姜懿軒 宮蘋 張亮

口腔疾病研究國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心四川大學華西口腔醫(yī)院種植科，成都 610041

超聲作為機械能量中的一種，可傳入體內(nèi)產(chǎn)生獨特的生物學效應，不同強度、頻率的超聲廣泛應用于醫(yī)學診斷與治療中。由于高強度超聲能在組織中產(chǎn)生大量熱量，可能會損傷器官、組織和細胞，低強度脈沖超聲（low-intensity pulsed ultrasound，LIPUS）一般被認為既不產(chǎn)生熱損傷也不具有破壞性[1]，在醫(yī)學各領域尤其是骨組織修復與再生領域表現(xiàn)出了一定的應用潛力。以往研究多基于LIPUS對骨折愈合的影響，近年來針對LIPUS在骨組織再生方面的研究有較大進展，如在牽張成骨、骨壞死、骨缺損修復、牙周組織再生等模型中，LIPUS也表現(xiàn)出了積極效應。

由于LIPUS以非侵入方式通過軟組織傳遞到骨骼，在此過程中各種類型的細胞相互作用并提供適當水平的生物活性分子，將機械信號轉化為生物學信號后發(fā)揮作用，因此LIPUS促進骨組織再生所涉及的分子機制較為復雜。越來越多的數(shù)據(jù)表明LIPUS不僅可能作用于成骨細胞、破骨細胞、間充質干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）等直接促進成骨，還可通過其對血管、神經(jīng)的作用對骨組織愈合與再生產(chǎn)生一定的積極影響，本文就這方面的最新研究進展作一綜述。

1 LIPUS可促進骨組織修復與再生

臨床前實驗已經(jīng)證實LIPUS參與了骨組織修復與再生過程中的一系列生物學反應，如血管生成、軟骨形成、骨重塑等[2-3]。比如，在大鼠創(chuàng)傷性椎體骨折模型中，LIPUS通過增加軟骨形成、誘導成骨細胞成骨以及H型微血管的形成，從而加速創(chuàng)傷性椎體骨折愈合[4]；通過誘導成骨和新生血管形成，LIPUS也可以促進類固醇相關骨壞死兔模型的骨組織修復再生[5]；此外，LIPUS還能促進大鼠顱骨缺損處的骨再生，這與成骨細胞增殖的顯著增加有關[6]等等。在21世紀初，LIPUS就已被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準應用于臨床治療新鮮骨折愈合和陳舊性骨不連[7]。

LIPUS不僅可單獨作用，與其他治療手段結合時可發(fā)揮更積極的影響。比如LIPUS結合多孔支架對骨再生有著更強大的促進作用，可能成為治療骨缺損的新方法[8]；LIPUS+自體濃縮骨髓移植作為一種新開發(fā)的關節(jié)保存手術，對股骨頭壞死患者具有一定安全性，并可能有效促進新骨形成[9]；LIPUS和生物可降解鎂材料骨植入物結合應用，可以極大促進植入物周圍骨再生，提高相應的骨誘導性、生物相容性和生物安全性[10]；LIPUS和引導組織再生術（guided tissue regeneration，GTR）同時應用于牙槽骨缺損處，能促進更多骨生成，因此在牙周組織修復領域具有一定的潛在應用前景，但其有效性尚需進一步的臨床試驗證實[11]。

2 LIPUS促進骨組織再生的分子機制

2.1 LIPUS與成骨細胞

多項研究數(shù)據(jù)表明，LIPUS對成骨細胞增殖、活化及礦化有積極作用，這可能是音猬因子（sonic hedgehog，SHH）信號通路上調所致，抑制SHH通路降低了成骨細胞的遷移、增殖和活化能力，并阻礙了LIPUS的治療效果[12-13]。Miyasaka等[14]發(fā)現(xiàn)，骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）信號通路作為重要的成骨相關信號通路，可被LIPUS誘導激活；當BMP信號途徑被抑制時，LIPUS則刺激Smad1磷酸化來抑制熱休克蛋白（heat-shock pro-tein，HSP）27、上調HSP90水平，引起成骨細胞活化和成骨信號轉導。LIPUS也可以作用于成熟成骨細胞，使核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL）的表達明顯升高，激活RANKL信號通路，進而激活下游趨化因子單核細胞趨化蛋白-1和巨噬細胞炎癥蛋白 1β的產(chǎn)生，調節(jié)其活化和礦化[15]。

此外，LIPUS還可通過成骨細胞膜上P2X7受體誘導三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的釋放及細胞分化，ATP作為機械刺激反應中的關鍵介質能促進骨形成。Manaka等[16]證實，這是一條獨立于堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活化信號通路以外的轉導途徑。

對于成骨前體細胞，LIPUS刺激可以令其產(chǎn)生活性氧以激活絲裂原活化蛋白激酶通路，從而導致細胞活力顯著增加[17]；另外LIPUS可以加速成骨前體細胞對鈣和磷酸鹽的攝取從而促進其礦化[18]。Tabuchi等[19]則首次證實，在小鼠成骨前體細胞中，有許多基因對LIPUS刺激有反應，比如與骨形態(tài)相關的Dmp1、Fbn1、Igf2、Lum、Mmp13和Thbs1以及參與成骨細胞發(fā)育和/或分化的Cd200、Dmp1、Igf2和Nr4a1等基因，在被LIPUS刺激后會發(fā)生上調，從而降低成骨細胞分化的Id1、Id2、Id3等相關基因，使其發(fā)生下調。上述研究結果表明，LIPUS可能通過直接調節(jié)成骨細胞基因表達，或調控不同信號通路來影響成骨相關細胞的增殖、活化及礦化，提示LIPUS的作用機制可能涉及多個信號調控網(wǎng)絡。

2.2 LIPUS與破骨細胞

破骨細胞也是骨形成過程中一種不可或缺的細胞，與成骨細胞一起共同調控骨組織代謝，在骨重建塑形過程中起重要作用。Suzuki等[20]研究了成骨細胞和破骨細胞在LIPUS刺激下的生物學行為，結果顯示，破骨細胞標志物如抗酒石酸酸性磷酸酶、組織蛋白酶K表達降低，而成骨細胞標志物如骨鈣素、Runt相關轉錄因子2（runt-related transcription factor 2，Runx2）等表達增加，破骨細胞凋亡相關基因由LIPUS處理后上調，表明LIPUS可加速破骨細胞凋亡。Hanmoto等[21]研究表明，破骨細胞內(nèi)核因子κB受體活化因子/RANKL信號通路在LIPUS刺激下被適度激活，影響破骨細胞活性進而誘導骨再生。此外，LIPUS也可能通過抑制ERK-c-Fos-NFATC1級聯(lián)信號通路，有效地抑制破骨細胞分化和破骨細胞特異性基因表達[22]。綜合近年來研究數(shù)據(jù)可見，關于LIPUS對骨組織再生影響的報道大多集中在成骨細胞的分化、增殖及基因表達調控上，對破骨細胞等其他骨相關細胞研究較少，且LIPUS作用于破骨細胞的信號轉導途徑尚未完全闡明，其后的相關研究可多關注破骨細胞對不同LIPUS治療參數(shù)（如頻率和強度）的反應以及其中潛在的細胞分子機制。

2.3 LIPUS與MSC

MSC可分化為多種細胞類型，如脂肪細胞和成骨細胞。MSC成脂和成骨向分化的嚴格控制對于骨再生至關重要[23]，機械刺激是調節(jié)MSC分化的關鍵因素之一。LIPUS作為一種物理機械刺激，可能通過降低過氧化物酶體增殖劑激活受體γ2（peroxisome proliferator activated receptor γ2，Pparg2）和脂肪酸結合蛋白4的基因表達、下調Pparg2的磷酸化水平，從而抑制MSC向脂肪細胞分化[24]；同時LIPUS促進MSC的成骨向分化，表現(xiàn)為誘導OCN、Runx2、ALP、COL1等mRNA的表達、增加細胞鈣化，這可能是通過激活RhoA/ROCK-Cot/Tpl2-MEK-ERK信號通路實現(xiàn)的[24-25]。另外He等[26]研究顯示，LIPUS可有效促進小鼠胚胎來源的MSC C3H10T1/2細胞從靜止期進入生長/分裂期，增強細胞增殖從而促進骨缺損愈合，其機制可能與Bmi-1基因表達上調有關。

對于骨髓間充質干細胞（bone mesenchymal stem cell，BMSC）來說，細胞間間隙連接在LIPUS激活BMSC的過程中具有潛在作用[27]。另一方面，BMSC的遷移能力對骨再生也至關重要。Xiao等[28]研究證實，LIPUS刺激能夠通過上調趨化因子受體CXCR4和CCR-2、上調整合素 1β來激活并改善BMSC的遷移。因此，LIPUS可能通過刺激MSC成骨向分化、增加細胞增殖并抑制其成脂向分化、活化BMSC等，發(fā)揮對骨組織修復再生的積極效應，有望成為骨組織工程的潛在輔助治療手段之一。

3 LIPUS促進血管生成與骨組織再生

血管與骨組織之間存在著密切且復雜的偶聯(lián)關系，從組織結構上看，血管與成骨相關細胞緊密分布，尤其在骨再生區(qū)域，血管生成對骨折愈合及預后十分關鍵[29-30]。Katano等[31]研究發(fā)現(xiàn)，LIPUS可促進軟骨內(nèi)成骨從而縮短骨折愈合期，這一過程血管內(nèi)皮細胞向新生骨組織處遷移，愈傷組織周圍的血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表達和微血管新生顯著增加。Cheung等[32]應用骨質疏松大鼠模型也證實了，LIPUS可以通過上調血管生成相關基因表達、增加血管生成和愈傷組織重塑，來加速骨質疏松性骨折的愈合。另一項體內(nèi)研究[33]則觀察了LIPUS在1型糖尿病大鼠股骨骨折模型中的應用效果，結果表明，LIPUS干預后的糖尿病大鼠骨折部位血管密度較正常對照大鼠及無LIPUS干預的糖尿病大鼠顯著增加，且此效應與VEGF生成的顯著增加有關。

最新一項隨機對照雙盲臨床試驗[34]表明，針對截骨術后腓骨延遲愈合的患者進行LIPUS干預，與對照組相比，LIPUS治療組患者骨愈合部位的血管體積密度顯著增加，從而增加新生骨體積。體外實驗[35-36]則證實，LIPUS刺激可引起人血管內(nèi)皮細胞中包括VEGF信號傳導和局灶性黏連途徑等1 050個基因發(fā)生改變。綜上，可以推測LIPUS不僅能通過復雜的信號分子機制作用于成骨細胞、破骨細胞、MSC等直接調控骨代謝，還可能通過局部微循環(huán)改建間接對骨組織再生產(chǎn)生積極影響，且此過程可能與VEGF及其相關信號轉導途徑相關，是否涉及其他分子機制則需深入研究。

4 LIPUS促進周圍感覺神經(jīng)再生與骨組織再生

近年來研究發(fā)現(xiàn)，周圍感覺神經(jīng)對骨再生起重要的調控作用，骨組織活力狀態(tài)與感覺神經(jīng)分布密度相關，正常生理狀態(tài)下，骨代謝活躍的區(qū)域感覺神經(jīng)分布密集，而阻斷感覺神經(jīng)支配可導致骨組織密度和形態(tài)學改變[37]，如失下牙槽神經(jīng)后可引起嚴重的下頜骨病理改變[38]。

LIPUS對感覺神經(jīng)損傷后修復再生存在一定積極影響，除可有效促進雪旺細胞增殖和軸突再髓鞘化外[39]，還可能誘導多能干細胞來源的神經(jīng)嵴干細胞向神經(jīng)細胞分化[40-41]，加速神經(jīng)修復再生。另外有研究[42]提示，LIPUS可上調周圍神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)營養(yǎng)因子-3和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的mRNA及相應基因表達，而這些因子對骨組織再生起著積極作用。

在骨代謝活躍的區(qū)域，降鈣素基因相關肽（cal-citonin gene-related peptide，CGRP）陽性感覺神經(jīng)纖維分布密度較高。Zhou等[43]報道在脊柱融合動物模型中，LIPUS促進異位成骨的同時，CGRP陽性感覺神經(jīng)纖維快速增加，提示LIPUS可能通過CGRP陽性感覺神經(jīng)支配來促進成骨。Lam等[44]報道在大鼠坐骨神經(jīng)切除后，LIPUS不能促進其脛骨骨折愈合，而神經(jīng)存在時LIPUS超聲實驗組表現(xiàn)出更快更成熟的愈合修復，表明完整的神經(jīng)分布可能在LIPUS促進骨折愈合中發(fā)揮重要作用。另有研究[38]也同樣證實，LIPUS可以顯著改善由神經(jīng)損傷導致的骨質改變，但只發(fā)生在神經(jīng)可愈合的情況下；當神經(jīng)無法愈合時，LIPUS并不能促進骨組織修復與再生。

上述研究結果提示，LIPUS具有促進神經(jīng)再生的潛力，主要表現(xiàn)為刺激雪旺細胞增殖來促進軸突再生和髓鞘化、增加感覺神經(jīng)纖維的數(shù)量和密度等來加速外周神經(jīng)損傷后修復，而完整的神經(jīng)分布在骨組織修復與再生中可能起重要作用。目前關于LIPUS在促進神經(jīng)與骨組織再生平衡中作用機制的研究尚不深入，需進一步探索挖掘，但仍為LIPUS的臨床應用提供了新的思路。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。