吳姍姍，田文妮，陸思名，蔡欣，黎攀，杜冰*

華南農(nóng)業(yè)大學(xué)（廣州 510642）

佛手（Citrus medica L.，Var. Sarcodactylis）為蕓香料柑桔屬植物，又名佛手柑、佛手香櫞、蜜羅柑等。我國(guó)佛手資源豐富，藥用歷史悠久，主要用于通氣化痰、止痛等，此外佛手還具有抗氧化、抗衰老、抗菌、抗腫瘤、提高免疫力等功效[1]。近年來(lái)，對(duì)佛手果的開發(fā)利用研究主要有佛手精油、佛手含片、佛手果脯、佛手酸奶及佛手果酒等[2]，發(fā)酵果酒因其口感獨(dú)特、營(yíng)養(yǎng)豐富，越來(lái)越受到消費(fèi)者青睞，但目前佛手果酒多是以酵母菌單獨(dú)發(fā)酵，而結(jié)合乳酸菌一起復(fù)合發(fā)酵制備佛手果酒鮮有報(bào)道。

乳酸菌和釀酒酵母菌混合發(fā)酵在乳制品、飲料和果酒等制品中有廣泛的應(yīng)用，相對(duì)于僅用單一菌的發(fā)酵制品，在營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功能等方面都更有積極的作用，不僅具有原有材料的營(yíng)養(yǎng)與功效成分，又賦予了發(fā)酵制品獨(dú)特的口感與風(fēng)味。乳酸芽孢桿菌DU-106兼具乳酸菌產(chǎn)酸和芽孢抗逆性強(qiáng)的特點(diǎn)，能夠抵抗許多不良外界因素的影響，比一般的益生菌更具使用優(yōu)勢(shì)，適應(yīng)多種環(huán)境[3]，在發(fā)達(dá)國(guó)家，有很多以乳酸芽孢桿菌為主要成分的產(chǎn)品已經(jīng)在市場(chǎng)上流通銷售[4]。

試驗(yàn)以廣西佛手為主要原料，經(jīng)產(chǎn)乳酸芽孢桿菌和酵母混合發(fā)酵，確定佛手果發(fā)酵酒的最佳工藝條件，為佛手果的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

佛手，產(chǎn)自廣西；釀酒酵母菌171，購(gòu)于安琪酵母公司，并為實(shí)驗(yàn)室保存；乳酸芽孢桿菌DU-106，菌粉濃度為1×1012CFU/g，為華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院106保藏；市售白砂糖；β-環(huán)狀糊精、氯化鈉、氫氧化鈉均為分析純。

1.2 主要設(shè)備與儀器

VD-650超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；DHP-600電熱恒溫培養(yǎng)箱，北京市永光明醫(yī)療儀器廠；DHG-9070 A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；PHS-3C精密pH計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；精密電子天平，北京賽多利斯天平有限公司；高壓滅菌鍋，蘇州凈化設(shè)備有限公司；25 mL附溫比重瓶，上海市信誼儀器廠有限公司；手持式折光儀，溫州標(biāo)諾儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

1.3.2 工藝要點(diǎn)

1.3.2.1 佛手果脫苦處理

取新鮮佛手（去皮）100 g置于燒杯中，切成2 cm×2 cm×2 cm左右的小塊，加入100 mL蒸餾水及0.78 gβ-環(huán)狀糊精，44 ℃水浴鍋水浴42 min[5]。

1.3.2.2 菌種活化

菌種選用產(chǎn)乳酸芽孢桿菌DU-106和釀酒酵母菌171。分別配制50 mL生理鹽水和50 mL 5%糖水，用高壓滅菌鍋于121 ℃下滅菌15 min，分別加入0.1 g產(chǎn)乳酸芽孢桿菌菌粉和2.5 g釀酒酵母菌，30 ℃下活化30 min鐘。

1.3.2.3 發(fā)酵

將脫苦后的100 g佛手果塊置于2.5 L發(fā)酵罐中，倒入100 mL蒸餾水，加入適量白砂糖，接種，混合搖勻，在試驗(yàn)設(shè)定溫度下發(fā)酵。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

以接種量（0.10%，0.20%，0.30%，0.40%和0.05%）、發(fā)酵溫度（20，23，26，29和32 ℃）、初始糖度（10%，15%，20%，25%和30%）和發(fā)酵時(shí)間（3，5，7，9和11 d）為單因素控制變量，測(cè)定發(fā)酵后佛手果發(fā)酵酒的pH、可溶性固形物含量、總酸及酒精度。

1.3.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇接種量、初始糖度及發(fā)酵溫度這3個(gè)因素進(jìn)行正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，每個(gè)因素選取3個(gè)水平，采用L9(34)正交表（表1），并根據(jù)感官評(píng)定表中的各項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表

1.3.5 分析檢測(cè)

在設(shè)定的條件下進(jìn)行試驗(yàn)，以發(fā)酵開始記為0 d，在發(fā)酵的第3，5，7，9和11天取樣測(cè)定佛手果酒的感官指標(biāo)、pH、總酸、可溶性固形物含量和酒精度，對(duì)其發(fā)酵過程的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行分析。

1.3.5.1 感官指標(biāo)評(píng)定

根據(jù)佛手果酒的特性，選擇澄清度、香氣、滋味與色澤能反映果酒品質(zhì)的指標(biāo)為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，每個(gè)指標(biāo)為25分，總分為100分。感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)見表2。

1.3.5.2 理化指標(biāo)測(cè)定

pH，酸度計(jì)測(cè)定法；可溶性固形物，使用糖度計(jì)；總酸、酒精度，GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素優(yōu)化試驗(yàn)

2.1.1 接種量對(duì)佛手果發(fā)酵影響

接種量過少，酵母轉(zhuǎn)化不完全，酒中殘?zhí)呛扛?；?dāng)接種量過高，酵母繁殖需消耗營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，影響糖分轉(zhuǎn)化為酒精，也不利于發(fā)酵[7]。由圖1可知，隨著接種量的提高，佛手果酒總酸和酒精度逐漸上升，pH和可溶性固形物呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，其中接種量對(duì)佛手果發(fā)酵酒的可溶性固形物含量以及酒精度有較大影響?？梢钥闯?，當(dāng)接種量為0.20%時(shí)可溶性固形物含量明顯下降，說明此時(shí)菌種對(duì)佛手果發(fā)酵酒中的糖的利用率開始升高。另外，當(dāng)接種量為0.30%時(shí)，酒精度為4.23%vol，當(dāng)接種量為0.50%時(shí)，佛手果發(fā)酵酒的酒精度為5.14%vol，說明接種量在0.30%～0.50%范圍內(nèi)酒精度變化不大，因此選擇接種量為0.30%。

表2 佛手果發(fā)酵酒各項(xiàng)感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

圖1 接種量對(duì)佛手果發(fā)酵酒的影響

2.1.2 發(fā)酵溫度對(duì)佛手果發(fā)酵影響

發(fā)酵溫度是影響佛手果發(fā)酵酒發(fā)酵品質(zhì)的一個(gè)重要因素，溫度低時(shí)菌種代謝活力相對(duì)較弱，酵母轉(zhuǎn)化酒精以及產(chǎn)乳酸芽孢桿菌產(chǎn)酸能力較弱，酒精度較低，酸度不足，口感不佳；溫度過高會(huì)使酵母衰老加速[8]。由圖2可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，可溶性固形物持續(xù)下降，酒精度和總酸含量升高。由圖2可以看出，在20～32 ℃，發(fā)酵溫度越高，果酒發(fā)酵程度越大。由圖2可以得出，當(dāng)發(fā)酵溫度為32 ℃時(shí)，佛手果發(fā)酵酒中白砂糖的利用率最高，說明在此溫度下微生物活性相對(duì)較大，佛手果發(fā)酵酒發(fā)酵相對(duì)完全。因此確認(rèn)32 ℃為佛手果發(fā)酵酒的最佳發(fā)酵溫度。

圖2 發(fā)酵溫度對(duì)佛手果發(fā)酵酒的影響

2.1.3 初始糖度對(duì)佛手果發(fā)酵影響

初始糖度對(duì)于佛手果酒的發(fā)酵是一個(gè)重要的影響因素，主要影響發(fā)酵后的風(fēng)味以及微生物活動(dòng)。高濃度糖會(huì)抑制菌種的生長(zhǎng)繁殖，同樣使發(fā)酵不徹底[9]。由圖3可以看出，隨著初始糖度的增加，總酸、可溶性固形物、酒精度均增加，當(dāng)初始糖度達(dá)到20%時(shí)，酒精度和可溶性固形物上升速率減緩，此時(shí)酒精度達(dá)到4.32%vol，考慮到佛手果發(fā)酵酒作為果酒，酒精度不宜過高，否則佛手原有的清新的風(fēng)味將會(huì)被酒精味所遮蓋，因此選擇初始糖度為20%作為最佳添加量。

圖3 初始糖度對(duì)佛手發(fā)酵酒的影響

2.1.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)佛手果發(fā)酵影響

由圖4可知，發(fā)酵3 d時(shí)，佛手果發(fā)酵酒的pH與固形物含量較高，總酸含量較低，說明此時(shí)佛手果發(fā)酵酒中的菌種還沒有完全發(fā)揮活性，對(duì)白砂糖的利用率較低，發(fā)酵過程中所產(chǎn)的酸和酒精較低。在發(fā)酵5 d后，產(chǎn)乳酸芽孢桿菌和酵母在佛手果發(fā)酵酒中開始發(fā)揮活性，白砂糖的利用率逐漸增高，酒精度上升至1.32%vol。當(dāng)發(fā)酵到第9天時(shí)，發(fā)酵速率有所下降，白砂糖的利用率與總酸產(chǎn)量的變化速率也有所下降。在發(fā)酵11 d后，發(fā)酵基本趨于穩(wěn)定，各項(xiàng)指標(biāo)變化幅度均有所降低。在發(fā)酵第7天時(shí)，佛手果發(fā)酵酒中pH為3.67，總酸為0.550 8 g/L，可溶性固形物含量為4.3%，酒精度4.23%vol，果酒澄清呈淡黃色，口感醇厚，感官評(píng)分較高，因此選擇最佳發(fā)酵時(shí)間為7 d。

發(fā)酵時(shí)間相對(duì)于其他因素對(duì)佛手果酒的影響較小，且發(fā)酵時(shí)間為7 d時(shí)感官評(píng)分最高，因此，確定發(fā)酵時(shí)間為7 d，不再選取發(fā)酵時(shí)間作為正交試驗(yàn)的因素。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)佛手發(fā)酵酒的影響

綜上，由單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，接種量為0.3%，發(fā)酵溫度為32 ℃，初始糖度為20%，發(fā)酵時(shí)間為7 d，在此發(fā)酵條件下可得出較為優(yōu)質(zhì)的佛手果發(fā)酵酒。

2.2 佛手果發(fā)酵酒正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇接種量、發(fā)酵溫度及初始糖度這3個(gè)因素進(jìn)行正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，每個(gè)因素選取3個(gè)水平，采用(34)正交表。試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。

由表3和表4可知，3個(gè)因素極差分析為RA＞RB＞RC，即佛手發(fā)酵果酒的影響因素為菌種接種量＞初始糖度＞發(fā)酵溫度。從直觀分析表可以看出，菌種的最佳接種量是0.30%，初始糖度的最佳為20%，發(fā)酵溫度最佳為25 ℃，此條件下發(fā)酵制備的佛手果酒感官評(píng)分最高，達(dá)到85.4分。

表3 果酒發(fā)酵正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

表4 果酒發(fā)酵正交試驗(yàn)方差分析表

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

為更好地驗(yàn)證上述試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，根據(jù)上述的試驗(yàn)步驟對(duì)該最佳工藝條件再進(jìn)行一次驗(yàn)證試驗(yàn)，并測(cè)定佛手果發(fā)酵酒的四項(xiàng)理化性質(zhì)及感官評(píng)分。根據(jù)上述驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果，在接種量為0.30%，初始糖度為20%，發(fā)酵溫度為25 ℃的最優(yōu)發(fā)酵條件下制備的佛手果發(fā)酵酒的感官評(píng)分，為85.4分，系九組試驗(yàn)中最高。因此通過驗(yàn)證，可以得出佛手果發(fā)酵酒的最佳工藝為接種量為0.30%，初始糖度20%，發(fā)酵溫度25 ℃。

3 結(jié)論

通過單因素和正交試驗(yàn)，優(yōu)化并確立了佛手果發(fā)酵酒的最佳發(fā)酵工藝：接種量0.30%，發(fā)酵溫度為25℃，初始糖度為20%，發(fā)酵時(shí)間為7 d。在此條件下佛手果發(fā)酵酒的pH為3.67，總酸為0.55 g/L，可溶性固形物含量為4.30%，酒精度4.23%vol，感官評(píng)定為85.4分。