李志量 張寒梅 向睿宇 荊可 馮素英

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 皮膚病醫(yī)院皮膚科 江蘇省皮膚病與性病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210042

尋常型天皰瘡（pemphigus vulgaris，PV）是一種以血清中存在橋粒芯蛋白（desmoglein，Dsg）抗體為特征的自身免疫性水皰病。根據(jù)受累部位，可分為皮膚黏膜型和黏膜型天皰瘡，單純皮膚受累的PV較少見。黏膜型PV血清中通常僅有Dsg3抗體，皮膚黏膜型PV 血清中通常同時(shí)存在Dsg1 和Dsg3 抗體［1-2］。部分研究表明［3-6］，Dsg抗體滴度可一定程度上反映PV 患者病情嚴(yán)重程度和病情活動(dòng)度。Dsg抗體可分為抗構(gòu)象表位抗體和抗線狀表位抗體，其中抗構(gòu)象表位抗體有致病性［7］。傳統(tǒng)Dsg抗體檢測(cè)方法檢測(cè)的是抗構(gòu)象表位抗體和抗線狀表位抗體總量。近年來(lái)有文獻(xiàn)報(bào)道［8］，通過(guò)改良的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）可以檢測(cè)出抗構(gòu)象表位Dsg抗體滴度，可能比傳統(tǒng)方法更能反映病情變化。也有研究發(fā)現(xiàn)，膽堿能途徑在天皰瘡的發(fā)病中可能發(fā)揮作用，并且部分患者血清中可以檢測(cè)到乙酰膽堿受體（acetylcholine receptor antibody，AChR）抗體［9］。本研究檢測(cè)了PV 患者血清中抗Dsg 抗體及抗Dsg 構(gòu)象表位抗體的滴度和AChR 抗體滴度，以探究PV血清抗體滴度與病情嚴(yán)重程度和病情活動(dòng)度的相關(guān)性。

對(duì)象與方法

一、對(duì)象

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院于2012—2015 年收治的24例PV患者，男13例，女11例。所有入選病例符合以下標(biāo)準(zhǔn)：①皮膚和/或黏膜出現(xiàn)松弛性水皰，尼氏征陽(yáng)性；②組織病理可見棘層松解細(xì)胞；③直接免疫熒光可見角質(zhì)形成細(xì)胞間IgG 和/或C3 沉積；④Dsg1 和（或）Dsg3 抗體ELISA 檢測(cè)值＞20 U/ml。同時(shí)符合①、②、③或者④時(shí)診斷為PV。按照天皰瘡病情活動(dòng)度分為活動(dòng)期和穩(wěn)定期?；顒?dòng)期指患者發(fā)病初次就診，未系統(tǒng)使用糖皮質(zhì)激素及細(xì)胞毒性藥物，就診前3天有新發(fā)水皰或糜爛面；穩(wěn)定期指至少2周內(nèi)沒有新發(fā)的紅斑和水皰，原有的水皰和糜爛面完全消失，糖皮質(zhì)激素用量相當(dāng)于醋酸潑尼松≤20 mg/d。本文24 例PV 患者均有皮膚和口腔黏膜受累，首次就診時(shí)處于活動(dòng)期。根據(jù)患者病情嚴(yán)重程度，使用不同劑量糖皮質(zhì)激素（部分患者同時(shí)使用環(huán)磷酰胺、麥考酚酯或硫唑嘌呤等免疫抑制劑）治療。共有20 例患者完成隨訪，均為穩(wěn)定期，天皰瘡疾病面積指數(shù)（pemphigus disease area index，PDAI）評(píng)分均≤3，糖皮質(zhì)激素用量相當(dāng)于≤20 mg/d 醋酸潑尼松，穩(wěn)定期患者距首次就診間隔時(shí)間為半年至2 年。本研究通過(guò)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：2010臨審09號(hào)），所有患者均簽署知情同意書。

二、方法

1.PDAI 評(píng)分及血清標(biāo)本采集：24 例活動(dòng)期患者首次就診時(shí)采集血清標(biāo)本，評(píng)估PDAI。20 例患者隨訪至穩(wěn)定期時(shí)再次采集血清標(biāo)本，評(píng)估PDAI。

2.ELISA檢測(cè)Dsg1、Dsg3抗體：將PV患者血清稀釋（1∶101）后，按照ELISA試劑盒（日本株式會(huì)社醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所）說(shuō)明書操作。在波長(zhǎng)450 nm處讀取吸光度（A值），以2個(gè)孔的均值作為結(jié)果，按照說(shuō)明書公式計(jì)算抗體滴度。當(dāng)?shù)味戎担?50 U/ml時(shí)，稀釋血清，重新檢測(cè)，并按照稀釋倍數(shù)計(jì)算真實(shí)滴度。

3. 改良ELSIA 檢測(cè)Dsg1、Dsg3 抗構(gòu)象表位抗體［7，10］：乙二胺四乙酸（EDTA）具有破壞抗原構(gòu)象表位的作用，用EDTA 處理包被抗原的ELISA 孔板30 min 后，再進(jìn)行后續(xù)ELISA 檢測(cè)，可以只檢測(cè)線狀表位的抗體滴度，用傳統(tǒng)方法測(cè)得的抗體滴度減去抗線性表位的抗體滴度，得到的結(jié)果即為抗構(gòu)象表位抗體滴度。

4.ELISA 法檢測(cè)患者血清中AChR 抗體：按照ELISA 試劑盒（武漢華美生物工程有限公司）說(shuō)明書操作，設(shè)2個(gè)復(fù)孔，取平均值。陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)：試驗(yàn)孔A值＞2.1×陰性對(duì)照A值。

結(jié) 果

一、Dsg1抗體及抗構(gòu)象表位Dsg1抗體與PV患者PDAI的關(guān)系

首次就診時(shí)，活動(dòng)期患者的Dsg1 抗體滴度（611.4 ± 136.8）與 抗 構(gòu) 象 表 位Dsg1 抗 體 滴 度（585.5 ± 134.7）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 0.13，P =0.89）?；顒?dòng)期患者的Dsg1抗體滴度及抗構(gòu)象表位Dsg1 抗體滴度與PDAI 評(píng)分均呈正相關(guān)（r = 0.54、0.54，均P ＜0.01）。20 例穩(wěn)定期患者的Dsg1 抗體與抗構(gòu)象表位Dsg1抗體滴度與首次就診時(shí)比較均明顯下降（抗體檢測(cè)陰性或滴度＜活動(dòng)期時(shí)的20%）。

二、Dsg3抗體及抗構(gòu)象表位Dsg3抗體與PV患者PDAI的關(guān)系

首次就診時(shí)，活動(dòng)期患者的Dsg3 抗體滴度（708.6 ± 130.7）高于抗構(gòu)象表位Dsg3 抗體滴度（297.2 ± 54.4），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 2.90，P ＜0.01）?；顒?dòng)期Dsg3 抗體滴度與PDAI 評(píng)分無(wú)相關(guān)性（r=0.11，P=0.62），抗構(gòu)象表位Dsg3 抗體滴度與PDAI評(píng)分呈正相關(guān)（r=0.53，P ＜0.01）。

20 例穩(wěn)定期患者抗構(gòu)象表位Dsg3 抗體滴度（119.9 ± 40.7）低于活動(dòng)期（297.2 ± 54.4），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.52，P ＜0.05）。20 例穩(wěn)定期患者血清中Dsg3 抗體滴度與活動(dòng)期相比，7 例明顯下降，13 例仍存在較高滴度Dsg3 抗體（抗體檢測(cè)滴度＞活動(dòng)期的20%），這13 例患者活動(dòng)期時(shí)的PDAI 評(píng)分（38.26 ± 3.36）高于另外7 例（29.29 ±3.12，t=1.74，P ＜0.05），且這13例患者中有6例在穩(wěn)定期抗構(gòu)象表位Dsg3抗體滴度明顯下降。

三、AChR抗體與PV患者病情的關(guān)系

活動(dòng)期患者中有6 例AChR 抗體陽(yáng)性，穩(wěn)定期患者均為陰性。在上述13例穩(wěn)定期血清中仍存在較高滴度Dsg3抗體的患者中，5例在活動(dòng)期可檢測(cè)到AChR 抗體；上述7例穩(wěn)定期血清中Dsg3抗體明顯下降的患者中，僅1 例在活動(dòng)期可檢測(cè)到AChR抗體（P=0.30）。

討 論

本研究采用傳統(tǒng)的ELISA 與改良ELISA 檢測(cè)PV 患者血清中的Dsg 抗體與抗線性表位的Dsg 抗體。改良的ELISA 通過(guò)EDTA 破壞致病性的構(gòu)象表位，可直接檢測(cè)非致病性線性表位，再與傳統(tǒng)的ELISA 比較，可得到致病性構(gòu)象表位的抗體滴度，理論上更能反映病情嚴(yán)重程度和病情變化。

本研究中，兩種方法檢測(cè)的活動(dòng)期患者Dsg1抗體與抗構(gòu)象表位抗體差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示PV患者血清中Dsg1抗體絕大部分為有致病性的抗構(gòu)象表位抗體；活動(dòng)期患者的Dsg1 抗體滴度及抗構(gòu)象表位Dsg1抗體滴度與PDAI評(píng)分均呈正相關(guān)，這也提示兩種方法測(cè)得的Dsg1抗體及抗構(gòu)象表位Dsg1抗體滴度都可以反映病情的嚴(yán)重程度。在穩(wěn)定期患者中，兩種方法測(cè)得的Dsg1 抗體及抗構(gòu)象表位Dsg1 抗體滴度都顯著下降，提示兩種Dsg1 抗體滴度都可以反映病情變化。本文兩種方法檢測(cè)活動(dòng)期患者Dsg3 抗體時(shí)，Dsg3 抗體滴度顯著高于抗構(gòu)象表位抗體，且活動(dòng)期患者的Dsg3 抗體滴度與PDAI評(píng)分無(wú)相關(guān)性，抗構(gòu)象表位Dsg3抗體滴度與PDAI 評(píng)分呈正相關(guān)，提示患者血清中存在一定數(shù)量的非致病性線狀表位Dsg3 抗體，而采用改良的ELISA 檢測(cè)的抗構(gòu)象表位Dsg3抗體滴度更能反映病情的嚴(yán)重程度和病情的活動(dòng)性。在臨床工作中，結(jié)合改良ELISA 檢測(cè)的Dsg3抗體滴度，可能更有助于反映患者病情活動(dòng)度。

以往部分研究提示，除Dsg抗體外，AChR抗體在PV 發(fā)病中也可能發(fā)揮一定的致病作用［11-12］，但不同的研究中，AChR抗體的檢出率有差別［3，9］。本研究中，24 例活動(dòng)期患者中也只有6 例AChR 抗體陽(yáng)性，而這6例患在病情穩(wěn)定后，抗體滴度都轉(zhuǎn)陰，提示AChR 抗體滴度也可一定程度上反映病情的活動(dòng)情況。值得注意的是，穩(wěn)定期患者中，7 例患者Dsg3 抗體滴度較活動(dòng)期明顯下降，13 例患者血清中仍存在較高滴度的Dsg3 抗體，部分患者滴度甚至高于病情活動(dòng)期。而這13例中，5例在活動(dòng)期可檢測(cè)到AChR 抗體，7 例中，僅1 例可檢測(cè)到AChR抗體，提示穩(wěn)定期患者Dsg3抗體滴度較高的患者，檢測(cè)到AChR 抗體的概率更高，但由于樣本量較少，還需更多的樣本驗(yàn)證。

本文中，這種PV 患者病情的減輕與傳統(tǒng)Dsg3抗體滴度降低不一致的情況在以往的研究中［13-14］并不少見，造成這種不一致性的原因有3 種，①部分患者血清中存在著非致病性的抗線性表位的Dsg3 抗體；②部分患者血清中可能存在著有致病性的AChR抗體；③部分患者血清抗Dsg3抗體亞型中，非致病性IgG1亞型比例高，從而導(dǎo)致了Dsg3抗體滴度與病情變化不一致。我們的研究中，有13例患者表現(xiàn)出了病情變化與傳統(tǒng)Dsg3抗體滴度不一致的情況，其中6例病情變化與抗構(gòu)象表位Dsg3抗體有關(guān)，5 例在活動(dòng)期可檢測(cè)到AChR 抗體，另外2 例不一致的原因不明確，可能屬于上述第3 種情況，但需要通過(guò)對(duì)抗體亞型的滴度進(jìn)行檢測(cè)以進(jìn)一步證實(shí)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突