李建鵑，羅 揚(yáng)，周柳婷，白 瑩，李 鍵，吳承禎

(1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)

木麻黃(CasuarinaequisetifoliaL.)是我國(guó)重要的沿海沙地防護(hù)林和經(jīng)濟(jì)用材林樹種，在防海浪侵蝕、保持水土、改良沙地土壤、恢復(fù)海岸帶生態(tài)系統(tǒng)等方面發(fā)揮著重要作用[1]。然而，木麻黃存在嚴(yán)重的連栽障礙，表現(xiàn)為在同一地塊連續(xù)多代種植后，木麻黃林生物量、林分凈生產(chǎn)力均呈下降趨勢(shì)，植株生長(zhǎng)發(fā)育不良，幼苗存活率顯著降低。連栽障礙造成木麻黃的產(chǎn)量和質(zhì)量逐代下降，嚴(yán)重制約了我國(guó)沿海防護(hù)林生態(tài)效益和經(jīng)濟(jì)效益。目前國(guó)內(nèi)許多樹種均存在連栽障礙問題，如杉木[Cunninghamialanceolata(Lamb.) Hook.]，桉樹(EucalyptusrobustaSmith)和毛白楊(PopulustomentosaCarr.)等。由于濱海沙地適生樹種較少，目前尚無可替代木麻黃的優(yōu)質(zhì)樹種，因此，木麻黃連栽障礙問題成為亟待解決的林業(yè)問題。

近年來關(guān)于木麻黃連栽障礙的研究成果較多，不同學(xué)者所持觀點(diǎn)不一。大量研究表明，木麻黃人工林連續(xù)多代栽種后，由于樹種單一，在林分穩(wěn)定性、抗病蟲害和抗干擾能力上有所下降，在發(fā)揮森林生態(tài)效益方面存在不足[2]。研究指出，引起植物連栽障礙的原因主要包括3個(gè)方面：(1)土壤理化性質(zhì)惡化、肥力衰退；(2)植物化感自毒作用；(3)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能退化，微生態(tài)失衡。針對(duì)土壤肥力下降問題，人們普遍選擇施加肥料的措施，雖然能夠在一定程度上增加木麻黃的產(chǎn)量，但無法從根源上解決連栽障礙問題[3]。在植物化感自毒作用方面，發(fā)現(xiàn)木麻黃根系分泌的化感物質(zhì)會(huì)抑制其幼苗生長(zhǎng)[4-6]。在土壤微生物群落方面，學(xué)者提出化感物質(zhì)除產(chǎn)生自毒作用外，還對(duì)根際微生物群落結(jié)構(gòu)有選擇塑造作用[7]。根際微生物群落能積極響應(yīng)植物化感物質(zhì)釋放、土壤營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)循環(huán)等生態(tài)過程，進(jìn)而間接影響植物生長(zhǎng)發(fā)育[8]。因此，植物-土壤-微生物之間的相互作用成為連栽障礙研究的熱點(diǎn)[9]。

然而，絕大部分微生物難以培養(yǎng)，傳統(tǒng)的微生物研究方法只能培養(yǎng)1%的土壤微生物。與傳統(tǒng)研究方法相比，BIOLOG微平板和磷脂脂肪酸(phospholipid fatty acid，PLFA)技術(shù)克服了傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的局限性，具有簡(jiǎn)便、高效、定量的特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能研究。BIOLOG微平板技術(shù)通過統(tǒng)計(jì)土壤微生物對(duì)不同碳源的利用效率，分析微生物群落功能變化；磷脂脂肪酸技術(shù)根據(jù)微生物磷脂含量與生物量存在固定的比例關(guān)系，分析土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化。本研究結(jié)合BIOLOG微平板和磷脂脂肪酸(PLFA)技術(shù)，探討連栽木麻黃根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能多樣性變化，以期為進(jìn)一步揭示木麻黃連栽障礙奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

試驗(yàn)樣地位于福建省惠安赤湖國(guó)有防護(hù)林場(chǎng)(118°55′E，24°35′N)，該林場(chǎng)占地面積432.7 hm2，地處中國(guó)南亞熱帶氣候區(qū)，年均溫19.8 ℃，極端低溫1 ℃，極端高溫35 ℃，年降雨量1 029 mm，年蒸發(fā)量2 000 mm。該林場(chǎng)栽植有3個(gè)不同代數(shù)的木麻黃人工林，其中第1代(the first rotation plantation，F(xiàn)CP)木麻黃林栽植于1987年，第2代(the second rotation plantation，SCP)栽植于2011年，第3代(the third rotation plantation，TCP)栽植于2014年。不同代數(shù)木麻黃林的主要伴生樹種均為少量的臺(tái)灣欒樹[Koelreuteriaelegans(Seem.) A. C. Smith]和潺槁木姜子[Litseaglutinosa(Lour.) C. B. Rob.]，林下植被均為霍香薊(AgeratumconyzoidesL.)和鬼針草(BidenspilosaL.)。該林地土壤為紅壤性風(fēng)積沙土、泥炭性風(fēng)積沙土及風(fēng)積黃沙土，土層較厚。

1.2 土壤樣品的采集

2018年10月，在FCP、SCP和TCP設(shè)立3個(gè)林地概況相近的20 m×20 m試驗(yàn)樣地，每個(gè)樣地設(shè)3個(gè)重復(fù)樣方，共9個(gè)樣方。采用“抖落法”收集木麻黃根際土壤，沿“S”形路徑在每個(gè)樣方內(nèi)選擇20株平均胸徑、樹高相近的木麻黃，去除其落葉層后逐層挖去上層覆土，剪下細(xì)根分枝并輕輕抖動(dòng)，仍粘在細(xì)根上的即為根際土壤，將每個(gè)樣方內(nèi)取得的20份根際土壤混勻?yàn)?份土樣，用小毛刷收集到自封袋中保存?zhèn)溆茫搏@得9份土壤樣品。土樣通過2 mm篩選后，一部分保存于-80 ℃冰箱，另一部分土樣4 ℃冰箱保存用于測(cè)定土壤中微生物多樣性。土壤理化性質(zhì)測(cè)定參照吳則焰等[10-11]的方法。

1.3 土壤微生物碳源利用測(cè)定分析

稱取5 g鮮土置高壓滅菌后的三角瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)0.85% 的NaCl無菌水100 mL，封口， 120 r·min-1振蕩30 min， 冰浴中靜置2 min。取上清液5 mL置100 mL滅菌三角瓶中，加入45 mL無菌水，重復(fù)稀釋3次，制得1∶1 000提取液。將BIOLOG微平板預(yù)熱到28 ℃，用移液器取150 μL提取液于各孔中，28 ℃恒溫避光培養(yǎng)，在第 1、2、3、4、5、6和7天用ELISA 反應(yīng)微平板讀數(shù)器讀取590 nm光密度值。BIOLOG微平板每孔平均顏色變化率(average well color development，AWCD)是檢驗(yàn)微生物生理活動(dòng)強(qiáng)度的一個(gè)重要指標(biāo)。rAWCD=[∑(C-R)]/N，其中C是所測(cè)定31個(gè)碳源孔的光密度值，R為對(duì)照孔的光密度值，N為碳源的數(shù)目。

1.4 磷脂脂肪酸提取與測(cè)定

稱量鮮土10 g與20 mL含有0.2 mol·L-1KOH的甲醇溶液加入50 mL離心管中，充分震蕩均勻后37 ℃溫育1 h(每隔10 min將樣品震蕩1次)。加入1.0 mol·L-1的醋酸3 mL中和pH值，充分混勻后漩渦振蕩1 min。加10 mL正己烷，600 r·min-1離心15 min。用移液器將上層清液轉(zhuǎn)到新試管，用冷凍干燥儀將溶劑揮發(fā)至全干。將PLFA溶解于1 mL正己烷/甲基丁基醚溶液(體積比為1∶1)。加入10 μL濃度為1 μg·mL-1的內(nèi)標(biāo)i19:0，過濾后用于GC-MS檢測(cè)。采用全自動(dòng)進(jìn)樣裝置Varian 240 GC-MS檢測(cè)PLFA，條件為：二階程序升高柱溫，70 ℃起始1 min，再以20 ℃·min-1升溫至170 ℃，維持2 min后以5 ℃·min-1升溫至280 ℃，持續(xù)5 min，以40 ℃·min-1升溫至 300 ℃，1.5 min后結(jié)束。進(jìn)樣分流比為20∶1。

磷脂脂肪酸命名方式及原則參照FROSTEGARetal[12]。PLFA是一種具備標(biāo)記性質(zhì)的脂肪酸，可顯示不同微生物群體的相對(duì)特征。從已有的研究中可知i17:0，i18:0，i15:0，16:1ω9c，a15:0等可用于革蘭氏陽性菌[G(+)]鑒定，16:1ω7c，cy17:0，cy19:0，16:1ω9t等可用于革蘭氏陰性菌[G(-)]鑒定；18:1ω9c，18:3ω6c(6,9,12)，18:3ω3等可用于真菌鑒定；10Me16:0，9Me18:0，10Me18:0等可用于放線菌的鑒定[13]。采用峰面積法和內(nèi)標(biāo)曲線法測(cè)算PLFA含量(μg·g-1)， i19:0作為內(nèi)標(biāo)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用EXCEL 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，方差分析和多樣性指數(shù)分析采用SPSS 22軟件，冗余度分析(redundancy analysis，RDA)采用Canoco 4.5軟件。參考鄭潔等[14]的方法，利用PLFA數(shù)據(jù)計(jì)算土壤微生物群落多樣性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同代數(shù)木麻黃根際土壤理化性質(zhì)

不同代數(shù)木麻黃根際土壤理化性質(zhì)見表1。pH值隨著連栽代數(shù)增加略有上升。不同代數(shù)木麻黃根際土壤養(yǎng)分含量存在差異，TN、AN、TP均呈現(xiàn)出FCP>SCP>TCP的規(guī)律，即連栽導(dǎo)致土壤地力衰退。其中TN 從FCP的0.52 g·kg-1下降到TCP的0.27 g·kg-1，損失量達(dá)48.08%。從FCP至TCP，AN、TP的損失量分別為62.11%、30.00%，即連栽導(dǎo)致木麻黃生長(zhǎng)所必需的N、P營(yíng)養(yǎng)元素均有一定程度下降。

表1 試驗(yàn)樣地土壤理化性質(zhì) Table 1 Soil physic-chemical properties of experimental plots

2.2 不同代數(shù)木麻黃根際微生物碳源利用分析

2.2.1 不同代數(shù)的土壤微生物群落碳源代謝活性 不同代數(shù)木麻黃土壤微生物群落平均顏色變化率見圖1。隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，土壤微生物對(duì)碳源的利用量隨時(shí)間增加而增加，到168 h時(shí)基本趨于穩(wěn)定。FCP土壤的AWCD最高，表明FCP根際微生物對(duì)碳源的利用能力顯著高于SCP和TCP。TCP土壤的AWCD最低，表明連栽顯著降低了根際微生物對(duì)碳源的利用率。

2.2.2 不同代數(shù)根際土壤微生物碳源利用特征 BIOLOG微平板的31種碳源可分成6大類，即羧酸類、多聚物、糖類、酚酸類、氨基酸類、胺類。通過分析不同代數(shù)木麻黃根際微生物對(duì)不同類型碳源利用情況(圖2)可知，根際微生物對(duì)不同碳源利用程度存在顯著差異。除胺類呈現(xiàn)FCP>TCP>SCP趨勢(shì)外，SCP和TCP根際微生物對(duì)其他5種碳源利用程度較FCP都呈現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)。

2.3 不同代數(shù)木麻黃根際土壤微生物磷脂脂肪酸分析

2.3.1 連栽木麻黃根際微生物的磷脂脂肪酸種類和含量 PLFA分析共檢測(cè)到11種標(biāo)記性脂肪酸(表2)。在FCP土壤中檢測(cè)到11種PLFA，總含量為246.74±1.45 μg·g-1；SCP土壤檢測(cè)到11種PLFA，總含量為241.85±0.08 μg·g-1；TCP土壤檢測(cè)到10種PLFA，總含量為228.19±3.21 μg·g-1。從FCP至SCP磷脂脂肪酸生物標(biāo)記總含量下降了2.99%，從SCP到TCP下降了6.65%，可見連栽導(dǎo)致木麻黃根際土壤微生物種類與含量逐代降低。從表2可知，不同類型PLFA含量具有明顯差異，但不同代數(shù)木麻黃根際土壤的PLFA種類差別不大。在3代不同的木麻黃根際土壤中，完全分布的PLFA生物標(biāo)記有10種，包括18:1ω9c、a15:0、i16:0、20:0ω等。而16:1ω9僅在FCP和SCP土壤中分布，屬于不完全分布。

圖1 不同代數(shù)木麻黃根際微生物平均顏色變化率Figure 1 Average well color development of microbial communities in the rhizosphere of different rotation plantations of C. equisetifolia

注：不同字母表示不同代數(shù)間差異顯著(P<0.05)。Note：different letters indicate significant differences among different rotations(P<0.05).

表2 不同代際木麻黃土壤微生物PLFA種類與含量 Table 2 Types and contents of PLFA in the soil microorganism of different rotation plantations of C. equisetifolia

2.3.2 連栽木麻黃根際土壤優(yōu)勢(shì)微生物的磷脂脂肪酸分布 有表2可知，F(xiàn)CP土壤中最多的脂肪酸是i16:0，其含量為44.24±1.58 μg·g-1(17.93%)；在SCP和TCP土壤中，含量最多的脂肪酸同為i16:0，其含量分別為54.92±0.73 μg·g-1(22.71%)、65.26±1.03 μg·g-1(28.60%)，表明其在不同代數(shù)木麻黃根際土壤中起主要作用，在土壤中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。i16:0、a15:0、i16:1ω5c和16:1ω9是FCP土壤中含量較多的4種PLFA，占總PLFA含量的51.04%；i16:0、18:1ω9c、16:1ω9 和a15:0這4種脂肪酸在SCP土壤中含量較多，占總PLFA含量的55.23%；在TCP土壤中，i16:0、18:1ω9c、10Me17:0和10Me18:0這4種PLFA占總PLFA含量的67.32%?？傮w而言，不同代數(shù)土壤中含量較高的PLFA種類大致相同，以i16:0、a15:0和18:1ω9c為主。

2.3.3 連栽木麻黃根際土壤特征微生物的磷脂脂肪酸分布 由表2可知，不同代數(shù)木麻黃根際特征微生物PLFA含量存在較大差異，呈現(xiàn)細(xì)菌>放線菌>真菌的規(guī)律。分別統(tǒng)計(jì)它們的PLFA總含量及其比值，結(jié)果如表3所示。不同代際木麻黃根際土壤中，G(+)的PLFA總量均高于G(-)、真菌、放線菌。G(+)和G(-)之間、真菌和細(xì)菌之間標(biāo)記性脂肪酸的含量存在較大差異，尤其是G(+)與G(-)之間比值較大。G(+)、G(-)在FCP土壤中含量最高，TCP土壤最低，大小排序FCP>SCP>TCP；真菌、放線菌在TCP土壤中含量最高，F(xiàn)CP土壤最低，大小排序TCP>SCP>FCP。G(+)/G(-)大小排序?yàn)門CP>SCP>FCP；真菌/細(xì)菌大小排序?yàn)門CP>SCP>FCP。

表3 不同代數(shù)木麻黃土壤中特征微生物類群PLFA含量與比值Table 3 Contents and ratios of PLFA in the soil microorganism groups of different rotation plantations of C. equisetifolia

2.4 連栽木麻黃根際土壤微生物群落多樣性指數(shù)

由表4可知，F(xiàn)CP土壤的Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)、Brillouin指數(shù)和McIntosh指數(shù)均高于SCP、TCP，且FCP、SCP、TCP根際微生物群落的4項(xiàng)多樣性指數(shù)的差異均達(dá)顯著性水平，總體趨勢(shì)是FCP>SCP>TCP，即連栽條件下木麻黃土壤微生物群落多樣性逐年衰退。

表4 不同代數(shù)木麻黃根際土壤微生物群落多樣性指數(shù) Table 4 Diversity index of rhizosphere soil microflora communities in different rotation plantations of C. equisetifolia

2.5 連栽木麻黃根際土壤微生物與土壤理化性質(zhì)冗余度分析

冗余度(RDA)分析用于解釋不同變量對(duì)土壤微生物群落多樣性的影響。圖3可以看出，第一、第二、第三和第四軸的特征值分別為0.868、0.092、0.016和0.002。 第一個(gè)RDA軸解釋了物種數(shù)據(jù)中的大部分方差，物種-環(huán)境相關(guān)值為0.998。RDA結(jié)果表明，不同代數(shù)微生物的含量受總氮(TN)，速效氮(AN)，總磷(TP)和土壤酸堿度(pH值)的顯著影響。

圖3 土壤微生物與土壤理化性質(zhì)冗余度分析Figure 3 Redundancy analysis of the soil microorganism and soil physic-chemical properties

3 討論與結(jié)論

土壤微生物對(duì)森林生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)具有重要影響。本研究結(jié)果表明，在連續(xù)多代種植后，木麻黃根際微生物群落結(jié)構(gòu)及其功能多樣性發(fā)生退化。BIOLOG微平板技術(shù)結(jié)果表明，不同代數(shù)的土壤微生物對(duì)各類碳源的利用程度存在顯著差異，連栽后木麻黃根際土壤微生物群落對(duì)碳源利用能力顯著下降，均呈現(xiàn)FCP>SCP>TCP趨勢(shì)。根系分泌物是植物與根際微生物相互作用的媒介，也是微生物重要的營(yíng)養(yǎng)來源，直接或間接影響著根際微生物的代謝和生長(zhǎng)發(fā)育，進(jìn)而對(duì)根際微生物的種類和分布產(chǎn)生影響[15]。本研究中木麻黃連栽后對(duì)各類碳源利用率均有所下降，其原因還有待探究，將在后續(xù)的研究中進(jìn)一步探索。磷脂是所有生物活細(xì)胞重要的膜組分，根據(jù)磷脂脂肪酸的種類和比例可以鑒別土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的多樣性[16-17]。木麻黃人工林連栽導(dǎo)致土壤微生物群落多樣性下降，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生巨大改變。PLFA生物標(biāo)記的總含量在FCP中最高，其次是SCP，TCP中最低。除此之外，木麻黃人工林連栽后土壤微生物群落結(jié)構(gòu)也發(fā)生了變化。真菌/細(xì)菌比值通常受土壤養(yǎng)分含量影響，當(dāng)土壤養(yǎng)分降低時(shí)，更能適應(yīng)惡劣環(huán)境的真菌能夠較好的生存，而細(xì)菌含量則會(huì)降低。

木麻黃根際土壤微生物與土壤理化性質(zhì)冗余分析表明，不同代數(shù)根際土壤微生物的含量受到總氮、速效氮、總磷和土壤pH值的顯著影響，這和鐘文輝等[18]提出的觀點(diǎn)一致。前人研究發(fā)現(xiàn)氮、磷等元素的供應(yīng)與轉(zhuǎn)換影響著土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化[19-20]；與此同時(shí)，土壤微生物結(jié)構(gòu)對(duì)氮、磷等元素的代謝循環(huán)也起著關(guān)鍵作用，進(jìn)而間接影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程[21-23]。由此推測(cè)，木麻黃連栽后其氮、磷等元素含量的變化在一定程度上影響了根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，微生物群落結(jié)構(gòu)失衡造成木麻黃連栽障礙。此外，RDA分析表明速效磷和全鉀與根際微生物含量無顯著相關(guān)性，可見土壤理化性質(zhì)雖是構(gòu)成植物根際微生物群落多樣性的關(guān)鍵因素，但并不是唯一因素。土壤理化性質(zhì)對(duì)根際微生物群落結(jié)構(gòu)有選擇塑造作用，根際不同微生物群落結(jié)構(gòu)對(duì)土壤養(yǎng)分的需求具有獨(dú)特性；反之，根際微生物群落多樣性對(duì)土壤營(yíng)養(yǎng)循環(huán)也有反作用，進(jìn)而間接影響植物生長(zhǎng)發(fā)育過程。但是本研究仍存在一些不足之處，如微生物群落變化受何種根系分泌物影響、根系分泌物如何介導(dǎo)微生物群落結(jié)構(gòu)變化等問題尚不明確，需進(jìn)一步研究。

木麻黃連栽障礙給我國(guó)沿海防護(hù)林造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，但如何有效克服至今仍是一個(gè)懸而未決的難題。在木麻黃連栽障礙成因及作用機(jī)理尚未明確的情況下，前人研究多集中于土壤養(yǎng)分衰竭和木麻黃化感自毒作用方面的研究。然而，土壤養(yǎng)分衰竭和化感自毒物質(zhì)都只是誘因，都需要通過土壤微生物轉(zhuǎn)化、加工，間接影響受體植物的生長(zhǎng)發(fā)育，導(dǎo)致植物發(fā)生連栽障礙[24]。本研究從植物-土壤-微生物互作角度作為切入點(diǎn)，深入揭示木麻黃連栽障礙形成過程中對(duì)根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能特征變化的影響，闡明連栽木麻黃根際微生態(tài)退化規(guī)律，不僅對(duì)于破解木麻黃連栽障礙有重要理論意義，而且對(duì)林業(yè)生產(chǎn)和經(jīng)營(yíng)管理也有重要的應(yīng)用前景。