吳志鵬，童應(yīng)華

(福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福建 福州350002)

紅火蟻(SolenopsisinvictaBuren)隸屬于膜翅目(Hymenoptera)蟻科(Formicidae)切葉蟻亞科(Mymicinae)火蟻屬(Solenopsis)[1]，是世界自然保護(hù)聯(lián)盟公布的世界100種最具危害性的外來入侵種之一[2]，原產(chǎn)于南美洲的巴西、阿根廷、巴拉圭一帶，先后入侵到美國、新西蘭和澳大利亞等地區(qū)[3-4]。在中國，2003年臺灣首次報(bào)道紅火蟻入侵[5]，截止到2019年5月，已在國內(nèi)超過12個(gè)省(區(qū)、市)發(fā)現(xiàn)紅火蟻入侵[6]。該蟻習(xí)性兇猛、繁殖力強(qiáng)，對入侵地區(qū)的農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)、居民人身安全等造成了嚴(yán)重的威脅與危害，對入侵地節(jié)肢動物物種多樣性及生態(tài)系統(tǒng)造成難以修復(fù)的影響[7]。因此，如何預(yù)防紅火蟻入侵和有效控制其種群成為亟需解決的科學(xué)問題。

目前，紅火蟻的防治主要采用毒餌誘殺或灌藥毒殺等化學(xué)方法防治[8]，該方法在一定程度上控制了其種群數(shù)量，但是使用化學(xué)農(nóng)藥易傷害非靶標(biāo)生物，破壞生態(tài)平衡[9]。采用熱水澆灌蟻巢，肥皂水浸泡蟻巢等物理防治方法耗時(shí)耗力，防治效率低[10]。于是低毒高效的生物防治方法引起人們的廣泛關(guān)注，美國利用病原真菌防治紅火蟻已取得了一定成效[11-12]，國內(nèi)學(xué)者開展了白僵菌、綠僵菌和淡紫擬青霉(PaecilomyceslilacinusThom)對紅火蟻致病性的研究，發(fā)現(xiàn)其對紅火蟻均有一定的致病力[13-14]。本研究應(yīng)用11株球孢白僵菌和9株金龜子綠僵菌對紅火蟻工蟻進(jìn)行致病力測定，旨為尋找對紅火蟻具有高致病力的菌株資源，為利用蟲生真菌防治該蟲奠定應(yīng)用基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲

供試紅火蟻采自福建省福州市(N26°05′14.3″，E119°13′42.7″)。將野外采集的紅火蟻蟻巢帶回實(shí)驗(yàn)室，采用水滴法分離蟻群。分離后的蟻群飼養(yǎng)于30 cm×20 cm×20 cm的養(yǎng)蟲盒內(nèi)，養(yǎng)蟲盒內(nèi)壁均勻涂上滑石粉，以防其逃逸，盒內(nèi)放置用石膏搭建的人工蟻巢，用紗布遮蓋養(yǎng)蟲盒。將裝有紅火蟻的養(yǎng)蟲盒置于(25±1) ℃、相對濕度65%～75%、光照12L∶12D下的培養(yǎng)箱內(nèi)以水試管持續(xù)供水，采用蜂蜜水、火腿腸和油炸蠶豆飼養(yǎng)。待紅火蟻種群穩(wěn)定后，挑選大小基本一致的健康工蟻進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 供試菌株

供試的11株球孢白僵菌和9株金龜子綠僵菌菌株信息見表 1。

表1 供試菌株來源Table 1 The origin of tested strains

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 孢子懸液的制備 將白僵菌和綠僵菌接菌于PDA斜面培養(yǎng)基上，于25 ℃恒溫培養(yǎng)充分產(chǎn)孢后，使用前提前測定各菌株孢子萌發(fā)率，選擇48 h內(nèi)孢子萌發(fā)率大于90%的產(chǎn)孢菌株，用含0.01%吐溫-80的無菌水洗脫孢子，置于振蕩器上振蕩20 min(150 r·min-1)。用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將各菌株配制成不同濃度的孢子懸液，備用。

1.3.2 高致病力菌株的篩選 選取大小基本一致的紅火蟻工蟻挑入干凈保鮮盒內(nèi)，隨后向保鮮盒內(nèi)加15 mL 1.0×107個(gè)孢子·mL-1孢子懸液，浸5 s后立即取出，放入墊有濕潤濾紙的干凈保鮮盒內(nèi)，以棉球浸漬10%葡萄糖水喂食，盒上打10個(gè)直徑為0.5 mm的小孔，接菌后置于25 ℃，相對濕度90%人工氣候箱內(nèi)飼養(yǎng)。每一菌株為1個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)50頭工蟻，以浸含0.01%吐溫-80的無菌水為對照。每天觀察、統(tǒng)計(jì)死亡的紅火蟻數(shù)量，并將死蟲及時(shí)挑出，放于墊濕潤無菌濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，25 ℃恒溫培養(yǎng)，觀察死蟲上的子實(shí)體生長情況。連續(xù)觀察統(tǒng)計(jì)10 d。

1.3.3 高致病力菌株的毒力測定 選擇對紅火蟻死亡率和僵蟲率較高，且致死速度較快的菌株，分別以1×104、1×105、1×106、1×107和1×108個(gè)孢子·mL-1的孢子懸液接菌，接菌方法、接菌后處理和觀察統(tǒng)計(jì)方法同1.3.2。每個(gè)濃度1個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)50頭試蟲。

1.4 數(shù)據(jù)處理

以Excel 2010處理原始數(shù)據(jù)，采用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，并以鄧肯氏新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。用DPS7.05對時(shí)間-劑量-死亡率(time-dose-mortality)模型進(jìn)行分析[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅火蟻工蟻感染白僵菌與綠僵菌的病癥

紅火蟻工蟻感染白僵菌與綠僵菌的癥狀如圖1。紅火蟻工蟻感染各菌株初期，活動減弱，身體弓曲，死亡后身體完全蜷縮，經(jīng)恒溫保濕培養(yǎng)2～3 d后，各體節(jié)間有白色菌絲長出，白僵菌菌絲生長快于綠僵菌，4～5 d后白僵菌侵染的死蟲節(jié)間產(chǎn)生大量白色分生孢子，呈團(tuán)狀分布，綠僵菌侵染的蟲體節(jié)間產(chǎn)生大量深綠色孢子，呈簇狀分布。

(a)白僵菌感染 Infected by B. bassiana

2.2 各菌株對紅火蟻工蟻的致病力

2.2.1 白僵菌菌株對紅火蟻工蟻的致病力 以濃度1×107個(gè)孢子·mL-1的孢子懸液接菌紅火蟻工蟻，分析處理10 d后紅火蟻工蟻的累計(jì)死亡率動態(tài)。由圖2可見，在接菌后3～5 d紅火蟻工蟻死亡率快速上升，隨后趨于平穩(wěn)。接菌BSX-JC、BLK、Bn-001、BQL-YJ后紅火蟻工蟻累計(jì)死亡率較低。統(tǒng)計(jì)分析各菌株接菌后10 d 紅火蟻工蟻的死亡情況(表2)。結(jié)果表明各菌株對紅火蟻工蟻均有致病力，其中BSX-PC菌株致病力最強(qiáng)，接菌后紅火蟻工蟻的校正死亡率和僵蟲率分別為(67.14±0.22)%和(52.31±0.31)%，致死中時(shí)(median lethal time， LT50)(5.64±0.52) d。BQL-YJ菌株處理致病力最弱，接菌后紅火蟻工蟻累計(jì)死亡率僅(26.50±0.77)%，與對照組無顯著差異，且僵蟲率僅(1.99±0.13)%，顯著低于其它菌株。由此可見，BSX-PC菌株對紅火蟻工蟻有較強(qiáng)致病力。

表2 白僵菌各菌株處理10 d時(shí)紅火蟻工蟻的致死效果Table 2 Lethal effects of different B. bassiana strains on S. invicta workers at the 10th day after the treatment

2.2.2 綠僵菌對紅火蟻工蟻的致病力 以濃度1×107個(gè)孢子·mL-1的孢子懸液接菌紅火蟻工蟻，分析處理10 d后紅火蟻工蟻的累計(jì)死亡率動態(tài)。由圖3可見，接菌后2 d各組死亡率相近，接菌后3～5 d，各處理的死亡率上升速度較快，隨后趨于平穩(wěn)。統(tǒng)計(jì)分析各菌株處理后10 d紅火蟻工蟻的死亡情況(表3)。結(jié)果表明各菌株對紅火蟻工蟻致病力差異較大，9株菌株中，MaWys-01菌株致病力最強(qiáng)，接菌后紅火蟻工蟻的校正死亡率和僵蟲率顯著高于其它各菌株處理，分別為(81.93±0.94)%和(64.52±0.56)%，且LT50最短，為(4.78±0.46) d。而Maxm-05菌株致病力最弱，接菌后紅火蟻工蟻的校正死亡率和僵蟲率分別為(35.13±1.25)%和(28.10±0.41)%，致死時(shí)間最長。由此可見，MaWys-01菌株對紅火蟻工蟻有較強(qiáng)的致病力。

圖2 白僵菌各菌株處理后紅火蟻工蟻累計(jì)死亡率動態(tài)Figure 2 Dynamic of cumulative mortality of S. invicta workers treated by different B. bassiana strains

圖3 綠僵菌各菌株處理后紅火蟻工蟻累計(jì)死亡率動態(tài)Figure 3 Dynamic of cumulative mortality of S. invicta workers treated by different M. anisopliae strains

表3 綠僵菌各菌株處理10 d時(shí)紅火蟻工蟻的致死效果Table 3 Lethal effects of different M. anisopliae strains on S. invicta workers at the 10th day after the treatment

2.3 白僵菌BSX-PC不同濃度對紅火蟻工蟻的致病力

分析白僵菌BSX-PC不同濃度孢子懸液對紅火蟻工蟻的致病力。由表4可知，各濃度處理紅火蟻工蟻校正死亡率之間存在顯著差異，隨著處理濃度的增加校正死亡率逐漸增大，以1×108個(gè)孢子·mL-1接菌后10 d紅火蟻工蟻校正死亡率最大，為(79.59±0.59)%。通過時(shí)間-劑量-死亡率模型估計(jì)，各參數(shù)估計(jì)值見表5。經(jīng)Hosmer & Lemeshow檢驗(yàn)得到卡方值P=0.533>0.05，模型擬合成功。劑量效應(yīng)參數(shù)β=0.341 5，說明各濃度的孢子懸液對紅火蟻均有一定的致死效果。在接菌后3～5 d，γi較前后都相差較大，可知接菌后3～5 d紅火蟻死亡數(shù)較多。

表4 不同時(shí)段白僵菌BSX-PC菌株對紅火蟻工蟻的LC50Table 4 Median lethal concentration (LC50)on different time of the B. bassiana BSX-PC strain against S. invicta workers

表5 BSX-PC菌株對紅火蟻工蟻的時(shí)間-劑量-死亡率模型Table 5 The time-dose-mortality model of the BSX-PC strain against S. invicta workers

2.4 綠僵菌MaWys-01不同濃度對紅火蟻工蟻的致病力

分析綠僵菌MaWys-01不同濃度孢子懸液對紅火蟻工蟻的致病力。由表6可知，接菌后3、6和10 d，其致死中濃度(median lethal concentration， LC50)分別為7.59×108、2.42×105和5.90×104個(gè)孢子·mL-1。進(jìn)一步分析其時(shí)間-劑量-死亡率模型，各參數(shù)估計(jì)值見表7。經(jīng)Hosmer & Lemeshow檢驗(yàn)得到卡方值P=0.076>0.05，說明模型擬合無顯著異質(zhì)性存在，即擬合成功。劑量效應(yīng)參數(shù)β=0.477 5，說明MaWys-01各濃度的孢子懸液對紅火蟻均有一定的致死效果。處理后第4天的時(shí)間效應(yīng)參數(shù)值最大，可知第4天是紅火蟻的死亡高峰期，此估計(jì)與試驗(yàn)觀察情況一致。

表6 不同時(shí)段綠僵菌MaWys-01菌株對紅火蟻工蟻的LC50Table 6 Median lethal concentration (LC50) on different time of the M. anisopliae MaWys-01 strain against S. invicta workers

表7 MaWys-01菌株對紅火蟻工蟻的時(shí)間-劑量-死亡率模型Table 7 The time-dose-mortality model of the MaWys-01 strain against S. invicta workers

3 討論與結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)，在11株白僵菌和9株綠僵菌菌株中，白僵菌BSX-PC和綠僵菌MaWys-01對紅火蟻工蟻致病力最強(qiáng)。以濃度1×107個(gè)孢子·mL-1的孢子懸液接后10 d，BSX-PC菌株對紅火蟻工蟻的校正死亡率和僵蟲率分別為(67.14±0.22)%和(52.31±0.31)%；MaWys-01菌株對紅火蟻工蟻的校正死亡率和僵蟲率分別為(81.93±0.94)%和(64.52±0.56)%；BSX-PC和MaWys-01菌株接種后6 d的LC50分別為1.01×106和2.42×105個(gè)孢子·mL-1，兩株菌株對紅火蟻工蟻致死效應(yīng)最強(qiáng)的時(shí)間均是接菌后3～5 d。進(jìn)一步測定兩個(gè)菌株不同濃度對紅火蟻工蟻的致病力，所有濃度下綠僵菌MaWys-01的致病力都略高于白僵菌BSX-PC，以濃度1×108個(gè)孢子·mL-1的孢子懸液接菌后10 d，綠僵菌MaWys-01對紅火蟻的校正死亡率達(dá)99.20%。綜合分析，白僵菌BSX-PC及綠僵菌MaWys-01在紅火蟻生物防治中有較大應(yīng)用潛力。

王磊等[16]研究了3株金龜子綠僵菌對紅火蟻的致病力，以濃度1×108個(gè)孢子·mL-1接菌，M09菌株致病力最強(qiáng)，接菌后10 d紅火蟻工蟻的累計(jì)死亡率為73.3%；許齊愛等[17]研究了黃綠綠僵菌(MetarhiziumflavovirideGams & Roszypal)不同菌株對紅火蟻大型和小型工蟻的致病力，致病力最強(qiáng)的SM076菌株在1×108個(gè)孢子·mL-1濃度下，LT50分別為6.14 d和7.81 d，LT50較MaWys-01長3.51 d；以上差異的原因可能是不同菌株對紅火蟻的致病力不同所致。楊佳后等[18]篩選4株白僵菌對紅火蟻的致病力研究，5974菌株以濃度1×108個(gè)孢子·mL-1接菌，10 d的累計(jì)校正死亡率為88.3%，LC50為2.4×106個(gè)孢子·mL-1，5974菌株10 d的累計(jì)校正死亡率要略大于BSX-PC的79.59%，但是LC50大于BSX-PC的1.52×105個(gè)孢子·mL-1。這說明BSX-PC菌株在前期對紅火蟻的致病力強(qiáng)于5974菌株；呂利華等[13]篩選出的白僵菌Bb02和Bb03以濃度1×108個(gè)孢子·mL-1接菌，10 d的累計(jì)死亡率接近100%，與本試驗(yàn)篩選的菌株MaWys-01累計(jì)死亡率相似。同時(shí)他們所篩選的淡紫擬青霉Pl04菌株15 d的累計(jì)死亡率只有69.84%，對紅火蟻的致病力較低。李軍等[19]使用白僵菌與氯化鈉復(fù)配對紅火蟻致病力效果顯著高于單獨(dú)使用白僵菌，并使用巢內(nèi)注射式生物防控裝置進(jìn)行了相關(guān)田間防治試驗(yàn)，在防治30 d后紅火蟻減退率高達(dá)98.35%。本試驗(yàn)可參考其研究思路進(jìn)行后續(xù)研究，探討不同鹽溶液與綠僵菌的復(fù)配對紅火蟻的致病力的影響，進(jìn)一步完善田間防治試驗(yàn)。