時(shí)志琪 連凱琪 林正丹 馬園園

（安陽(yáng)工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院/河南省動(dòng)物疫病防控與營(yíng)養(yǎng)免疫院士工作站/河南省獸用生物制品研發(fā)與應(yīng)用國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室 455000）

抗菌肽是機(jī)體內(nèi)抵御體外病原感染時(shí)生成的一類小分子物質(zhì)，構(gòu)成生物體內(nèi)的天然保護(hù)屏障，可以通過直接殺傷病原微生物或通過調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫系統(tǒng)抵御入侵，對(duì)多種病原微生物具有抑制作用，如病毒、真菌、細(xì)菌、寄生蟲等，也能殺死變異的腫瘤細(xì)胞等[1]?？咕牡膩碓词謴V泛，包括昆蟲、哺乳動(dòng)物、兩棲動(dòng)物、魚類、軟體動(dòng)物和甲殼類動(dòng)物及植物等[2]。近些年，抗生素不科學(xué)地使用造成了很多嚴(yán)重的問題，尋找抗生素替代品迫在眉睫。因抗菌肽的抗菌譜廣、種類多、抗菌機(jī)理獨(dú)特、不容易產(chǎn)生耐藥性，通常被認(rèn)為是很具應(yīng)用前景的抗生素替代品[3]。本文基于前人的研究，對(duì)抗菌肽殺菌效果、最小抑菌濃度、殺菌動(dòng)力學(xué)曲線及殺菌機(jī)制的研究方法展開綜述，為以后抗菌肽的研究做鋪墊。

1 抗菌肽抑菌效果研究方法

1.1 濾紙片法

濾紙片法是做細(xì)菌藥敏試驗(yàn)的常用方法，研究者借鑒該方法對(duì)抗菌肽的抑菌效果進(jìn)行研究。潘曉倩等[4]用濾紙片法研究不同濃度抗菌肽Nisin 對(duì)3 種不同細(xì)菌的抑菌效果。濾紙片法操作簡(jiǎn)單，結(jié)果直觀，但無法控制濾紙片對(duì)抗菌肽的吸附量（即無法做到對(duì)實(shí)驗(yàn)的定量），重復(fù)性較差。

1.2 牛津杯法

牛津杯法是國(guó)內(nèi)外測(cè)定抗菌肽效價(jià)的通用方法，但若是使用方法或者操作不當(dāng)，容易出現(xiàn)抑菌圈不明顯甚至無抑菌圈等現(xiàn)象。潘曉倩等[4]利用牛津杯法對(duì)抗菌肽Nisin 對(duì)不同細(xì)菌的抑菌活力進(jìn)行測(cè)定。此法可以做到對(duì)加入的抗菌肽定量，但需要的劑量較大，且操作較為復(fù)雜，在放置牛津杯時(shí)力度不易掌控，容易滑動(dòng)甚至倒翻，需要操作者有嫻熟的操作技巧和經(jīng)驗(yàn)。

1.3 打孔法

殺菌效果的研究方法中打孔法較為常用。該法操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，且可以做到定量，對(duì)操作者的要求也相對(duì)較低，是殺菌效果研究方法中較為理想的一種，因此，在抗菌肽抑菌效果研究中經(jīng)常被使用。王利鋒等[5]曾用打孔法研究大鯢皮膚分泌液中抗菌肽對(duì)不同細(xì)菌的抑菌效果。

1.4 活菌計(jì)數(shù)法

活菌計(jì)數(shù)法是取一定量經(jīng)抗菌肽處理后的菌液進(jìn)行涂板，培養(yǎng)一定時(shí)間后記錄平板上的活菌數(shù)量。姜太玲等[6]用活菌計(jì)數(shù)法研究花椒籽蛋白抗菌肽的抑菌效果。這一方法最大的不足之處就是工作量較大，每一個(gè)濃度的涂板至少要重復(fù)3 次。但其操作簡(jiǎn)單，結(jié)果直觀準(zhǔn)確，可以很好地判斷抗菌肽的殺菌效果。

2 抗菌肽最小抑菌濃度檢測(cè)方法

2.1 刃天青顯色法

利用刃天青具有氧化還原這一特性，對(duì)抗菌肽的最小抑菌濃度進(jìn)行測(cè)定。即將刃天青加入無菌液體中呈原本的藍(lán)色，加入有菌的液體中會(huì)變色呈紅色。鐘亨任[7]利用刃天青顯色法鑒定了抗菌肽Brevinin-GR23 對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度。利用該方法鑒定最小抑菌濃度時(shí)，可以在培養(yǎng)結(jié)束后先目測(cè)渾濁度，對(duì)其抑菌效果進(jìn)行初步判斷，然后再加刃天青顯色，使結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。但操作一定要十分嚴(yán)謹(jǐn)，做到完全定量，否則容易出現(xiàn)重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果不一致的問題。

2.2 測(cè)吸光度法

抗菌肽的最小抑菌濃度也可以通過測(cè)吸光度來判斷，鐘亨任[7]在做刃天青的同時(shí)也測(cè)了吸光值。其結(jié)果與刃天青顯色法結(jié)果一致。但影響吸光值的因素有很多，這些因素會(huì)造成結(jié)果不準(zhǔn)確，因此，該方法判定最小抑菌濃度的可信度較低，僅可作為參考。

3 殺菌動(dòng)力學(xué)曲線研究方法

3.1 測(cè)OD 值法

對(duì)抗菌肽殺菌動(dòng)力學(xué)曲線的研究，趙雪芹[8]曾采用測(cè)OD值法，研究沙門氏菌經(jīng)不同濃度抗菌肽處理后，在不同培養(yǎng)時(shí)間下的存活量，結(jié)果顯示，該抗菌肽對(duì)沙門氏菌有很好的殺菌效果，且呈劑量依賴性。該方法操作簡(jiǎn)單，工作量小，耗時(shí)短，但影響OD 值的因素較多，得出的數(shù)據(jù)誤差較大，可靠性低。

3.2 平板計(jì)數(shù)法

張煒[9]等采用平板計(jì)數(shù)法研究抗菌肽對(duì)大腸桿菌的殺菌動(dòng)力學(xué)曲線，結(jié)果表明該，抗菌肽對(duì)大腸桿菌有明顯的抑制作用，可以很好地殺死大腸桿菌，且呈時(shí)間依賴性。在利用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定抗菌肽的殺菌動(dòng)力學(xué)曲線時(shí)，每一個(gè)濃度涂板至少需要重復(fù)3 次，工作量大大增加。與測(cè)OD 值法相比，雖然平板計(jì)數(shù)的工作量較大，但其結(jié)果更直觀、更準(zhǔn)確。

4 抗菌肽抑菌機(jī)制的研究方法

抗菌肽的抑菌機(jī)制有很多，可通過改變細(xì)胞膜的通透性，破壞細(xì)胞膜的完整性；與DNA 作用，影響蛋白質(zhì)的合成等來達(dá)到抑菌作用。研究者通過熒光染色、電鏡觀察、凝膠阻滯電泳等方法對(duì)抗菌肽的抑菌機(jī)制進(jìn)行研究。

4.1 熒光染色法

抗菌肽可以增加細(xì)胞膜的通透性，使細(xì)胞膜的完整性受損而達(dá)到殺菌作用。碘化丙啶（PI）作為一種熒光顯色劑，可以穿過破損的細(xì)胞膜對(duì)細(xì)菌染色。Qinghua Zhang 等[10]通過測(cè)定細(xì)菌對(duì)PI 的吸收來確定細(xì)菌膜通透性的改變。該方法比較直觀生動(dòng)地反應(yīng)細(xì)胞膜通透性的變化，在研究抗菌肽對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜的研究中經(jīng)常被采用。

4.2 電鏡觀察法

用電子顯微鏡觀察經(jīng)抗菌肽處理的細(xì)菌能直觀地看出抗菌肽對(duì)細(xì)菌形態(tài)結(jié)構(gòu)的作用。謝海偉等[11]使用電鏡觀察合成抗菌肽對(duì)大腸桿菌F41 的作用，結(jié)果顯示，細(xì)菌細(xì)胞的形態(tài)產(chǎn)生了很明顯的變化；馮興軍等[12]通過透射電鏡觀察經(jīng)鴨抗菌肽處理后的大腸桿菌的結(jié)構(gòu)形態(tài)。該方法最直接顯示抗菌肽對(duì)細(xì)胞的殺傷效果，通常作為抗菌肽殺菌的重要數(shù)據(jù)，但需要較高的試驗(yàn)儀器，透射電鏡和掃描電鏡。

4.3 凝膠阻滯電泳法

抗菌肽還可以通過與DNA 的作用來發(fā)揮其抑菌效果。裴志花[13]檢測(cè)家蠅抗菌肽MDAP-2 與DNA 的結(jié)合能力。吳希[14]研究表明，抗菌肽能與真菌的DNA 和RNA 結(jié)合。該方法也是研究抗菌肽抑制細(xì)菌的一種分子檢測(cè)方法，通常被作為實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)抗菌肽是否作用于細(xì)菌DNA 的檢測(cè)手段。

5 小結(jié)

隨著抗生素耐藥菌株的出現(xiàn)及對(duì)環(huán)境污染的日益嚴(yán)重，學(xué)者們?cè)絹碓街匾暱咕姆矫娴难芯?。抗菌肽抑菌效果和抑菌機(jī)制的研究方法很多，筆者在抗菌肽現(xiàn)有研究方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行歸納總結(jié)，比較研究了抗菌肽抑菌作用更合適的方法。本文簡(jiǎn)要概述抗菌肽殺菌效果、最小抑菌濃度、殺菌動(dòng)力學(xué)曲線及殺菌機(jī)制的研究方法，通過比較前人研究基礎(chǔ)推測(cè)，殺菌效果的研究方法中打孔法最優(yōu)；MIC 測(cè)定最優(yōu)方法為刃天青顯色法，而殺菌動(dòng)力學(xué)曲線使用平板計(jì)數(shù)法最為準(zhǔn)確；對(duì)于殺菌機(jī)制的研究，不同的殺菌機(jī)制需要不同的研究方法。當(dāng)然，隨著不斷地探索和科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，也許會(huì)有更好的研究方法可以更全面、深入地研究抗菌肽。