鄧卓丹，陳文學，蘭思琪，陳衛(wèi)軍，陳海明

(海南大學 食品科學與工程學院，海南 海口，570228)

槲皮素(3,3′,4′,5,7-五羥基黃酮)是一種天然黃酮醇，它具有多種生物活性，除了能抗致癌、抗菌和抗病毒外，也是最有效的抗氧化劑之一[1-3]。流行病學研究表明，經(jīng)常食用富含槲皮素的食物可能降低心血管損害和癌癥風險[4]。然而，日常飲食不能提供足夠量的槲皮素，因此需要制備增強槲皮素的食物或相關(guān)補品[5]。但由于其有限的水溶性和低穩(wěn)定性，限制了其在親水性食品系統(tǒng)中的應用[6]。

玉米醇溶蛋白是玉米中的主要貯藏蛋白，玉米醇溶蛋白中超過50%的氨基酸殘基是疏水性的，可溶于乙醇水溶液(60%～90%)，但不溶于水[7]，根據(jù)其高度疏水性，玉米醇溶蛋白可以通過反溶劑沉淀法(antisolvent precipitation, ASP)轉(zhuǎn)化為球形膠體納米粒子，這使得它特別適合于遞送功能性組分[8]。在過去的幾十年中，玉米醇溶蛋白被廣泛用于制造包埋功能性成分的納米粒子，如葉黃素[9]、姜黃素[10]等。但玉米醇溶蛋白納米粒子的包封效率低，可將玉米醇溶蛋白核與生物聚合物殼組成復合膠體顆粒，用ASP法制備，以改善玉米醇溶蛋白納米顆粒的物理穩(wěn)定性和功能特性。一些小分子表面活性劑可以通過降低表面疏水性，增加靜電來防止玉米醇溶蛋白納米粒子的聚集和空間排斥。有研究表明玉米醇溶蛋白和硬脂酸鈉復合物通過非特異性疏水吸引，改善了玉米醇溶蛋白的溶解度、擴散遷移率和界面負荷[11]。以玉米醇溶蛋白作為載體的復合納米粒子用于遞送生物活性成分將具有較大的潛力。

卵磷脂被認為是一種安全且生物相容性優(yōu)良的賦形劑，并已廣泛應用于食品、制藥和化妝品等行業(yè)。它由脂肪酸和磷酸酯基酯化的甘油骨架組成，最近有報道稱，基于卵磷脂的膠體遞送系統(tǒng)可能是生物活性成分的合適載體。研究證實卵磷脂可以在乙醇水溶液中與玉米醇溶蛋白相互作用，形成穩(wěn)定的復合膠體納米顆粒[12]。

本研究將比較分析用ASP法制備得到的不同比例的玉米醇溶蛋白-卵磷脂-槲皮素納米顆粒的穩(wěn)定性及其抗氧化能力，以期開發(fā)出用于功能性食品和藥物的槲皮素納米輸送系統(tǒng)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米醇溶蛋白，上海麥克林生化科技有限公司；卵磷脂、槲皮素，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；NaOH、HCl、無水乙醇,均為分析純，上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

AR124CN電子天平，上海奧豪斯儀器有限公司；FE20型pH計，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；HSJ系列恒溫水浴攪拌器，江蘇科析儀器有限公司；SHZ-D(III)型循環(huán)水真空泵、RE-5298型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；TU1810型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；Christ Alpha1型冷凍干燥機，德國Marin Christ公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 納米顆粒制備

將1.0 g玉米醇溶蛋白溶解在100 mL 70%(體積分數(shù))乙醇水溶液中，磁力攪拌2 h。加入不同量的卵磷脂，使玉米醇溶蛋白與卵磷脂的質(zhì)量比分別為1∶0、 0∶1、10∶1、5∶1、2∶1、1∶1、2∶3和1∶2，攪拌3 h。然后將0.1 g槲皮素加入到玉米醇溶蛋白-卵磷脂溶液中并磁力攪拌1 h，把20 mL玉米醇溶蛋白-卵磷脂-槲皮素乙醇水溶液加入到60 mL去離子水中，磁力攪拌30 min。殘留在分散體中的乙醇通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在45 ℃條件下蒸發(fā)。使用0.1 mol/L HCl或NaOH將分散體調(diào)節(jié)至pH 4.0后,2 000 r/min離心20 min以除去大顆粒和游離的槲皮素。最后，將分散體在4 ℃的冰箱中儲存以進一步分析，并將部分分散體冷凍干燥48 h獲得干燥顆粒。

1.3.2 包埋和裝載效率

用無水乙醇稀釋玉米醇溶蛋白-卵磷脂-槲皮素納米顆粒分散體，當乙醇濃度達到80%(體積分數(shù))后進行超聲波處理(超聲比100%，80 Hz，15 min)，以80%乙醇作為空白對照，在373 nm下測定樣品的吸光值，繪制濃度標準曲線方程：y=0.015+0.023,R2=0.996，包埋率(EE)和載量率(LE)通過以下公式(1)和(2)計算：

(1)

(2)

1.3.3 玉米醇溶蛋白-卵磷脂-槲皮素納米顆粒分散體的穩(wěn)定性

測定不同比例下納米顆粒粒徑、電位、多分散系數(shù)(polydivercity coefficient, PDI)情況。將新鮮制備納米水分散體用蒸餾水稀釋20倍,分散均勻后取1 mL放入樣品池進行測定。

1.3.4 傅里葉變換紅外光譜(fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR)

將干燥的納米顆粒與KBr以1∶100的比例混合于瑪瑙研缽中，研磨混勻，壓片后制成透明薄片，放置紅外光譜儀中于4 cm-1的分辨率從4 000～400 cm-1進行頻率掃描。

1.3.5 差示掃描量熱法測量(differential scanning calorimetry, DSC)

研究純槲皮素和不同質(zhì)量比下玉米醇溶蛋白與卵磷脂的納米顆粒的熱學特性。將5 mg冷凍干燥的樣品在標準鋁盤中稱重并密封，以10 ℃/min的恒定速率從30～200 ℃加熱,使用空的密封鋁盤作為參考，同時用干燥氮氣以50 mL/min的速率恒定吹掃。

1.3.6 掃描電鏡(scanning electron microscope, SEM)

觀察凍干樣品的微觀形態(tài)。在觀察之前，用IB-5型離子濺射儀噴金鍍膜以避免在電子束下充電，對不同納米顆粒進行微觀結(jié)構(gòu)觀察。

1.3.7 玉米醇溶蛋白-卵磷脂-槲皮素納米顆粒分散液的抗氧化特性

(1)DPPH自由基清除活性

稱取0.002 g的DPPH粉末溶于25 mL無水甲醇中，測得溶液的吸光值A517在1.2～1.3范圍內(nèi)，然后以此溶液與樣品溶液4∶1(V∶V)的比例加入具塞試管中，將混合溶液充分混勻并放置于30 ℃水浴鍋中恒溫避光加熱45 min，以甲醇為對照組，Vc作為標準對照，在吸收波長為517 nm處測得樣品DPPH的自由基清除能力,根據(jù)公式(3)計算[13]：

(3)

式中，A0，對照組甲醇的吸光值;A1，樣品的吸光值。

(2)總抗氧化能力(total antioxidant capacity, T-AOC)

根據(jù)總抗氧化能力(TAOC)測定試劑盒(貨號A015)操作步驟進行操作，以蒸餾水調(diào)零，Vc作為標準對照，在520nm處測定各管的吸光值，計算公式如下所示：

(4)

1.3.8 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

所有試驗測定3次,采用Origin 2018軟件對試驗數(shù)據(jù)進行單因素顯著性方差分析與繪圖，通過Duncan’s多重比較檢驗(P<0.05)分析方法計算樣品的平均值±標準差。

2 結(jié)果與討論

2.1 玉米醇溶蛋白-卵磷脂納米顆粒對槲皮素的包埋特性

在表1中，單一玉米醇溶蛋白和卵磷脂納米顆粒中的槲皮素的包封率分別為58.7%和37.4%。隨著卵磷脂比例的增加，包封率逐漸增加，表明了槲皮素、玉米醇溶蛋白和卵磷脂之間的相互作用(靜電吸引、氫鍵和疏水效應)提高了顆粒的包埋能力。在玉米醇溶蛋白與卵磷脂質(zhì)量比為1∶2時，復合納米顆粒的包埋率增強至73.2%，顯示出更好的包封容量。當玉米醇溶蛋白與卵磷脂質(zhì)量比從1∶0變?yōu)?∶1時，槲皮素在玉米醇溶蛋白-卵磷脂復合納米粒子中的包里率逐漸增強。繼續(xù)增加卵磷脂含量，玉米醇溶蛋白-卵磷脂-槲皮素復合納米顆粒的負載率降低，歸因于負載率是包封的槲皮素與玉米醇溶蛋白-卵磷脂總質(zhì)量的質(zhì)量比。卵磷脂的存在可以顯著提高復合納米顆粒的包埋能力，并且玉米醇溶蛋白和卵磷脂之間可能存在增強槲皮素包埋率的協(xié)同作用。

表1 不同玉米醇溶蛋白-卵磷脂質(zhì)量比下的槲皮素包封率及負載率 單位：%Table 1 Quercetin encapsulation and loading efficiency under different the mass ratio of m(zein)∶m(lecithin)

注：同一列不同小寫字母表示具有顯著性差異，下同。

2.2 傅里葉變換紅外光譜分析

通過FTIR表征玉米醇溶蛋白，卵磷脂和槲皮素之間的分子相互作用，如圖1所示。

1∶0、1∶2、2∶3、1∶1、2∶1、5∶1、10∶1為玉米醇溶蛋白和卵磷脂質(zhì)量比，下同。圖1 玉米醇溶蛋白-卵磷脂-槲皮素納米顆粒的FTIR圖Fig.1 FTIR of zein-lecithin-quercetin nanoparticles

2.3 玉米醇溶蛋白-卵磷脂-槲皮素納米顆粒的熱穩(wěn)定性

通過DSC測定樣品中生物活性化合物的物理狀態(tài)變化。從圖2可以看出，槲皮素的DSC曲線在119 ℃附近顯示有尖銳的吸熱峰，這歸因于槲皮素晶體的熔化并且表明存在結(jié)晶態(tài)的槲皮素。

圖2 玉米醇溶蛋白-卵磷脂-槲皮素納米顆粒的DSC圖Fig.2 DSC chart of zein-lecithin-quercetin nanoparticles

表2中給出了不同比例復合顆粒的熔融溫度(Tm)和熔化焓(ΔHm)，納米顆粒的熔融溫度隨著卵磷脂質(zhì)量比的增加逐漸提高，在比例為0∶1和1∶1的玉米醇溶蛋白-卵磷脂-槲皮素復合納米顆粒觀察到了槲皮素的特征吸熱峰，分別為118.58和119.71 ℃，這表示結(jié)合了槲皮素的納米顆粒分散均勻。與其他顆粒相比，比例為1∶2的納米顆粒在約130.88 ℃下顯示出最高的吸熱峰，并且有相對較低的熔化焓(87.49 g/g)，表明它的熱穩(wěn)定性很高[16]。卵磷脂的存在可以增強納米顆粒中不同組分之間的相互作用，例如疏水效應和靜電相互作用，導致高吸熱峰溫度[12]。研究表明，β-乳球蛋白和磷脂之間的疏水相互作用也可以增加蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性[17]。

表2 玉米醇溶蛋白-卵磷脂-槲皮素納米顆粒的DSC表Table 2 DSC of zein-lecithin-quercetin nanoparticles

2.4 玉米醇溶蛋白-卵磷脂-槲皮素納米顆粒溶液的穩(wěn)定性

由表3中看出，卵磷脂單獨包埋槲皮素的粒徑要小于玉米醇溶蛋白，電位值為-18.8 mV。而玉米醇溶蛋白-卵磷脂-槲皮素納米顆粒隨著卵磷脂含量的增加，粒徑尺寸向不穩(wěn)定趨勢變化而電位無顯著變化。在玉米醇溶蛋白與卵磷脂的質(zhì)量比為10∶1和5∶1時，復合納米顆粒的粒徑偏大，平均分別為459.03和324.66 nm，PDI均在0.3以上，電位值從-29.43到-28.27mV。該結(jié)果與FU等[18]提出的zein初始質(zhì)量濃度過高會影響納米顆粒粒徑的假設結(jié)果一致。然而，玉米醇溶蛋白與卵磷脂的質(zhì)量比為1∶1、2∶3和1∶2的顆粒粒徑相對較小，PDI也降低至0.2以下，可能是由于玉米醇溶蛋白與卵磷脂形成緊密結(jié)構(gòu)，從而減小復合納米顆粒的尺寸。與單一的卵磷脂或玉米醇溶蛋白包埋槲皮素相比較，三元復合顆粒的電位值均在-25 mV以上，說明疏水性卵磷脂在顆粒內(nèi)部和可能在顆粒表面上的濃度增加降低了復合納米顆粒的ζ-電位[19]。結(jié)果表明增加卵磷脂濃度極大地提高了玉米醇溶蛋白-槲皮素溶液的穩(wěn)定性。

表3 玉米醇溶蛋白-卵磷脂-槲皮素納米顆粒溶液粒徑、電位值和PDITable 3 Zein-lecithin-quercetin nanoparticle solution particle size, potential value and PDI

2.5 玉米醇溶蛋白-卵磷脂-槲皮素納米顆粒溶液的溶解穩(wěn)定性

從圖3看出，放置3 d后，單一包埋槲皮素的玉米醇溶蛋白和玉米醇溶蛋白卵磷脂質(zhì)量比為2∶1的溶液底部均出現(xiàn)了輕微沉淀。30 d后能明顯觀察到單包埋槲皮素的玉米醇溶蛋白和卵磷脂，與玉米醇溶蛋白濃度高的溶液均有明顯沉淀，溶液逐漸偏清，說明包含的槲皮素已經(jīng)與溶液分離。除了質(zhì)量比為1∶1的溶液底部出現(xiàn)輕微沉淀外,質(zhì)量比1∶2和2∶3的溶液穩(wěn)定，無明顯變化，分布均勻，包埋效果好，適合長期存放。

圖3 玉米醇溶蛋白-卵磷脂-槲皮素納米顆粒溶液溶解穩(wěn)定性Fig.3 Solubility stability of zein-lecithin-quercetin nanoparticle solution注：玉米醇溶蛋白單獨包埋槲皮素和卵磷脂單獨包埋槲皮素的樣品分別在圖中顯示100∶0和0∶100。

2.6 玉米醇溶蛋白-卵磷脂-槲皮素納米顆粒的掃描電鏡結(jié)果

單一由玉米醇溶蛋白包埋的槲皮素顆粒有較大的顆粒存在,如圖4-a所示，與其粒徑有關(guān)，且顆粒間存在聚集狀態(tài)，這與黃旭琳等[20]研究結(jié)果一致。

圖4 納米顆粒掃描電鏡圖Fig.4 The SEM of the nanoparticles注：a-1∶0；b-10∶1；c-5∶1；d-2∶3；e-1∶2。

加入卵磷脂后樣品顆粒結(jié)構(gòu)比較緊密，呈現(xiàn)圓形，有明顯黏連，并隨著卵磷脂質(zhì)量比的增大呈現(xiàn)相對疏松且分布更均勻的顆粒分子，可能由于卵磷脂與玉米醇溶蛋白的疏水性作用增強后提高了溶液的界面活性，有利于復合顆粒更均勻分布[21]。

2.7 玉米醇溶蛋白-卵磷脂-槲皮素納米顆粒溶液的抗氧化性質(zhì)

由圖5可知，相比于玉米醇溶蛋白單獨包埋槲皮素，卵磷脂DPPH自由基清除率顯著，達到96%，而其總抗氧化能力很低。當玉米醇溶蛋白與卵磷脂質(zhì)量比從10∶1增加到2∶3時，DPPH自由基的清除能力顯著下降(P<0.05)，但繼續(xù)增加到1∶2時，DPPH+·開始呈現(xiàn)上升趨勢，DPPH自由基清除能力增強。玉米醇溶蛋白質(zhì)量比較高時，總抗氧化能力較低，卵磷脂比例增加達1∶1和1∶2，總抗氧化能力極其顯著(P<0.05)，分別為28.2和34.6 μmol/mL，提高了玉米醇溶蛋白包埋槲皮素的抗氧化能力。而 2∶3時，總抗氧化偏低可能是其受DPPH自由基清除率影響比較大。結(jié)果表明，不同質(zhì)量比的玉米醇溶蛋白-卵磷脂-槲皮素納米顆粒溶液抗氧化能力不同，比例1∶2和1∶1的綜合性能最優(yōu)。

圖5 玉米醇溶蛋白-卵磷脂-槲皮素納米顆粒溶液的DPPH和總抗氧化能力Fig.5 DPPH and total antioxidant capacity of zein- lecithin-quercetin nanoparticle solution

3 結(jié)論

當玉米醇溶蛋白與卵磷脂質(zhì)量比為1∶2時,包封率達到最大，為73.2%,裝載率2.9%，且其熱穩(wěn)定較強，總抗氧化性能優(yōu)，達到34.62%。由此表明,質(zhì)量比為1∶2的玉米醇溶蛋白-卵磷脂復合納米顆?？勺鳛殚纹に氐挠行лd體應用于其活性的保護與長效利用。因此，玉米醇溶蛋白-卵磷脂復合納米粒子可能是水不溶性生物活性化合物的潛在遞送系統(tǒng)，具有增強的包封效率和化學穩(wěn)定性。