玉米粉/氯化銨添加比例為1∶1時(shí),洛伐他汀產(chǎn)量最大(12.54 μg·mL-1)。

2.7 不同硫酸鎂/磷酸二氫鉀比例對(duì)洛伐他汀產(chǎn)量的影響

前期試驗(yàn)表明,磷酸鹽對(duì)糙皮側(cè)耳菌絲的生長(zhǎng)以及次級(jí)代謝產(chǎn)物的生成至關(guān)重要(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。由圖7可知,隨著硫酸鎂/磷酸二氫鉀添加比例的升高,發(fā)酵液中洛伐他汀含量也逐漸增加,當(dāng)添加比例為2∶1時(shí),發(fā)酵液中洛伐他汀產(chǎn)量最高,為12.63 μg·mL-1,隨后洛伐他汀產(chǎn)量降低。

圖3 不同氮源(A)和不同玉米粉添加量(B)對(duì)洛伐他汀產(chǎn)量和生物量的影響Fig.3 Effect of nitrogen source(A)and cornmeal adding content(B)on the yield of lovastatin and content of biomass

2.8 正交試驗(yàn)分析

由表2可知,各因素對(duì)洛伐他汀產(chǎn)量的影響程度依次為A＞B＞C＞D,即乳糖濃度＞玉米粉/氯化銨添加比例＞硫酸鎂/磷酸二氫鉀添加比例＞初始pH值。綜合各因素,糙皮側(cè)耳發(fā)酵產(chǎn)洛伐他汀最佳培養(yǎng)基(pleurotus ostreatus liquid medium,POL)為:乳糖24.0 g·L-1,玉米粉 2.5 g·L-1,氯化銨 2.5 g·L-1,磷酸二氫鉀 5.0 g·L-1,硫酸鎂 2.5 g·L-1,初始 pH 值 6.0。

2.9 最優(yōu)發(fā)酵條件的驗(yàn)證

為驗(yàn)證優(yōu)化培養(yǎng)基效果,分別用MO和POL培養(yǎng)基接種相同濃度的種子液,在同一條件下連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)8 d,結(jié)果如圖8所示,與MO培養(yǎng)基相比,POL培養(yǎng)基的伐他汀產(chǎn)量提高了3.15倍,生物量提高了1.78倍。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和極差分析Table 2 The analysis of range and design of orthogonal test

圖4 不同無(wú)機(jī)鹽(A)和不同硫酸鎂添加量(B)對(duì)洛伐他汀產(chǎn)量和生物量的影響Fig.4 Effect of different inorganic salt(A)and MgSO4adding content(B)on the yield of lovastatin and content of biomass

圖5 不同pH值對(duì)洛伐他汀產(chǎn)量和生物量的影響Fig.5 Effect of different pH value on on the yield of lovastatin and content of biomass

3 討論

圖6 不同玉米粉/氯化銨添加比例對(duì)洛伐他汀產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of different adding ratio of cornmeal/NH4Cl on the yield of lovastatin

圖7 不同硫酸鎂/磷酸二氫鉀添加比例對(duì)洛伐他汀含量的影響Fig.7 Effect of different adding ratio of MgSO4/KH2PO4on the yield of lovastatin

圖8 優(yōu)化前后洛伐他汀產(chǎn)量和生物量的變化Fig.8 Changes of lovastatin and biomass yield before and after medium optimization

洛伐他汀(C24H36O5),又稱莫納可林K,是一種有效的膽固醇合成抑制劑[5]。早在上世紀(jì)80年代,洛伐他汀被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration,FDA)批準(zhǔn)成為第一個(gè)上市的他汀類降血脂藥物[22]。目前,洛伐他汀主要通過(guò)工業(yè)大規(guī)模發(fā)酵獲得,發(fā)酵培養(yǎng)基組成如碳源、氮源種類及其濃度、氧飽和度、發(fā)酵pH值等對(duì)洛伐他汀的產(chǎn)量及產(chǎn)生速率均影響較大[1]。研究表明,在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加緩慢代謝的碳源,如乳糖和甘油等,有利于洛伐他汀的合成和積累[23]。Casas Lopéz等[24]利用土曲霉發(fā)酵生產(chǎn)洛伐他汀時(shí),乳糖加入量高達(dá)100 g·L-1,洛伐他汀產(chǎn)量可達(dá)230 mg·L-1。Li等[20]同樣利用土曲霉發(fā)酵生產(chǎn)洛伐他汀,在培養(yǎng)基中額外加入3%甘油使得洛伐他汀產(chǎn)量高達(dá)916 mg·L-1。本研究發(fā)現(xiàn),在MO培養(yǎng)基中用乳糖替代葡萄糖后,洛伐他汀產(chǎn)量從9.63 μg·mL-1增加到 10.24 μg·mL-1,但用甘油替代葡萄糖后,洛伐他汀含量反而下降(4.86 μg·mL-1),這可能與菌株的種類不同有關(guān)。前人研究結(jié)果表明,氮源對(duì)洛伐他汀產(chǎn)量的影響甚至超過(guò)碳源,氮源含量高導(dǎo)致生物量的增長(zhǎng)以及其他次級(jí)代謝產(chǎn)物的生成,因此生產(chǎn)中常用適當(dāng)限制氮源量的方法來(lái)獲得高產(chǎn)洛伐他汀[21,25]。Kamath等[26]認(rèn)為有機(jī)氮源對(duì)洛伐他汀產(chǎn)生無(wú)影響,只是對(duì)生物量有較大影響；Alarcón等[27]發(fā)現(xiàn)不同碳氮比對(duì)糙皮側(cè)耳發(fā)酵產(chǎn)洛伐他汀影響較大,但有機(jī)氮源對(duì)洛伐他汀的合成影響不大。本研究發(fā)現(xiàn),有機(jī)氮源對(duì)糙皮側(cè)耳產(chǎn)洛伐他汀有一定影響,其中玉米粉可有效增加發(fā)酵液中洛伐他汀的積累。此外,無(wú)機(jī)氮源氯化銨對(duì)糙皮側(cè)耳產(chǎn)洛伐他汀也有一定影響,推測(cè)可能是氯化銨屬小分子物質(zhì)易于吸收,在生長(zhǎng)前期被用于菌絲生長(zhǎng),在后期氮源成了限制因素,這種營(yíng)養(yǎng)限制有利于洛伐他汀的生成,Mulder等[1]的研究也證實(shí)了這一點(diǎn)。金屬離子對(duì)洛伐他汀的影響也較大,Jia等[28]發(fā)現(xiàn)低濃度Cu2+會(huì)抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)以及洛伐他汀的合成,而一定濃度 Fe2+、Ca2+、Zn2+、Mg2+和 Mn2+能促進(jìn)洛伐他汀的合成,但是將這些離子混合加入則會(huì)抑制洛伐他汀的合成。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),在MO培養(yǎng)基中將硫酸鮮替換成一定濃度氯化亞鐵或者硫酸鋅后,會(huì)明顯抑制糙皮側(cè)耳菌絲的生長(zhǎng),而添加一定量硫酸鎂則有利于菌絲生長(zhǎng)以及洛伐他汀的積累。目前關(guān)于發(fā)酵培養(yǎng)基pH對(duì)洛伐他汀合成的影響存在一定爭(zhēng)議,部分學(xué)者認(rèn)為絲狀真菌發(fā)酵產(chǎn)洛伐他汀最適pH值為6.5,還有學(xué)者認(rèn)為發(fā)酵培養(yǎng)基pH對(duì)洛伐他汀產(chǎn)量影響不大[1,25]。本研究結(jié)果表明,發(fā)酵培養(yǎng)基pH對(duì)糙皮側(cè)耳產(chǎn)洛伐他汀有一定影響,但沒(méi)有其他因素那么明顯。此外,本研究還發(fā)現(xiàn),玉米粉/氯化銨添加比例、硫酸鎂/磷酸二氫鉀添加比例對(duì)糙皮側(cè)耳產(chǎn)洛伐他汀也存在一定影響,當(dāng)玉米粉/氯化銨添加比例、硫酸鎂/磷酸二氫鉀添加比例分別為1∶1和2∶1時(shí),洛伐他汀產(chǎn)量最大,這可能與糙皮側(cè)耳對(duì)這些氮源和無(wú)機(jī)鹽先后利用順序有關(guān)。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)確定了糙皮側(cè)耳發(fā)酵產(chǎn)洛伐他汀的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基,與基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基相比,優(yōu)化后洛伐他汀產(chǎn)量提高了3.15倍,生物量提高了1.78倍,表明培養(yǎng)基組成對(duì)糙皮側(cè)耳發(fā)酵產(chǎn)洛伐他汀影響較大。根據(jù)本研究結(jié)果,下一步將在代料生產(chǎn)中添加部分碳、氮源及無(wú)機(jī)鹽,進(jìn)一步研究如何提高糙皮側(cè)耳子實(shí)體中洛伐他汀含量。