周成城，楊德明，李士坤，萬(wàn)佳藝，榮俊冬，鄭郁善,

(1.福建農(nóng)林大學(xué)園林學(xué)院, 福建 福州 350002； 2.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院, 福建 福州 350002；3.漳平市林業(yè)局， 福建 漳平 364400)

櫻花(Cerasusspp.)屬于薔薇科(Roasaceae)李亞科(Prunoideae)櫻屬(Cerasus)落葉喬木或小喬木，花盛開(kāi)于冬末和初春，是世界上著名早春觀花樹(shù)種之一[1]。目前櫻花有200多種，主要來(lái)自日本和中國(guó)[2]，其花色豐富，樹(shù)形優(yōu)美，是優(yōu)良的園林觀賞樹(shù)種。隨著櫻花種植的發(fā)展，我國(guó)本土的櫻花資源不斷得到重視，其中福建山櫻花[Cerasuscampanulata(Maxim.) Yu et Li]是國(guó)產(chǎn)櫻花的代表之一[3]，分布于我國(guó)的福建、江西、廣西、廣東、臺(tái)灣等省，國(guó)內(nèi)有眾多種源地[4]。福建山櫻花近年來(lái)在很多園林景觀建設(shè)中得以應(yīng)用[5-8]，可為我國(guó)櫻花園林應(yīng)用提供更多優(yōu)質(zhì)的資源。但現(xiàn)階段櫻花研究開(kāi)展了較多雜交育種工作，市場(chǎng)上已有新種質(zhì)或新品種出現(xiàn)，從形態(tài)學(xué)的角度難以進(jìn)行準(zhǔn)確分辨，為更好地保存、開(kāi)發(fā)和利用國(guó)內(nèi)櫻花種質(zhì)資源，從分子層面進(jìn)行遺傳多樣性分析和種質(zhì)資源鑒別很有必要。

簡(jiǎn)單重復(fù)序列間擴(kuò)增(inter-simple sequence repeat， ISSR)分子標(biāo)記技術(shù)由ZIETKIEWICZetal[9]在1994年基于簡(jiǎn)單重復(fù)序列擴(kuò)增(simple sequence repeat， SSR)分子標(biāo)記技術(shù)所建立的，其基本原理是在SSR的3或5端嵌入1組1～4個(gè)嘌呤或嘧啶堿基，并以此為引物對(duì)DNA序列具有反向排列SSR的兩側(cè)進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)電泳、染色和分析顯像觀察譜帶的有無(wú)以及相對(duì)位置來(lái)判斷植物物種和品種間的遺傳多態(tài)性[10-12]。該分子標(biāo)記技術(shù)結(jié)合了SSR和隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記(random amplified polymorphic DNA，RAPD)兩個(gè)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，具有操作便捷、穩(wěn)定性好、多態(tài)性豐富等特點(diǎn)，在種質(zhì)資源分類和鑒別方面有較高的效率[13]。

在櫻花的培育中，人工培育后的品種鑒別困難，表型差異不明顯，需從基因?qū)用鎸?duì)其鑒別。近年來(lái)，ISSR分子標(biāo)記法逐漸被使用在品種鑒定的研究中[14-15]，如蔣冬月等[16]針對(duì)不同省份的櫻亞屬園藝品種進(jìn)行了ISSR品種鑒定；林立等[17]對(duì)39個(gè)國(guó)內(nèi)常見(jiàn)櫻花品種進(jìn)行了分類研究，均取得了較好的效果。本研究收集了福建省漳平市內(nèi)18個(gè)觀賞櫻花樹(shù)種材料，利用ISSR分子標(biāo)記法分析試驗(yàn)材料的遺傳多樣性及親緣關(guān)系，構(gòu)建櫻花指紋圖譜，以期為種質(zhì)資源的品種鑒定、分類、利用和雜交育種親本的選配等方面提供理論依據(jù)，加快國(guó)內(nèi)櫻花的良種選育和商品化。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

18份櫻屬材料包括福建山櫻花、11份日本櫻花(Cerasusyedoensis)和6份選優(yōu)材料(表1)。其中選優(yōu)材料為福建省漳平市各苗木基地人工培育，親本為福建山櫻花和日本櫻花雜交，2019年6—7月采集于福建省漳平市內(nèi)櫻花觀賞品種栽培試驗(yàn)區(qū)。采集生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲(chóng)害的植物幼嫩葉片，用自封袋裝置于冰盒中，放置在實(shí)驗(yàn)室-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 18份櫻屬材料信息Table 1 Information of 18 Cerasus materials

1.2 試驗(yàn)方法

[HT5F]1.2.1 DNA提取與檢測(cè) 采用Bioflux DNA提取試劑盒(杭州博日公司提供)提取18份櫻屬材料的總DNA，用NANODROP 2000 C紫外分光光度計(jì)分析質(zhì)量和濃度，經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳后用透射紫外燈照相觀察并分析總DNA純度，于-20 ℃保存。

[HT5F]1.2.2 ISSR引物篩選與PCR擴(kuò)增 根據(jù)加拿大哥倫比亞大學(xué)設(shè)計(jì)并公布的ISSR引物序列[18]，試驗(yàn)所用引物由上海尚亞生物有限公司合成。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction， PCR)體系包括100 ng模板DNA、2 μL(10 μmol·L-1)引物、15 μL PCR反應(yīng)混合物(Taq酶、dNTPs、MgCl2以及反應(yīng)緩沖液預(yù)先配制成2倍濃度的混合物)，加入去離子水達(dá)到25 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性1 min，50～55 ℃退火30 s(每次下降1 ℃)，72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。采用1.5%瓊脂糖凝膠加入10 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，篩選出能擴(kuò)增出清晰條帶的引物。基于肖琳等[19]和馮晨靜等[20]對(duì)薔薇科植物ISSR-PCR擴(kuò)增體系的優(yōu)化條件，對(duì)各供試材料總DNA進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物和100 bp DNA ladder、1 kb DNA ladder通過(guò)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，Gold view核酸染色劑進(jìn)行染色，電泳儀上恒壓150 V電泳1.5 h，在透射紫外燈下觀察照相。

[HT5F]1.2.3 數(shù)據(jù)處理 統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)擴(kuò)增引物在瓊脂糖凝膠上條帶顯示的位置，有條帶顯示記為1，沒(méi)有條帶顯示記為0。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)輸入Excel表格，建立ISSR擴(kuò)增譜帶矩陣數(shù)據(jù)庫(kù)，利用POPGENE 32軟件分析遺傳多樣性，對(duì)每一條引物擴(kuò)增結(jié)果建立二元數(shù)據(jù)矩陣，統(tǒng)計(jì)總位點(diǎn)數(shù)和多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)并構(gòu)建指紋圖譜。對(duì)此0、1 矩陣進(jìn)行分析，分析指標(biāo)有多態(tài)位點(diǎn)百分率(percentage of polymorphic bands， PPB)、觀測(cè)等位基因數(shù)(observed number of alleles，Na)、有效等位基因數(shù)(effective number of alleles，Ne)、Nei′s遺傳多樣性指數(shù)、Shannon多樣性指數(shù)、基因多樣性指數(shù)、遺傳分化系數(shù)、遺傳距離與遺傳相似度。利用NTSYSpc 2.10e軟件進(jìn)行Jaccard相似性系數(shù)計(jì)算，并作出聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取效果

利用DNA提取試劑盒提取18份櫻屬材料的DNA,結(jié)果均是一條清晰的條帶(圖1)，無(wú)RNA污染、拖尾和彌散現(xiàn)象，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)得DNA的質(zhì)量濃度為100～300 ng·μL-1。提取的DNA可以滿足ISSR-PCR反應(yīng)對(duì)模板DNA的質(zhì)量要求。

注：M為1 kb DNA ladder；1～18為櫻花材料編號(hào)。Note: M.1 kb DNA ladder;1-18.material numbers.

2.2 ISSR引物篩選與擴(kuò)增結(jié)果

從表2可知，對(duì)100條ISSR引物進(jìn)行篩選，最終選出12條條帶清晰、明亮度好、多態(tài)性豐富的引物，在所有引物的占比為12%。18份櫻屬材料共擴(kuò)增出144個(gè)重復(fù)性好、清晰穩(wěn)定的位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)135個(gè)，占總位點(diǎn)數(shù)的93.75%；各引物擴(kuò)增出的位點(diǎn)數(shù)在10～15個(gè)之間，平均12個(gè)位點(diǎn)；多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)在9～13個(gè)之間，平均11.25個(gè)；各引物擴(kuò)增結(jié)果的PPB在84.62%～100%之間，平均為93.75%。綜上可得，12條ISSR引物均能擴(kuò)增出高多態(tài)性的位點(diǎn)，由此顯示18份櫻屬材料具有豐富的多態(tài)性。從圖2可知，各引物檢測(cè)出的DNA片段大小范圍在300～1 500 bp之間，說(shuō)明櫻花有適中長(zhǎng)度的基因組。

表2 優(yōu)選出的12條ISSR的引物擴(kuò)增Table 2 Amplification of the 12 ISSR optimal primers

注：M為100 bp DNA ladder；1～18為櫻花材料編號(hào)。Note: M.1k bp DNA ladder, 1-18.material numbers.

2.3 遺傳多樣性分析

PPB是衡量植物種群間遺傳變異水平的重要指標(biāo)，如果一個(gè)植物種群的PPB值高則說(shuō)明該種群能夠更好地適應(yīng)當(dāng)?shù)丨h(huán)境，能繁衍下去；若PPB值低則說(shuō)明其環(huán)境適應(yīng)能力較弱，有滅絕的可能性，需要及時(shí)對(duì)其采取適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)措施[21]。18份櫻屬材料的PPB差異性較小，PPB值在84.62%～100%之間，平均為93.75%，說(shuō)明這18份櫻屬材料的適應(yīng)性強(qiáng)，遺傳多樣性豐富，遺傳基礎(chǔ)較寬，在福建省漳平市有較好的適應(yīng)力。利用POPGENE 32軟件分別對(duì)18份櫻屬材料的遺傳多樣性進(jìn)行總體和單獨(dú)分析。結(jié)果顯示：18份櫻花供試材料Na值為1.979 2，Ne值為1.603 3，Nei′s遺傳多樣性指數(shù)為0.347 8，Shannon多樣性指數(shù)為0.518 2，顯示了供試材料間豐富的遺傳多樣性。

2.4 親緣關(guān)系分析

由表3可知，18份櫻屬材料間的遺傳相似性系數(shù)在0.453 2～0.833 3之間，平均為0.633 7，遺傳距離在0.182 3～0.765 1之間，平均為0.462 7。其中‘一葉櫻’和‘松月’兩個(gè)品種的遺傳相似性系數(shù)最大，值為0.833 3，說(shuō)明兩者的親緣關(guān)系較近，福建山櫻花和‘八重彼岸’的遺傳相似性系數(shù)最小，值為0.453 2，說(shuō)明兩者存在較大的遺傳差異。

表3 18份櫻屬材料間的遺傳相似性系數(shù)和遺傳距離Table 3 Similarity coefficient matrix and genetic distance of 18 Cerasus materials

2.5 聚類分析

基于ISSR擴(kuò)增結(jié)果，按照非加權(quán)組平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means， UPGMA)聚類進(jìn)行遺傳關(guān)系分析，得到18份櫻屬材料的親緣關(guān)系樹(shù)狀圖(圖3)。從圖3可知，設(shè)定遺傳相似性系數(shù)為0.589 9時(shí)，群體可分為4個(gè)類群(Ⅰ、 Ⅱ、 Ⅲ、 Ⅳ)，其中類群Ⅰ有9份櫻屬材料，類群Ⅱ有8份櫻屬材料，‘飛寒櫻’和‘八重紅彼岸’分別歸為一個(gè)類群，說(shuō)明這兩個(gè)材料與其他材料的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。當(dāng)遺傳相似性系數(shù)為0.701 1時(shí)，群體則分為12個(gè)類群，差異數(shù)為8個(gè)，在遺傳相似性系數(shù)變化程度較小時(shí)，聚類差異明顯，說(shuō)明18份櫻屬材料的遺傳多樣性豐富。

注：1～18為櫻花材料編號(hào)。Note: 1-18.material numbers.圖3 18份櫻屬材料的聚類圖Figure 3 UPGMA dendrogram for 18 Cerasus materials

2.6 主坐標(biāo)分析

基于18份櫻屬材料的遺傳相似性系數(shù)，利用NTSYSpc軟件進(jìn)行主坐標(biāo)分析，第一、第二、第三主坐標(biāo)的貢獻(xiàn)率分別為16.17%、11.27%和10.14%。對(duì)18份櫻屬材料做主坐標(biāo)分析并構(gòu)建二維散點(diǎn)圖(圖4) ，散點(diǎn)分布規(guī)律與聚類分析得出的結(jié)果基本一致，只有11號(hào)‘染井吉野’品種在散點(diǎn)分布上與聚類分析中的規(guī)律有一些差異。在UPGMA聚類中，‘染井吉野’品種聚于類群Ⅱ中，而主坐標(biāo)分析結(jié)果卻顯示該品種與亞類群Ⅲ中‘飛寒櫻’親緣關(guān)系更近，這種差異的出現(xiàn)可能由于在主坐標(biāo)分析中還有第四、第五等其他貢獻(xiàn)值的影響。

注：1～18為櫻花材料編號(hào)。Note: 1-18.material numbers.圖4 18份櫻屬材料的主坐標(biāo)分析圖Figure 4 Principal coordinate analysis for 18 Cerasus materials

2.7 DNA指紋圖譜的構(gòu)建

通過(guò)對(duì)篩選出的12個(gè)ISSR引物，發(fā)現(xiàn)引物UBC808和UBC835兩者對(duì)18份櫻屬材料能夠完全鑒別出來(lái)，有較好的鑒別效果。將擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行數(shù)字轉(zhuǎn)化(有條帶記為1， 無(wú)條帶記為0)，形成了特有的分子身份證編碼，構(gòu)建出18份櫻屬材料的DNA指紋圖譜(表4)，可用于種質(zhì)資源的分類與鑒定。

表4 引物UBC808和UBC835構(gòu)建18份櫻屬材料的DNA指紋圖譜Table 4 DNA fingerprint of 18 Cerasus materials based on primer UBC808 and UBC 835

3 討論與結(jié)論

在遺傳多樣性研究、品種鑒定、輔助育種等方面，分子標(biāo)記技術(shù)具有重要意義[22]。18份櫻屬材料ISSR標(biāo)記結(jié)果顯示，12條ISSR引物共擴(kuò)增出144個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)135個(gè)，多態(tài)性位點(diǎn)占93.75%，平均Nei′s遺傳多樣性指數(shù)為0.348 7，表明所選的櫻花材料間存在豐富的遺傳變異，并且ISSR分子標(biāo)記在櫻花材料間的擴(kuò)增位點(diǎn)多態(tài)性主要由種間的差異引起，可有效地反映種間的親緣關(guān)系,這與其他櫻屬的分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用研究相符合。如蔣冬月等[16]和林立等[17]的研究中，PPB值分別為93.58%和94.03%，說(shuō)明具有豐富的多態(tài)性和較高的區(qū)分度。而在其他分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用研究里，陳芳等[23]、?Zetal[24]和蘇倩[25]運(yùn)用RFLP、SSR和RAPD等分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)櫻屬的植物進(jìn)行了遺傳多樣性分析，均表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性。因此，以ISSR為主的分子標(biāo)記法可以作為櫻花種質(zhì)資源親緣關(guān)系和遺傳多樣性分析的有效手段。

在18份櫻屬材料的聚類分析和主坐標(biāo)分析中，各材料間的遺傳相似性系數(shù)差異較大，選優(yōu)材料與母本的遺傳相似性系數(shù)并未十分相近，說(shuō)明通過(guò)雜交等育種手段培育后，櫻屬材料的遺傳多樣性高，但從總體而言，通過(guò)聚類分析和主坐標(biāo)分析等數(shù)據(jù)分析手段，能夠清楚地區(qū)分各材料的親緣關(guān)系類群，而選優(yōu)材料在櫻花種或品種間的區(qū)分和鑒別上有著相當(dāng)大的困難，同一地區(qū)內(nèi)由于栽培人員的多年人工培育，很多疑似新品種和選優(yōu)材料在外形上十分相似，只有在花瓣或葉片上有細(xì)微差別，已經(jīng)無(wú)法確認(rèn)其親本以及親緣關(guān)系。在本次研究中，采集的福建省漳平市各苗木基地的18份櫻屬材料，其中有6份是選優(yōu)材料，通過(guò)分子標(biāo)記進(jìn)行親緣鑒定，研究中UPGMA聚類分析的結(jié)果從分子生物學(xué)層面對(duì)18份材料進(jìn)行了有效的區(qū)分和鑒別。選優(yōu)1號(hào)、選優(yōu)2號(hào)、選優(yōu)3號(hào)和‘河津’、福建山櫻花遺傳相似性系數(shù)較高，在花型、花色上存在較大相似性，但花期略有不同，且存在連續(xù)性，能夠?yàn)闄鸦ㄓ^賞期的延長(zhǎng)提供可能；選優(yōu)4號(hào)和‘大漁櫻’遺傳相似度較高，但選優(yōu)材料在花色上更加鮮艷亮麗，花期更長(zhǎng)，這對(duì)國(guó)外引進(jìn)品種的本土化品種改良有一定參考價(jià)值；而‘河津’、‘大漁櫻’和福建山櫻花又有著較高遺傳相似性，與國(guó)內(nèi)櫻花種有較近親緣關(guān)系的國(guó)外引進(jìn)品種，選育出優(yōu)良品種的可能性更大；與選優(yōu)5號(hào)、選優(yōu)6號(hào)有較高遺傳相似性系數(shù)的‘染井吉野’和‘陽(yáng)光櫻’在福建省漳平市生長(zhǎng)情況比選優(yōu)品種更差，說(shuō)明國(guó)外引進(jìn)品種與福建山櫻花雜交后的選優(yōu)材料在適應(yīng)性上可能更強(qiáng)。從表型難以準(zhǔn)確鑒別的選優(yōu)材料，通過(guò)遺傳相似性分析和聚類分析可以較好地區(qū)分出櫻花不同種或品種，為以后國(guó)內(nèi)櫻花的良種選育、輔助育種、新品種鑒定、品種命名和難以分辨的品種鑒別提供了有力證據(jù)，還能夠?yàn)閲?guó)內(nèi)櫻花的培育者在今后更加規(guī)范的品種商品化、產(chǎn)業(yè)化道路上提供理論依據(jù)。

櫻花在我國(guó)的種質(zhì)資源分布也十分豐富，據(jù)統(tǒng)計(jì)，櫻屬植物達(dá)到48種[26]，國(guó)內(nèi)主要的觀賞櫻花還是以日本引進(jìn)為主，而國(guó)內(nèi)櫻花種類在我國(guó)各省份已經(jīng)有較多生長(zhǎng)優(yōu)良、觀賞價(jià)值高的品種種源地，如福建、江西、廣東等省。但我國(guó)的櫻花產(chǎn)業(yè)起步晚，品種鑒定、良種選育、品種改良等能力還不夠，嚴(yán)重影響了國(guó)內(nèi)櫻花品種商品化、產(chǎn)業(yè)化的推廣。本研究利用了ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，在分子生物學(xué)水平上揭示了同一種源地不同櫻花材料具有豐富的遺傳多樣性，區(qū)分和鑒別了不同國(guó)內(nèi)櫻花材料的親緣關(guān)系，證明了ISSR分子標(biāo)記法對(duì)于分析國(guó)內(nèi)櫻花的遺傳多樣性一個(gè)效果較好方法。因此，可利用ISSR分子標(biāo)記法對(duì)國(guó)內(nèi)各個(gè)櫻花種源地的品種進(jìn)行全面分析，查清遺傳關(guān)系，建立科學(xué)、規(guī)范的命名標(biāo)準(zhǔn)和品種資源信息庫(kù)，開(kāi)展國(guó)內(nèi)櫻花的資源開(kāi)發(fā)、良種選育、優(yōu)良品種應(yīng)用、品種產(chǎn)業(yè)化等工作。