成傳香，王鵬旭，賈蒙，周心智，馬亞琴*

1(西南大學(xué) 柑桔研究所，重慶，400712) 2(重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，果樹研究所，重慶，401329)

柑橘是世界第一大宗水果，其品種主要包括寬皮柑橘、橙類、柚類、檸檬和金柑等[1]。其中橙類在2018、2019年度全球產(chǎn)量預(yù)計(jì)達(dá)5 180萬t，中國為720萬t；寬皮柑橘全球產(chǎn)量預(yù)計(jì)達(dá)3 140萬t，中國為2 200萬t，占全球?qū)捚じ涕佼a(chǎn)量的70%以上[2]。中國柑橘種植以寬皮柑橘為主，主栽的三大柑橘品種為溫州蜜柑、椪柑和南豐蜜桔；橙類分為甜橙、血橙和臍橙等，其中甜橙是榨汁的主要品種。柑橘由于其風(fēng)味獨(dú)特及富含營養(yǎng)物質(zhì)而深受消費(fèi)者的喜愛，其中風(fēng)味由香氣物質(zhì)的種類、含量及比例決定，是影響柑橘果實(shí)品質(zhì)最重要的特性之一。而香氣物質(zhì)是果實(shí)成熟過程中的次級(jí)代謝產(chǎn)物，主要為烯烴類、醇類、醛類、酮類和酯類等[3]。

感官評(píng)定是評(píng)價(jià)柑橘汁香氣品質(zhì)的常用方法之一，但其受評(píng)定者主觀因素影響較大，因此需結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用法以確定香氣物質(zhì)的種類和含量。利用香氣值(odor activity value，OAV)，即香氣物質(zhì)的濃度與香氣閾值的比值來判斷香氣強(qiáng)度，從而可確定香氣物質(zhì)對(duì)整體風(fēng)味的貢獻(xiàn)程度，其中OAV>1的香氣物質(zhì)被稱為香氣活性物質(zhì)。在對(duì)香氣物質(zhì)分析鑒定時(shí)，傳統(tǒng)的方差分析(analysis of variance, ANOVA)無法準(zhǔn)確有效地鑒別重要香氣物質(zhì)，而多元統(tǒng)計(jì)分析學(xué)則可以彌補(bǔ)這一不足，目前在食品風(fēng)味分析中已得到廣泛應(yīng)用，主要包括主成分分析(principle component analysis，PCA)和偏最小二乘回歸分析(partial least square regression，PLSR)等。其中PCA是將原來眾多且具有一定相關(guān)性的指標(biāo)進(jìn)行重新組合，從而得到一組新的互相無關(guān)的綜合指標(biāo)來替代原來的指標(biāo)。PCA的優(yōu)勢(shì)在于其對(duì)多項(xiàng)指標(biāo)降維的同時(shí)能保留數(shù)據(jù)中的主要信息，從而減少了運(yùn)算的復(fù)雜度和時(shí)間，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于水果[4]、白酒[5]以及精油[6]的風(fēng)味研究中。而偏最小二乘法是一種多因變量對(duì)多自變量的回歸建模方法，是一種比較完善的基于因子分析的多變量校正方法。它在考慮自變量的同時(shí)也考慮了因變量的作用，同時(shí)通過折中各自空間內(nèi)的因子，使模型能較好地同時(shí)描述自變量和因變量，牛云蔚等[7]利用PLSR研究了櫻桃酒呈味物質(zhì)與感官質(zhì)量的相關(guān)性，確定了對(duì)每個(gè)感官屬性有顯著性貢獻(xiàn)的呈味物質(zhì)。林順順等[8]則利用PLSR研究了煙葉中化學(xué)成分與感官質(zhì)量的相關(guān)性。

本研究擬采用頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(HS-SPME/GC-MS)檢測各類柑橘汁中香氣物質(zhì)的含量，通過OAV值篩選出香氣活性物質(zhì)，并比較品種和壓榨方式對(duì)香氣物質(zhì)種類及含量的差異，同時(shí)利用多元統(tǒng)計(jì)分析學(xué)分析柑橘種類、感官屬性和香氣活性物質(zhì)之間的相關(guān)性，以確定香氣物質(zhì)對(duì)風(fēng)味的貢獻(xiàn)程度，為柑橘果實(shí)加工及種類辨別提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實(shí)驗(yàn)共選用12種柑橘原料制汁(見表1)，其中南豐蜜桔分為2批榨汁，一批機(jī)器壓榨制汁(西南大學(xué)柑桔研究所中試車間FMC壓榨機(jī)壓榨)，另一批手榨制汁(家用錐式榨汁機(jī)壓榨)；哈姆林樣品汁從重慶忠縣派森百公司生產(chǎn)線上精濾加工單元取樣，其他果汁樣品均采取錐式壓榨。榨汁后經(jīng)80目無菌紗布過濾，存于-80 ℃超低溫冰箱備用。

環(huán)己酮(分析純，純度≥99.5%，質(zhì)量濃度為0.95 mg/μL)、C5～C25正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品，德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；大茴香醛、葉醇、2-苯乙醇、癸醛和三乙酸甘油酯均為標(biāo)準(zhǔn)品，上海阿拉丁試劑有限公司。

表1 柑橘果實(shí)種類、分類及來源地Table 1 The species, classification and origin ofcitrus fruits

1.2 儀器與設(shè)備

7890A/5975C氣相色譜-單四極桿質(zhì)譜儀(配DB-5MS石英毛細(xì)管柱),美國Agilent公司；Combi PAL氣相色譜多功能自動(dòng)進(jìn)樣器,瑞士CTC公司；Milli-Q Advantage A10超純水系統(tǒng),美國Millpore公司；PB3002-S/FACT分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司；二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷(DVB/CAR/PDMS 50/30 μm)萃取頭,美國Supelco公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 香氣物質(zhì)測定

1.3.1.1 樣品萃取條件

參照鄭潔等[9]的方法，并加以修改。準(zhǔn)確稱取5.0 g果汁，置于20 mL螺口玻璃瓶中，加入1.0 g干燥后的NaCl，再加入2 μL環(huán)己酮作為內(nèi)標(biāo)物，用聚四氟乙烯隔熱墊密封瓶蓋旋緊備用，每個(gè)樣品測定3次。頂空固相微萃取條件：40 ℃平衡20 min；頂空吸附30 min；解析5 min。

1.3.1.2 色譜和質(zhì)譜條件

氣相色譜條件:色譜柱為DB-5MS(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；升溫程序：35 ℃保持5 min，以3 ℃/min升至180 ℃，保持2 min，再以5 ℃/min升至 240 ℃，保持2 min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；不分流進(jìn)樣；載氣為He (純度>99.999%)；載氣流速1 mL/min。

質(zhì)譜條件:電子電離(electron ionization，EI)源；電子能量70 eV；傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度 230 ℃；四極桿溫度150 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z35～400。

1.3.1.3 定性和半定量分析

利用圖譜庫(NIST 2008和Flavour 2.0)的檢索結(jié)果，并以C5-C25正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間計(jì)算出化合物的相對(duì)保留指數(shù)，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[10-11]定性，確定相應(yīng)的揮發(fā)性物質(zhì)。定量方法采用內(nèi)標(biāo)法，內(nèi)標(biāo)物為環(huán)己酮。通過各成分峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積對(duì)比進(jìn)行半定量分析，含量單位為μg/g。

1.3.2 感官評(píng)價(jià)

根據(jù)ISO8589:2007標(biāo)準(zhǔn)在感官實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行感觀分析。參與感官的小組人員共計(jì)12人，其中6男6女，成員年紀(jì)在20～30歲之間。參考相關(guān)文獻(xiàn)[11]，確定本次研究的柑橘汁香氣描述詞依次為：甜香、果香、青香、花香、皮感和木香，之后對(duì)小組人員進(jìn)行香氣訓(xùn)練。各感官屬性的定義及香氣訓(xùn)練標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 各感官屬性的定義及香氣訓(xùn)練標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Definition of sensory attributes and training criteria for aroma

感官實(shí)驗(yàn)采用10點(diǎn)打分制(0～9)，即：0代表沒有嗅聞到該香氣，9代表該香氣強(qiáng)度極強(qiáng)；從0到9香氣強(qiáng)度呈遞增趨勢(shì)。本次感官評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)是在無異味的感官實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，將準(zhǔn)備好的果汁樣品盛放在無異味的品評(píng)杯中，經(jīng)隨機(jī)編碼后交給感官評(píng)價(jià)員對(duì)每種樣品的感官屬性進(jìn)行打分，進(jìn)行2次重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS Statistics 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，XLSTAT 2016軟件進(jìn)行主成分分析，Unscrambler軟件進(jìn)行偏最小二乘法分析，EXCEL 2013用于繪制圖表及數(shù)據(jù)整理。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同種類柑橘汁香氣物質(zhì)的種類和含量

實(shí)驗(yàn)中采用HS-SPME/GC-MS測定13種柑橘汁中的香氣物質(zhì)的種類和含量，共測得67種揮發(fā)性物質(zhì)，其中烯烴類物質(zhì)種類最多(15種)，其次為醇類(14種)、酯類(13種)和醛類(12種)物質(zhì)種類，酚類物質(zhì)種類最少，僅有2種。此外，另有4種酮類物質(zhì)和7種其他成分被檢測出來。

從表3中可以看出，在所有柑橘汁的香氣成分中，烯烴類物質(zhì)在種類和含量2方面都占比極大，其中含量所占百分比最高可達(dá)95%。3種寬皮柑橘的香氣物質(zhì)種類和含量要低于愛媛38號(hào)雜柑和大部分橙類(塔羅科血橙和奧林達(dá)夏橙除外)，其中椪柑和南豐蜜桔分別是香氣物質(zhì)含量最高和最低的寬皮柑橘，但南豐蜜桔的香氣物質(zhì)種類要高于其他2種寬皮柑橘。南豐蜜桔分為兩批榨取，分別為機(jī)榨和手榨，機(jī)榨汁中的香氣物質(zhì)種類和含量要遠(yuǎn)高于手榨汁，原因是機(jī)榨過程中，柑橘果皮精油中的香氣物質(zhì)進(jìn)入到汁中。愛媛38號(hào)雜柑香氣物質(zhì)含量雖高于寬皮柑橘，但明顯低于絕大部分橙類。在所有橙類中，紅夏橙和納塔爾晚熟甜橙的香氣物質(zhì)含量最高，塔羅科血橙和奧林達(dá)夏橙含量最低，并且所有甜橙類香氣物質(zhì)含量均高于塔羅科血橙。同為榨汁的主要品種，美國的新奇士橙和中國的江津長葉橙香氣物質(zhì)含量相差無幾。哈姆林作為國內(nèi)甜橙榨汁主要品種之一，其機(jī)榨樣品汁中香氣物質(zhì)種類最多，但含量并不高，原因可能是派森百公司車間榨汁采用的是切半式榨汁，因此沒有全果壓榨汁中其香氣物質(zhì)含量高。

表3 不同種類柑橘汁中各類香氣物質(zhì)含量及數(shù)量Table 3 The content and amount of various aroma substances in different citrus juices

注：括號(hào)里的數(shù)字表示香氣物質(zhì)的數(shù)量。

醇類香氣物質(zhì)主要是芳樟醇、α-松油醇和4-萜烯醇，橙花叔醇和苯乙醇分別只存在于南豐蜜桔手榨汁和機(jī)榨汁中，正庚醇是江安夏橙特有的醇類香氣物質(zhì)。醛類香氣物質(zhì)主要是反式-2-己烯醛、壬醛和癸醛，正己醛和α-甲基肉桂醛都是愛媛38號(hào)特有的醛類香氣物質(zhì)。香芹酮、香葉基丙酮和β-紫羅蘭酮作為主要的酮類香氣物質(zhì)在寬皮柑橘、雜柑和橙類分布中沒有顯著差異，而諾卡酮只存在于橙類果實(shí)中。酯類物質(zhì)作為一類重要的香氣物質(zhì)，存在于甜橙中的種類和數(shù)量要明顯高于寬皮柑橘和雜柑。烯烴類香氣物質(zhì)主要有檸檬烯、月桂烯和巴倫西亞橘烯等，與江倩[12]的研究結(jié)果一致。其中檸檬烯在所有香氣物質(zhì)中含量是最高的，對(duì)傘花烴只存于南豐蜜桔手榨汁和塔羅科血橙汁中。

2.2 不同種類柑橘汁中特征香氣物質(zhì)

含量高的香氣物質(zhì)其香氣強(qiáng)度不一定高，如含量高的檸檬烯對(duì)整體香氣貢獻(xiàn)程度并不高，利用OAV值可以較準(zhǔn)確地判定香氣強(qiáng)度。OAV>1的香氣物質(zhì)稱為特征香氣物質(zhì)，也叫做香氣活性物質(zhì)，OAV值越高，香氣強(qiáng)度越大，對(duì)整體香氣的貢獻(xiàn)程度也就越大。查閱相關(guān)文獻(xiàn)[13-15]得到香氣物質(zhì)的香氣閾值，結(jié)合GC-MS的定量結(jié)果，計(jì)算所得OAV值。表4所示為13種柑橘汁中OAV>1的香氣物質(zhì)。

表4 不同種類柑橘汁中OAV>1的香氣物質(zhì)Table 4 Aroma substances of OAV>1 in different citrus juices

由表4可以看出，13種柑橘汁中OAV>1的香氣物質(zhì)總共37種，醇類、醛類、酮類、酯類、萜烯類和酚類分別有8、6、4、6、11和2種，其中OAV值較高的香氣物質(zhì)有芳樟醇、壬醛、癸醛、β-紫羅蘭酮、丁酸乙酯、巴豆酸乙酯、月桂烯和檸檬烯，與陳婷婷[16]的報(bào)道結(jié)果基本一致。檸檬烯雖然OAV值較高，但XIAO[11]利用GC-O發(fā)現(xiàn)，檸檬烯的強(qiáng)度得分為中等靠下，表明香氣強(qiáng)度并不高。機(jī)榨哈姆林橙汁包含最多的特征香氣物質(zhì)，為30種，其次為江津長葉橙，包含29種，3種寬皮柑橘低于其他種類柑橘汁，分別包含19、21和17種。TAKAYUKI[17]在5種雜交寬皮柑橘品種中共檢測到49種香氣活性物質(zhì)，其中醛類物質(zhì)種類最多。SERKAN等[18]在2種血橙中共檢測到了15種香氣活性物質(zhì)，OAV值較高的香氣物質(zhì)有芳樟醇、檸檬烯和諾卡酮。SHI等[19]認(rèn)為丁酸乙酯、辛醛和癸醛等是甜橙的典型香氣物質(zhì)，芳樟醇、檸檬烯、辛醛和α-蒎烯是寬皮柑橘的典型香氣物質(zhì)。

2.3 感官評(píng)定

表5列出了13種柑橘汁中各感官屬性的打分結(jié)果，其中同列感官屬性評(píng)分上的不同字母表示不同種類的柑橘汁的感官屬性有明顯的差異性。方差分析結(jié)果表明，6種感官屬性中皮感和青香的差異性最顯著，其次是甜香、花香和果香，最后是木香。由感官評(píng)價(jià)結(jié)果可以看出，甜香和果香的評(píng)分較高，表明其特征香氣比較突出。椪柑的甜香評(píng)分最高，手榨的南豐蜜桔樣品汁果香評(píng)分最高，而青香評(píng)分最高的是納塔爾晚熟甜橙，甚至要高于2種機(jī)榨的柑橘汁，除此之外，花香評(píng)分最高的是江津長葉橙，木香評(píng)分最高的是機(jī)榨哈姆林甜橙樣品汁。由于機(jī)器壓榨的原因，南豐蜜桔和哈姆林的皮感評(píng)分最高。對(duì)13種柑橘汁感官評(píng)價(jià)結(jié)果繪制雷達(dá)圖,得到各汁樣品的感官屬性評(píng)分結(jié)果與雷達(dá)圖一致，表明這6種感官屬性可以較好的解釋柑橘汁的香氣特征。

表5 不同種類柑橘汁感官評(píng)價(jià)結(jié)果Table 5 Sensory evaluation results of different citrus juices

注：“a、b、c、d、e、f、g”代表不同種類柑橘汁中同一種感官屬性的差異性。

2.4 不同種類柑橘汁、感官和香氣物質(zhì)的相關(guān)性分析

本研究以柑橘汁樣品及感官屬性作為分析對(duì)象，采用主成分分析法對(duì)13個(gè)柑橘汁樣品的6種感官屬性進(jìn)行分析。第F1主成分的貢獻(xiàn)率為66.06%，第F2主成分的貢獻(xiàn)率為18.48%，2個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率已經(jīng)達(dá)到84.54%，表明第F1、第F2兩個(gè)主成分解釋了原香氣特征變量84.54%的方差信息。與第F1主成分呈現(xiàn)正相關(guān)的指標(biāo)主要有甜香、果香和花香，與第F2主成分呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)的指標(biāo)僅有木香，其余均呈現(xiàn)正相關(guān)。

圖1 主成分載荷圖Fig.1 Principal component load diagram

由圖1可知，13種柑橘汁樣品根據(jù)距離遠(yuǎn)近被分在不同的象限內(nèi)，第1主成分正半軸的NO.1、NO.2、NO.3、NO.4、N0.7、N0.8、NO.9和NO.10為一類，負(fù)半軸的NO.5、NO.6、N0.11、NO.12和NO.13為一類。第2主成分正半軸的NO.7、NO.9、NO.10、NO.12和NO.13為一類，負(fù)半軸的NO.2、NO.3、NO.4、NO.5、NO.6和NO.8為一類。

在PC1軸正方向有3種寬皮柑橘、1種雜柑、1種血橙和3種甜橙以及花香、果香和甜香，負(fù)方向有2種機(jī)榨汁樣品、3種甜橙以及皮感、青香和木香。沿PC2軸，負(fù)方向僅有3種寬皮柑橘、2種機(jī)榨汁樣品和1種血橙以及木香，其他種類柑橘汁及感官屬性均對(duì)PC2的正方向工作效率較大。愛媛38號(hào)、椪柑和手榨南豐蜜桔汁樣品與甜香在PCA圖上距離較近，表明樣品感官屬性甜香較為突出。新奇士橙、江津長葉橙和奧林達(dá)夏橙與果香相關(guān)性較大，2種機(jī)榨汁樣品與木香相關(guān)性明顯，納塔爾晚熟甜橙與青香和皮感相關(guān)性明顯。13種柑橘汁樣品與花香距離均較遠(yuǎn)，表明其與花香相關(guān)性較差。PC2軸可以明顯將寬皮柑橘、雜柑、血橙與甜橙區(qū)分開來，PC1軸可以將機(jī)榨汁樣品與手榨汁樣品區(qū)分開來。除此之外，甜香不明顯的溫州蜜柑樣品可以與另外2種寬皮柑橘區(qū)分開來，果香明顯的新奇士橙、江津長葉橙和奧林達(dá)夏橙以及青香和皮感明顯的納塔爾晚熟甜橙可以與其他甜橙樣品區(qū)分開。新奇士橙和江津長葉橙在PCA圖中位置相近，表明各感官屬性較為一致。YUAN等[20]通過PCA可以將寬皮柑橘、酸橙及血橙等13個(gè)柑橘品種區(qū)分開。LIVNAT等[21]利用PCA分析了柑橘雜交品種其香氣物質(zhì)的相似性。

以不同種類柑橘汁中的特征香氣物質(zhì)與感官屬性作為分析對(duì)象，采用偏最小二乘法對(duì)37種特征香氣物質(zhì)和6種感官屬性進(jìn)行相關(guān)性分析。將特征香氣物質(zhì)含量作為X變量，每種柑橘汁樣品的感官屬性作為Y變量，建立PLSR模型，考察對(duì)每個(gè)感官屬性顯著性相關(guān)的特征香氣物質(zhì)，如圖2所示。

圖2 37種特征香氣物質(zhì)與6種感官屬性之間的相關(guān)性分析Fig.2 Analysis of correlation between 37 characteristic aroma substances and 6 sensory properties

從圖2中可以看出，甜香、青香以及花香與香氣物質(zhì)均有顯著相關(guān)關(guān)系，沒有香氣物質(zhì)與果香、皮感及木香顯著相關(guān)。其中，辛酸乙酯和巴豆酸乙酯對(duì)甜香的正相關(guān)性最為顯著，正辛醇、反式-2-己烯醛和丁酸乙酯對(duì)青香的正相關(guān)性最為顯著，而與花香正相關(guān)性最顯著的特征香氣物質(zhì)為香茅醇、葉醇、巴倫西亞橘烯和金合歡烯。而在陳佳瑩[22]的研究中，芳樟醇和橙花醇對(duì)花香有積極效應(yīng)。

3 結(jié)論

3種寬皮柑橘汁其香氣物質(zhì)的種類和含量均要低于雜柑和大部分橙類，南豐蜜桔機(jī)榨樣品汁中香氣物質(zhì)含量要遠(yuǎn)高于手榨樣品汁。在所有柑橘汁樣品的香氣物質(zhì)中，共鑒定出37種特征香氣物質(zhì)，主要包括芳樟醇、月桂烯、壬醛等，其中包含特征香氣物質(zhì)最多的是哈姆林橙和江津長葉橙，最少的則為3種寬皮柑橘。

實(shí)驗(yàn)采用主成分分析和偏最小二乘法回歸分析研究柑橘汁、感官屬性和特征香氣物質(zhì)的相關(guān)性，結(jié)果表明：多元統(tǒng)計(jì)分析可以明確將3種寬皮柑橘、8種橙類和1種雜柑區(qū)分開，同時(shí)可以將寬皮柑橘品種以及橙類品種具體劃分，還可以將機(jī)榨汁與手榨汁樣品區(qū)分。寬皮柑橘的甜香屬性較為突出，而與甜香具有積極效應(yīng)的特征香氣物質(zhì)為辛酸乙酯和巴豆酸乙酯；新奇士橙、江津長葉橙和奧林達(dá)夏橙與果香相關(guān)性較大，2種機(jī)榨汁樣品與木香相關(guān)性明顯，但沒有發(fā)現(xiàn)與果香及木香顯著相關(guān)的香氣物質(zhì)；納塔爾晚熟甜橙與青香和皮感相關(guān)性明顯，而與青香呈正相關(guān)的物質(zhì)有丁酸乙酯、正辛醇等。綜上，本研究主要利用GC-MS和多元統(tǒng)計(jì)分析研究柑橘的香氣物質(zhì)，比較品種、壓榨方式對(duì)香氣物質(zhì)種類和含量造成的差異，采用客觀、科學(xué)的鑒定手段分析香氣物質(zhì)對(duì)柑橘果實(shí)香氣品質(zhì)的貢獻(xiàn)程度，為柑橘果實(shí)品質(zhì)評(píng)價(jià)和加工提供了參考信息。基于該研究結(jié)果，后續(xù)通過設(shè)計(jì)GC-O實(shí)驗(yàn)以及香氣重組與缺失實(shí)驗(yàn)，將對(duì)特征香氣物質(zhì)進(jìn)一步驗(yàn)證。除了主要賦香物質(zhì)外，同時(shí)還需關(guān)注在果實(shí)香氣構(gòu)成中起協(xié)調(diào)、修飾和定香作用，且含量極少的化合物。