牛彥強(qiáng) 顏春魯,2 安方玉,2* 李盛華 張艷霞,2 趙磊 夏鵬飛 楊曉蓉 成新平 靳安順

1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000 2. 敦煌醫(yī)學(xué)與轉(zhuǎn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000 3. 甘肅省高校中(藏)藥化學(xué)與質(zhì)量研究省級重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000

膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)是一種?；加谥欣夏耆说墓顷P(guān)節(jié)病，因其病因病機(jī)的復(fù)雜性而導(dǎo)致臨床多樣性表現(xiàn), 主要臨床表現(xiàn)為膝關(guān)節(jié)持續(xù)的腫、脹、痛和行動不便，嚴(yán)重者甚至發(fā)展成關(guān)節(jié)畸形，使得中老年人生活質(zhì)量嚴(yán)重下降。該病在中醫(yī)屬于“痹癥”范疇，為骨痹[1]。近年來，隨著社會老齡化程度的不斷加重，KOA的患病率也越來越高。王斌等[2]通過Meta文獻(xiàn)分析總結(jié)發(fā)現(xiàn)，KOA的患病率為18%，其中男性患病率為11%，女性患病率為19%，且患者女性多于男性。因此，降低KOA的患病率和提高其治療效果是目前亟待解決的問題。同時，對其有利于緩解癥狀和改善功能的準(zhǔn)確治療研究和明確發(fā)病機(jī)制研究也成為國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界高度關(guān)注的熱點(diǎn)。

近年來，隨著KOA發(fā)病與基因相關(guān)性的深入研究，使從基因表達(dá)入手探索KOA的病因病機(jī)成為可能。對KOA的發(fā)病從基因多態(tài)性方面做了大量研究，發(fā)現(xiàn)有眾多基因存在異常的表達(dá)[3]。故而認(rèn)為KOA的發(fā)病可能由是異常的某種基因和(或)多種基因共同參與下通過細(xì)胞中相應(yīng)發(fā)生特異改變的信號通路和信號分子來誘導(dǎo)的[4-5]。并有研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)用中醫(yī)藥干預(yù)的KOA患者，能夠使破壞軟骨細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)及產(chǎn)生炎性因子的基因表達(dá)受到抑制，能夠促進(jìn)保護(hù)軟骨細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)及消滅炎性因子的基因表達(dá)，使癥狀得以減緩。孫志濤等[6]的研究發(fā)現(xiàn)，單味藥鹿茸通過抑制侵襲性基因ADAMTS-4的分泌而促進(jìn)保護(hù)因子TIMP-3的表達(dá)，對軟骨修復(fù)起到重要作用。因此，我們追根溯源尋找對KOA可能有影響的相應(yīng)基因，并結(jié)合中醫(yī)藥來闡明KOA的發(fā)病機(jī)制，以期得到有效的早期診斷及治療。

1 細(xì)胞因子、基質(zhì)金屬蛋白酶、聚蛋白多糖及凋亡相關(guān)基因表達(dá)對KOA的影響

膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病由于多種因素參與其中，給其病因病機(jī)的確定帶來了許多不確定因素。隨著對KOA在分子水平機(jī)制的研究，發(fā)現(xiàn)許多細(xì)胞因子、基質(zhì)蛋白在其發(fā)病者體內(nèi)表現(xiàn)出差異。有加重炎癥表現(xiàn)的促炎性因子，有破壞軟骨結(jié)構(gòu)和軟骨細(xì)胞形態(tài)與修復(fù)軟骨結(jié)構(gòu)和軟骨細(xì)胞形態(tài)的相應(yīng)基質(zhì)蛋白表達(dá)失調(diào)。這些因素出現(xiàn)的差異很可能就是由于體內(nèi)基因的變異表達(dá)，成為導(dǎo)致KOA發(fā)生與發(fā)展的關(guān)鍵因素。研究發(fā)現(xiàn)，軟骨下骨致病時就有相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控過程中發(fā)揮作用[7]，并且多個基因作用和單個基因多位點(diǎn)作用都在該病的研究中得到確認(rèn)。還有研究[8]證實(shí)，基因多態(tài)性在膝骨性關(guān)節(jié)炎中有著重要的關(guān)聯(lián)性，嚴(yán)重影響著KOA的發(fā)生與進(jìn)展。

1.1細(xì)胞因子相關(guān)基因表達(dá)對KOA的影響

白介素(IL)作為重要的炎性因子，在眾多基因多態(tài)性與KOA發(fā)病關(guān)系的研究中被發(fā)現(xiàn)，IL基因多態(tài)性與KOA易感性有著密切聯(lián)系，并且眾多亞型IL參與其中。而且還證實(shí)KOA易感性和其他相關(guān)基因多態(tài)性也存在密切聯(lián)系[9]。申成凱等[10]的研究表明，IL-1β基因多態(tài)性與晚期KOA易感性存在關(guān)聯(lián)，IL-1β基因上的-511C/T(rs16944)和+3954C/T(rs114363)與血清中的IL-1β有很強(qiáng)的相關(guān)性，其位點(diǎn)的多態(tài)性與我國漢族人的KOA相關(guān)。IL-16是一種前炎性因子，具有促進(jìn)其他白介素分泌和免疫調(diào)節(jié)的作用。Sun等[11]研究表明IL-6 位點(diǎn)上rs1800795(-174 G>C)和MMP-13位點(diǎn)上 rs2252070(-77 G>A)突變使KOA易感性增強(qiáng)、病情加重、IL-6和MMP-13表達(dá)水平上調(diào)。羅世興等[12]發(fā)現(xiàn)，漢族人群中膝骨關(guān)節(jié)炎患者與IL-16基因單核苷酸多態(tài)性具有相關(guān)性，并且發(fā)現(xiàn)其中攜帶 rs11556218 T/G和G/G、rs4072111 C/T和T/T基因型、單倍型TTT和GCC型發(fā)生KOA的風(fēng)險較其他基因型人群高，這對KOA的發(fā)病機(jī)制及診斷治療是一個新的突破。

1.2基質(zhì)金屬蛋白酶相關(guān)基因表達(dá)對KOA的影響

KOA軟骨降解的機(jī)制之一是金屬蛋白酶(MMP)對細(xì)胞外基質(zhì)的酶解。MMP-1由軟骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞產(chǎn)生，是MMPs家族的主要成員之一。Lepetsos等[13]發(fā)現(xiàn)MMP-1的1607 1G/2G (rs1799750)多態(tài)性可能與KOA發(fā)病機(jī)制有關(guān)。而金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)能夠抑制MMP的生成。Xu等[14]發(fā)現(xiàn)TIMP-2上rs4789936與KOA發(fā)病降低相關(guān)，rs7342880的等位基因“A”與KOA發(fā)病增加顯著相關(guān)，并且rs7342880與女性KOA風(fēng)險增加也密切相關(guān)。由此說明TIMP-2是中國人KOA的易感基因，是一種潛在的診斷和預(yù)防標(biāo)志物。

1.3聚蛋白多糖相關(guān)基因表達(dá)對KOA的影響

聚蛋白多糖是軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的主要組成成分，其基因表達(dá)影響著骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展。孫鹥等[15]發(fā)現(xiàn)聚蛋白多糖CS1結(jié)構(gòu)域等位基因26、27、28與骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)性最大。Morten等[16]在探討軟骨降解機(jī)制發(fā)現(xiàn)，在骨關(guān)節(jié)炎早期，由聚蛋白多糖酶介導(dǎo)了聚蛋白多糖降解，主要是通過ADAMTS-4/-5降解了聚蛋白多糖，而在骨關(guān)節(jié)炎后期，MMP介導(dǎo)了聚膠原蛋白多糖的降解[17-18]。還有研究[19-20]表明，ADAMTS-4基因敲除可以有效阻止蛋白聚糖的水解，減緩骨關(guān)節(jié)炎的退變。祁雷等[21]的研究認(rèn)為，骨關(guān)節(jié)炎早期，ADAMTS-5主要在滑膜中表達(dá)，骨關(guān)節(jié)炎中晚期 ADAMTS-5主要在關(guān)節(jié)軟骨組織中表達(dá)。Ma等[22]發(fā)現(xiàn)ADAMTS14基因多態(tài)性與KOA相關(guān)，其GG基因型增加了中國漢族人群患KOA的風(fēng)險。ADAMTS家族可能是KOA治療的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

1.4細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)對KOA的影響

細(xì)胞因子與軟骨細(xì)胞外基質(zhì)能引起關(guān)節(jié)軟骨中炎癥反應(yīng)，其激活能夠啟動細(xì)胞凋亡而造成局部組織損傷。細(xì)胞因子CCL22在炎癥中扮演著復(fù)雜的角色，Ren等[23]在研究OA大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，CCL22在凋亡軟骨細(xì)胞中表達(dá)，幾乎所有凋亡細(xì)胞中CCL22均為陽性。細(xì)胞凋亡存在于多細(xì)胞生物的整個生命活動過程之中，從未分化的間充質(zhì)細(xì)胞分化形成骨和軟骨的全過程到在生理、病理情況下軟骨、骨、關(guān)節(jié)的重塑與改建的過程中都有細(xì)胞凋亡的參與。良性的細(xì)胞凋亡是機(jī)體完成整個生命活動的必要條件之一，過度的細(xì)胞凋亡卻嚴(yán)重影響著機(jī)體的生理功能。軟骨細(xì)胞的凋亡是導(dǎo)致KOA加重的重要原因之一，引發(fā)KOA的重要因素，半月板損傷也受細(xì)胞凋亡的調(diào)控[24]。細(xì)胞凋亡存在著諸多的途徑，如受Bcl-2家族蛋白調(diào)控的線粒體途徑，有Caspases參與的一系列凋亡途徑等等[25]。同時劉發(fā)元等[26]發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與軟骨細(xì)胞凋亡存在正相關(guān)性，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時啟動PERK信號通路、激活Ca2+依賴的Caspase家族成員鈣調(diào)蛋白分解酶，進(jìn)一步激活Caspase，引發(fā)細(xì)胞凋亡發(fā)生。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵場所，其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在軟骨細(xì)胞的凋亡調(diào)控中起著重要作用。

2 基因表達(dá)對膝骨關(guān)節(jié)炎中醫(yī)體質(zhì)的影響

中醫(yī)體質(zhì)在我國有著很久的歷史，早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》就有對其詳細(xì)的描述，近年來學(xué)者又對其進(jìn)行系統(tǒng)理論研究，形成了一門新學(xué)科。中醫(yī)體質(zhì)學(xué)認(rèn)為，體質(zhì)是一種固有特質(zhì)，通過先天稟賦和后天獲得而形成，并伴隨生長、發(fā)育過程中所形成的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理功能和心理狀態(tài)方面與自然、社會環(huán)境相適應(yīng)的人體個性特征；具體表現(xiàn)如下：結(jié)構(gòu)、功能、代謝以及對外界刺激反應(yīng)等方面的個體差異性，對某些病因和疾病的易感性，以及疾病轉(zhuǎn)歸中的某種傾向性[27]。對中醫(yī)體質(zhì)與其他理論相結(jié)合的研究也層出不窮，由于中醫(yī)學(xué)中治未病思想與現(xiàn)代免疫學(xué)相符，故有人將中醫(yī)體質(zhì)應(yīng)用于免疫學(xué)的研究當(dāng)中。如陳雪梅等[28]從免疫學(xué)出發(fā)基于中醫(yī)體質(zhì)學(xué)說探討調(diào)節(jié)用藥方案，對就目前常用的中醫(yī)體質(zhì)分類法：平和質(zhì)、陽虛質(zhì)、陰虛質(zhì)、氣虛質(zhì)、痰濕質(zhì)、濕熱質(zhì)、血瘀質(zhì)、氣郁質(zhì)、特稟質(zhì)進(jìn)行中藥方藥與調(diào)體關(guān)系方面的探討，體質(zhì)偏頗與免疫失衡相結(jié)合，對疾病的用藥有了新突破。張慧明等[29]探討了衰老現(xiàn)象和中醫(yī)體質(zhì)相關(guān)性，平和質(zhì)能夠延緩衰老，偏頗質(zhì)能夠加速機(jī)能代謝，加速衰老。由于衰老過程伴隨著骨密度降低、骨質(zhì)疏松等現(xiàn)象，因此骨代謝與中醫(yī)體質(zhì)也存在著上述類似的相關(guān)性。路宗志等[30]對膝骨關(guān)節(jié)炎患者進(jìn)行中醫(yī)體質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，KOA患者的偏頗體質(zhì)主要為氣虛質(zhì)、陽虛質(zhì)和陰虛質(zhì)這3種體質(zhì)。

近年來對中醫(yī)體質(zhì)的微觀物質(zhì)基礎(chǔ)也進(jìn)行了大量的臨床研究和基礎(chǔ)研究，開始利用基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等這些新興研究方法來研究中醫(yī)體質(zhì)。研究了不同病變體質(zhì)下特征性基因差異表達(dá)的關(guān)系，建立了對疾病的微觀解釋與中醫(yī)體質(zhì)的微觀的聯(lián)系。王濟(jì)等[31]通過基因組學(xué)對中醫(yī)體質(zhì)的研究，詳細(xì)總結(jié)闡述了各體質(zhì)下特征性基因表達(dá)的差異。有研究者將膝骨關(guān)節(jié)炎、中醫(yī)體質(zhì)和基因作為研究對象，揭示了膝骨關(guān)節(jié)炎在偏頗體質(zhì)中基因表達(dá)與其發(fā)病的相關(guān)性。李盛華等[32]對陽虛質(zhì)KOA患者軟骨組織內(nèi)Sox9、Col2al基因表達(dá)水平進(jìn)行了檢測，以平和質(zhì)為對照發(fā)現(xiàn)，陽虛質(zhì)KOA體內(nèi)Sox9、Col2al基因均成高表達(dá)，提示Sox9、Col2al基因表達(dá)與陽虛質(zhì)KOA具有相關(guān)性，為膝骨關(guān)節(jié)炎在體質(zhì)和基因方面的聯(lián)系找到依據(jù)。王金[33]也對陽虛質(zhì)KOA軟骨基質(zhì)中占主要角色的膠原做了研究，以Ⅱ型膠原表達(dá)膠原基因的多態(tài)性切入，發(fā)現(xiàn)COL2A1基因rs2 276 454位點(diǎn)基因多態(tài)性與KOA發(fā)病相關(guān)，并提出其中T等位基因可能是陽虛質(zhì)KOA發(fā)病的危險因素之一?；虿町惐磉_(dá)與中醫(yī)體質(zhì)的相關(guān)性對進(jìn)一步確定KOA的病理病機(jī)提供理論基礎(chǔ)。

3 中醫(yī)藥對膝骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)基因表達(dá)的影響

中醫(yī)藥通過辨證施治和整體治療，能夠明顯緩解KOA的臨床癥狀[34]，Hou等[35]對中醫(yī)藥臨床治療KOA的相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行了系統(tǒng)回顧分析，發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥在KOA的治療中具有一定優(yōu)勢?；蛑委熢诠顷P(guān)節(jié)炎的治療中具有潛在的價值，編碼人類IL-1αR的互補(bǔ)DNA已被證明是有效的[36]。隨著現(xiàn)代中醫(yī)藥技術(shù)的發(fā)展，尋找到KOA特征性的基因表達(dá)并對其進(jìn)行靶向治療，可能會更加明顯延緩KOA癥狀，并可進(jìn)一步探討其作用機(jī)理。

3.1補(bǔ)腎中藥對膝骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)基因表達(dá)的影響

中醫(yī)認(rèn)為，腎乃先天之本，主藏精，精生髓，髓養(yǎng)骨，腎主骨生髓[37]。因此是否能夠運(yùn)用補(bǔ)腎中藥通過調(diào)控KOA相關(guān)基因表達(dá)來達(dá)到治療KOA的目的？其治療機(jī)制又是什么？ Lin等[38]研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎壯筋湯對tunicamycin刺激的軟骨細(xì)胞通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路來抑制軟骨細(xì)胞凋亡，具有有效的抗凋亡作用，從而使中藥補(bǔ)腎壯筋湯可能成為治療KOA的一種潛在藥物。透骨消痛膠囊(TGXTC)通過多種靶點(diǎn)對KOA發(fā)揮治療作用。TGXTC治療能顯著減輕軟骨損傷和軟骨下骨損傷，改善軟骨下骨小梁，并顯著減少骨保護(hù)素核因子-κβ配體/受體激活劑比例，減少IL-1β、TNF-α mRNA的表達(dá)。這些結(jié)果表明，TGXTC是通過調(diào)節(jié)骨形成和骨吸收及相關(guān)炎癥因子的分泌來調(diào)節(jié)軟骨下骨重塑，從而延緩OA的病理發(fā)展[39]。參麥注射液(SMI)已廣泛應(yīng)用于多種疾病的治療，用SMI治療KOA后，可以下調(diào)KOA的MMP- 1和MMP-13 mRNA表達(dá)和增加KOA的TIMP-1 mRNA表達(dá)，抑制iNOS和COX-2 mRNA的表達(dá)，從而促進(jìn)其對軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用。這個結(jié)果表明，SMI能抑制炎癥，改善軟骨降解，是治療KOA的另外一種有潛力和前景的中藥[40]?？梢?，補(bǔ)腎中藥可以有效治療KOA，并通過調(diào)控MMP、TIMP、IL-1β、TNF-α、iNOS和COX-2等蛋白的基因表達(dá)，達(dá)到延緩骨關(guān)節(jié)退變、減少炎癥反應(yīng)和抗氧化應(yīng)激損傷的目的。

3.2中醫(yī)藥對膝骨關(guān)節(jié)炎凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

近年來研究發(fā)現(xiàn)，軟骨細(xì)胞在骨性關(guān)節(jié)炎中呈減少的現(xiàn)象，因此過度的細(xì)胞凋亡可能是導(dǎo)致骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展的重要原因之一。細(xì)胞凋亡的發(fā)生就是凋亡信號從胞外向胞內(nèi)逐級傳遞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。雖然可以引起細(xì)胞凋亡的因素有很多，但均涉及到一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)即半胱氨酸蛋白酶(Caspase)家族的激活，探尋KOA發(fā)病密切相關(guān)的Caspase家族中成員中的激活基因和抑制基因，并通過中醫(yī)藥的干預(yù)進(jìn)一步觀察Caspase家族中成員中的激活基因和抑制基因的差異表達(dá)，對KOA的發(fā)病機(jī)制的解釋和中醫(yī)藥治療機(jī)制的解釋均具有重要意義。陳喜德等[41]研究了骨關(guān)節(jié)炎的不同患病時期與關(guān)節(jié)軟骨中Caspase-3表達(dá)的相關(guān)性，Caspase-3在骨關(guān)節(jié)炎的早、中、晚期均能調(diào)控軟骨細(xì)胞的凋亡，并且隨著病情加重，Caspase-3表達(dá)明顯增加，軟骨細(xì)胞凋亡加速。Bcl-2 和Bax也是參與細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白。在Bcl-2家族中Bcl-2屬于抗凋亡蛋白分子，Bax具有促凋亡效應(yīng)[42]。滕加文等[43]用補(bǔ)腎壯骨膠囊干預(yù)KOA模型兔的研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎壯骨膠囊能夠顯著降低KOA模型兔的細(xì)胞凋亡指數(shù)，并且上調(diào)bcl-2 mRNA的表達(dá)，抑制bax mRNA的表達(dá)，保護(hù)軟骨細(xì)胞。右歸飲溫補(bǔ)腎陽、補(bǔ)精益血，不僅能夠抵抗KOA軟骨細(xì)胞的凋亡，還能保護(hù)軟骨細(xì)胞[44]。 Tan等[45]證實(shí)溫針療法治療KOA患者的明顯效果是與治療后機(jī)體代謝相關(guān)基因及其通路的調(diào)控有關(guān)。

4 展望

由于KOA是一個多病因發(fā)病的骨關(guān)節(jié)病，臨床上目前尚缺乏治療KOA的有效治療方案和最佳的治療藥物。隨著基因組學(xué)研究的不斷發(fā)展，將其應(yīng)用于KOA病理病機(jī)的研究日益受到關(guān)注，并且運(yùn)用多途徑、多因素、多方法的研究和治療也日益受到重視。本綜述發(fā)現(xiàn)，KOA的發(fā)生發(fā)展與促進(jìn)或抑制其相關(guān)基因表達(dá)密切相關(guān)，并根據(jù)KOA的氣虛質(zhì)、陽虛質(zhì)和陰虛質(zhì)這三個中醫(yī)體質(zhì)，運(yùn)用補(bǔ)腎壯筋活血中藥及中醫(yī)療法進(jìn)行干預(yù)，可以改變IL-1β、IL-6、MMP-1、MMP-3、TIMP-2等細(xì)胞因子和基質(zhì)金屬酶相關(guān)基因及軟骨細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，來減輕癥狀，改善KOA。同時也發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥在治療KOA方面具有多途徑、多靶位調(diào)節(jié)作用。加之中藥的高效、低毒、安全等優(yōu)勢，中醫(yī)藥在KOA的病理病機(jī)探討和治療上已經(jīng)取得很大的進(jìn)步。借助基因表達(dá)譜技術(shù)探討中醫(yī)藥治療KOA的病機(jī)及其精準(zhǔn)的靶向治療將是今后研究的重點(diǎn)。