黃璟，陳強(qiáng)，倫志剛，金晶，李愛民

徐州醫(yī)科大學(xué)附屬連云港醫(yī)院神經(jīng)外科，江蘇 連云港 222002

干細(xì)胞具有自我更新和分化潛能，可以分化為不同類型的細(xì)胞。由于干細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)上具有重要的臨床應(yīng)用價值，所以近年來，臨床對干細(xì)胞的研究逐漸深入，尤其是干細(xì)胞分化方面的研究越來越被研究者重視。Rho/ROCK在胚胎干細(xì)胞分化過程中有重要作用，本文對RhoA/ROCK 信號通路對胚胎干細(xì)胞分化的影響進(jìn)行綜述，為胚胎干細(xì)胞神經(jīng)分化的進(jìn)一步研究提供參考。

1 RhoA/ROCK信號通路

1.1 RhoA 的結(jié)構(gòu)及生物學(xué)特定 RhoA 是RhoGTP 酶家族成員之一，RhoA 起著分子開關(guān)的作用，在GTP結(jié)合的活性構(gòu)象和GTP結(jié)合的非活性構(gòu)象之間循環(huán)。鳥嘌呤核苷酸交換因子(GEFs)、GTPase激活蛋白(GAP)和鳥嘌呤核苷酸解離抑制劑(GDIs)這三種蛋白質(zhì)相互作用并調(diào)節(jié)RhoA 與GDP 和GTP 結(jié)合的轉(zhuǎn)換[1]。在激活期，GEFs 促進(jìn)結(jié)合核苷酸的交換，有利于Rho 蛋白與GTP 結(jié)合形式的生成。在非激活期，GAPs刺激Rho蛋白的GTP酶活性，從而將GTP轉(zhuǎn)化 為GDP，Rho 與GDP 結(jié) 合，Rho 定 位 在 胞 漿 中。GDIs 能抑制Rho-GDP 與Rho-GTP 之間的轉(zhuǎn)化，有活性的RhoA-GTP 復(fù)合體位于細(xì)胞膜，而無活性的RhoAGDP-GDI 復(fù)合體存在于細(xì)胞內(nèi)液，這三種蛋白質(zhì)相互作用并調(diào)節(jié)兩種形式的Rho 的轉(zhuǎn)化[2]。RhoA在調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架蛋白、細(xì)胞形態(tài)和遷移以及細(xì)胞的各種增殖和轉(zhuǎn)錄活性等方面發(fā)揮多種功能。c-MYc、HIF1α/2α、Stat6、NF-κB和一些微小RNA等一些轉(zhuǎn)錄因子能調(diào)節(jié)RhoA的表達(dá)[3]。RhoA調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架動力學(xué)和基因表達(dá)，兩者都控制著干細(xì)胞的命運[4]。

1.2 ROCK 的結(jié)構(gòu)和功能 ROCK 屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，是RhoA的關(guān)鍵下游效應(yīng)器。ROCK有ROCK1 (ROCKβ)、ROCK2 (ROCKα)兩種亞型，他們功能各不相同。ROCK 由N 端激酶結(jié)構(gòu)域、Rho 蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域(rho-binding domain，RBD)、PH 結(jié)構(gòu)域(pleck strin-homology domain)和C 端的半胱氨酸富集結(jié)構(gòu)域(cysteine-rich domain，CRD)組成[5]。ROCK 與其他肌動蛋白細(xì)胞骨架激酶，如肌強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良激酶(DMPK)、肌強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良相關(guān)cdc42結(jié)合激酶(MRCK)和citron 激酶具有45%～50%的同源性。ROCK1 和ROCK2 在氨基酸序列上有65%的同源性，在激酶結(jié)構(gòu)域上有92%的同源性[6]。ROCK 通過大量下游靶蛋白的磷酸化來促進(jìn)肌動蛋白-肌球蛋白介導(dǎo)的收縮力的產(chǎn)生。ROCK 使LIM 激酶(LIM kinase，LIMK)磷酸化，增加LIMK活性，隨后促進(jìn)cofilin蛋白的磷酸化。ROCK 還直接磷酸化調(diào)節(jié)肌球蛋白輕鏈(MLC)和肌球蛋白輕鏈磷酸酶靶亞單位1(MYPT1)磷酸酶，以抑制催化活性[7]。ROCK1主要在循壞炎癥細(xì)胞中表達(dá)，而ROCK2 主要在血管平滑肌細(xì)胞中表達(dá)。在分布上，ROCK1 主要分布在肺、肝、脾、腎和睪丸，而ROCK2 主要分布在腦、肌肉和心臟[5]。ROCK是肌動蛋白細(xì)胞骨架動力學(xué)的關(guān)鍵調(diào)控因子，磷酸化多種下游靶點，并影響許多對細(xì)胞收縮性、運動性、增殖和形態(tài)非常重要的細(xì)胞內(nèi)過程，并且ROCK是平滑肌收縮、應(yīng)力纖維形成、微管動力學(xué)、中間纖維組裝和局部黏附的主要調(diào)節(jié)因子。ROCK可以通過影響細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄機(jī)制來調(diào)節(jié)基因表達(dá)，ROCK 也控制炎癥轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，包括NF-κB、IRF4、IRF7。ROCK介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)也可以促進(jìn)細(xì)胞存活[8]。

2 ESCs神經(jīng)分化的相關(guān)因子

2.1 細(xì)胞外因子 細(xì)胞外因子骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenic protein，BMP)、Wnt/β-catenin 和白血病控制因子(leukemia inhibitory factory，LIF)誘導(dǎo)的信號通路在鼠胚胎干細(xì)胞的命運決定中起重要作用[9]。BMP屬于轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor-β，TGF-β)家族成員，它們與Ⅰ型和Ⅱ型受體組成的異四聚體受體復(fù)合物結(jié)合，激活具有Smad1/5/8 和Smad4作為關(guān)鍵效應(yīng)分子的細(xì)胞內(nèi)通路[10]。在鼠ESCs 中，BMP 信號可以通過一系列下游靶點如Ⅰd 和其他基因，通過抑制分化來促進(jìn)自我更新，BMP4通過刺激雙特異性蛋白磷酸酶9 (dual specificity protein phosphatase 9，DUSP9)減弱細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)活性。ERK 已被證明是一種關(guān)鍵的ESC命運調(diào)節(jié)因子，適當(dāng)?shù)腅RK活性對于降低ESC的多能性和限制其增殖潛能具有重要意義，較高的ERK 活性可促進(jìn)其分化，而較低的ERK 活性可限制其分化，外源添加的LIF 和自分泌的FGF 信號都能激活ERK，BMP可以抵消LIF和FGF信號對ERK活性的刺激作用[11]。Noggin 可以通過干擾BMP4 與BMP受體結(jié)合抑制BMP4信號，Noggin抑制BMP4信號通過激活pax6 和磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B (protein kinase B，Akt/PKB)信號通路誘導(dǎo)神經(jīng)分化[4]。在體外，LIF通過激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子STAT3維持鼠ES細(xì)胞處于未分化期[12]。然而，單靠LIF不足以維持鼠ESC的多能性，外源性BMP和LIF信號協(xié)同維持小鼠ESC自我更新，而內(nèi)源性ERK 活性啟動分化。在無血清和無血清培養(yǎng)中，來自BMP和LIF的外部信號共同維持小鼠ESC的自我更新，而固有的ERK活性是促進(jìn)ESC分化的主要觸發(fā)因素[13]。Wnt/β-catenin 信號在ESC 中有重要作用，無wnt 信號時，細(xì)胞質(zhì)中軸蛋白(axis inhibitor，Axin)的不同區(qū)域分別與大腸腺瘤息肉蛋白(adenomatous p01yposis coli，APc)、酪蛋白激酶l (casein kinase 1，CK-1)、糖原合成激酶-3 β (glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)結(jié)合形成多蛋白降解復(fù)合物。在Wnt配體存在下，Wnts與異基因受體復(fù)合物的結(jié)合導(dǎo)致破壞復(fù)合物的抑制，從而使β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積聚。β-catenin轉(zhuǎn)運到細(xì)胞核，在細(xì)胞核中充當(dāng)T細(xì)胞因子和淋巴增強(qiáng)因子家族DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄輔助激活因子，調(diào)控下游基因的表達(dá)[14]。Wnt3a與β-catenin結(jié)合Wnt/β-catenin信號與LIF具有相似作用，其可以上調(diào)STAT3維持鼠ES細(xì)胞處于未分化期，GSK-3β作為wntβ-catenin信號通路降解復(fù)合物的重要成員，能夠磷酸化β-catenin，促進(jìn)β-catenin 的降解，GSK-3β抑制劑能夠維持ESCs的未分化表型，維持多能性轉(zhuǎn)錄因子oct3/4、Rex-1 和Nanog 的表達(dá)[15]。因此，LIF、BMP 和Wnt信號在胚胎干細(xì)胞分化過程中發(fā)揮重要作用。

2.2 細(xì)胞內(nèi)因子 細(xì)胞內(nèi)因子Oct4、Sox2、Nanog對胚胎干細(xì)胞的自我更新能力和多能性的維持有重要作用[10，16]。Sox2 屬于Sox 家族成員之一，是控制ESC 神經(jīng)分化的重要調(diào)控因子。Sox2 抑制神經(jīng)祖細(xì)胞神經(jīng)分化，并且Sox2對神經(jīng)祖細(xì)胞自我更新的維持有重要作用，Sox2 在增殖的神經(jīng)祖細(xì)胞中高度表達(dá)，并在有絲分裂后向神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞分化時下調(diào)。神經(jīng)祖細(xì)胞中Sox2 信號的抑制阻礙其自我更新和增殖，促進(jìn)其提前退出細(xì)胞周期和終末分化。因此，Sox2的下調(diào)是神經(jīng)分化的先決條件[17]。AP2、Pax6和PROX1可以激活Sox2啟動子[18]，在神經(jīng)祖細(xì)胞中，Sox2的表達(dá)受PI3K/Akt和STAT3信號調(diào)節(jié)[19-20]。Oct4也被稱為POU5F1，屬于POU 家族的轉(zhuǎn)錄因子，是ESCs多能轉(zhuǎn)錄因子中的關(guān)鍵之一。Oct4在ESCs中過表達(dá)與向原始內(nèi)胚層和中胚層分化有關(guān)，而低于正常Oct4 水平的ESCs 仍處于基態(tài)，無法向外胚層分化。研究發(fā)現(xiàn)，ESCs 中Oct4 的不同表達(dá)水平具有四種不同的作用：需要中等水平的Oct4 表達(dá)來建立多能性，低水平的Oct4表達(dá)加強(qiáng)自我更新，中等水平的Oct4表達(dá)允許分化，高水平的Oct4 表達(dá)誘導(dǎo)分化[21]。然而，Oct4 并不是唯一控制胚胎干細(xì)胞多能性的主基因，在無LIF時，Oct4本身不足以阻止小鼠ESC細(xì)胞分化，提示還需要增加新的因子。Nanog是促進(jìn)ESCs自我更新的“核心轉(zhuǎn)錄因子”，其過表達(dá)能賦予ESC細(xì)胞不依賴LIF的自我更新能力，Nanog的下調(diào)可誘導(dǎo)小鼠和人類ESCs向胚胎外系分化[22]。Nanog可能是LIF-STAT3通路維持ESCs多能性的直接下游效應(yīng)，高水平的Nanog可以繞過LIF維持小鼠ES細(xì)胞未分化狀態(tài)的。

3 Rho/ROCK信號通路在神經(jīng)分化中的作用

神經(jīng)突生長是分化神經(jīng)前體細(xì)胞(NPCs)形態(tài)極化的第一步，RhoA 和ROCK 是神經(jīng)突生長的抑制物[23]，Syx可以激活RhoA，缺少Syx可以加速ESC的神經(jīng)分化。BMP 4 和Noggin 之間的平衡決定了是保持多能狀態(tài)還是神經(jīng)分化。抑制RhoA可以增加Noggin的產(chǎn)生，同時Syx-/-的ESC 細(xì)胞中Noggin 的表達(dá)量是Syx+/+ESC 細(xì)胞的兩倍[4]，神經(jīng)分化同時受RA 的影響，Noggin 的產(chǎn)生需要RA 受體RARγ。RhoA 的效應(yīng)器rhophilin-2(Rhpn2)可以與RARγ結(jié)合，敲低Rhpn2基因可以增加Noggin 的表達(dá)。表明Rhpn2 與RARγ的結(jié)合抑制了RARγ的轉(zhuǎn)錄，RhoA 對RAR 有抑制作用。RA 可增加pSmad1 的降解和MAPK 通路的激活[24]，RhoA 可以通過激活ROCK 使Smad 磷酸化，在Syx-/-的ESCs 中有pMAPK 表達(dá)增加并且pSmad1 產(chǎn)生減少。Syx-/-細(xì)胞的低RhoA 活性增加了RA 向細(xì)胞核的穿梭，從而增加了Noggin的產(chǎn)生和神經(jīng)祖細(xì)胞標(biāo)志物Pax6和其他標(biāo)志物的轉(zhuǎn)錄[25]。

ROCK 抑制劑可以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞[26]、脂肪干細(xì)胞[27]、胚胎干細(xì)胞[28]分化為神經(jīng)元。ROCK 抑制劑Y-27632可以促進(jìn)ESC向神經(jīng)元分化[29]。ERK信號通路在NGF 刺激ESC 神經(jīng)分化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要的作用，Ras-Raf-MEK-ERK信號通路是影響細(xì)胞增殖、存活和分化的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)[30]。ROCK 抑制劑可以通過激活ERK促進(jìn)ESC向神經(jīng)元分化，此外PI3K 抑制劑和PKC 抑制劑阻斷ROCK 抑制劑對ESC向神經(jīng)分化的促進(jìn)作用。已知PI3K 與Cdc42 和Rac的GTP 結(jié)合形式結(jié)合。因此，PI3K 可能是Cdc42/Rac的下游效應(yīng)體，PI3K 可與信號蛋白形成復(fù)合物，直接調(diào)控Ras/Raf/ERK 信號通路各組分的活性。Rac 和Raf 信號可能協(xié)同促 進(jìn)MEK 和ERK 的激活[29]。雞背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)條件培養(yǎng)基可以促進(jìn)ESC分化為神經(jīng)元，此外DRG條件培養(yǎng)基中包含BDNF。在一項研究中報道，聯(lián)合ROCK 抑制劑Y-27632 以及DRG-CM 對ES 細(xì)胞的神經(jīng)元分化的促進(jìn)有協(xié)同作用[31]，抑制ROCK 可通過PI3K 和ERK 信號促進(jìn)ESCs神經(jīng)分化。

4 展望

RhoA/ROCK 信號通路在胚胎干細(xì)胞分化中起重要作用，ESCs多能性的維持和分化是由一個復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)鎖共同組成，其發(fā)揮作用的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。在胚胎干細(xì)胞神經(jīng)分化過程中，RhoA/ROCK信號通路與其他與胚胎干細(xì)胞的相關(guān)信號通路的作用，聯(lián)合抑制RhoA/ROCK 信號通路與激活一條或多條其他與胚胎干細(xì)胞神經(jīng)分化相關(guān)信號通路能否提高胚胎干細(xì)胞神經(jīng)分化效率，都是未來的研究方向。