孫夢雪 張淑萍 郭延敏 張世超 王思琪 毛亞娟 姜莉莉*

（1，菏澤學(xué)院藥學(xué)院 274015；2，菏澤市食品藥品檢驗(yàn)檢測研究院 274000）

膜聯(lián)蛋白A2 （ANXA2）是一種鈣和脂結(jié)合蛋白，以鈣依賴的方式結(jié)合磷脂和細(xì)胞骨架，可參與細(xì)胞分化，囊泡運(yùn)輸，胞膜運(yùn)動等多種生理過程[1]。ANXA2 可與多種病毒的蛋白發(fā)生相互作用，影響病毒的組裝、釋放，對病毒增殖產(chǎn)生影響[2,3]。ANXA2 可作為HIV-1 感染的輔助因子，協(xié)助HIV-1 進(jìn)入巨噬細(xì)胞；同時(shí)，ANXA2 還可作為HIV-1 Gag 蛋白的結(jié)合蛋白以及定位在內(nèi)涵體膜上的Gag 蛋白積累輔助因子，對HIV 的正確組裝至關(guān)重要[3]。Anx2 通過與胞膜上的HIV-1Gag 相互作用，在HIV-1 復(fù)制的后期發(fā)揮作用[2]。近幾年研究表明ANXA2 能與病毒蛋白相互作用，影響病毒復(fù)制。雞ANXA2 與禽流感病毒的NS1 蛋白相互作用，抑制宿主細(xì)胞凋亡，促進(jìn)病毒增殖[4]，ANXA2 與H5N1高致病性禽流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1 相互作用，促進(jìn)病毒的復(fù)制[5]。ANXA2 可與豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（PRRSV）Nsp9 蛋白和波形蛋白相互作用，促進(jìn)病毒復(fù)制[6,7]。AxnA2 的c 端結(jié)構(gòu)域通過與牛流行熱病毒(BEFV) 基質(zhì)蛋白M 相互作用，介導(dǎo)M 蛋白在質(zhì)膜上的定位，影響B(tài)EFV 復(fù)制[7]。本研究克隆雞ANXA2 基因，并對其進(jìn)行序列分析，為進(jìn)一步對雞ANXA2 基因功能及深入了解其抗病毒機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 引物設(shè)計(jì)

參考ncbi 中已發(fā)表的雞ANXA2 基因序列 （登錄號:NM_205351.1），設(shè)計(jì)ANXA2 基因擴(kuò)增引物FA/RA，F(xiàn)A：5' -TGCCAACATGTCTACTGTC-3'；RA：5' -TCACAGCTTTCAGT CCTCTC-3'，引物由華大基因公司合成。

1.2 ANXA2 基因PCR 擴(kuò)增

Trizol 法提取健康蘆花雞肝臟組織RNA 并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以提取的cDNA 為模板，用引物FA/RA 擴(kuò)增ANXA2 基因。PCR 反應(yīng)體系50μL:2×Taq PCR MasterMix 25μL，cDNA 模板1μL，上下游引物各2μL，ddH2O 20μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，共35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，膠回收產(chǎn)物送華大基因公司進(jìn)行序列測定。

1.3 ANXA2 編碼氨基酸序列理化特性分析

使用在線工具ProtParam 分析ANXA2 編碼氨基酸理化特性。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 ANXA2 基因PCR 擴(kuò)增

ANXA2 基因PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如附圖所示，目的基因片段大約1000bp 左右，與預(yù)期結(jié)果一致。

附圖 ANXA2 基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果

2.2 ANXA2 基因核苷酸序列分析

膠回收產(chǎn)物測序結(jié)果表明，擴(kuò)增片段全長1036bp，用DNA Star 軟件分析蘆花雞ANXA2 基因的核苷酸序列，結(jié)果表明，ANXA2 基因的CDs 區(qū)全長1020bp，理論分子質(zhì)量為38.64KD，A （31.67%）、G （24.80%）、T （23.63%）、C（19.90%），（G+C）%為44.71%。

2.3 ANXA2 編碼氨基酸序列理化特性分析

使用在線工具ProtParam 對ANXA2 的編碼氨基酸序列分析，結(jié)果表明，ANXA2 分子式為C1701H2748N466O529S14，編碼氨基酸中Ala (A) 數(shù)目最多，占總氨基酸數(shù)目的7.4%，N末端編碼氨基酸是Ala (A)，該蛋白不含Trp 殘基。整條肽鏈中疏水氨基酸的數(shù)目為109。該蛋白在哺乳動物網(wǎng)狀細(xì)胞中半衰期為4.4h，在酵母菌中理論半衰期＞20h，在大腸桿菌中理論半衰期＞10h。該蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為43.36，提示該蛋白為不穩(wěn)定蛋白。脂肪系數(shù)為31.67，整條肽鏈中氨基酸親水性的平均值為-0.502。

3 討論

ANXA2 是一種鈣依賴的膜結(jié)合蛋白，可以聚集含有磷脂的脂質(zhì)筏，具有相當(dāng)廣泛地組織分布性，可存在于上皮細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，單核細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞等多種真核細(xì)胞的表面。在巨噬細(xì)胞中高水平表達(dá)，在T 淋巴細(xì)胞或293T 細(xì)胞系中不表達(dá)[2]。膜聯(lián)單白可由單體和異源四聚體兩種不同的形式存在[8]；單體主要在細(xì)胞質(zhì)中，參與細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器膜的組裝、溶解和修復(fù)等一系列工作，異源四聚體主要分布在細(xì)胞膜的表面，由兩分子的ANXA2 和A2t 組成，ANXA2 主要參與信號傳導(dǎo)和鈣離子通道的形成，調(diào)控炎癥反應(yīng)，細(xì)胞分化，囊泡運(yùn)輸，胞膜運(yùn)動，細(xì)胞骨架間蛋白間的相互作用等多種生理生化過程。人ANXA2 與惡性腫瘤的存在有密切聯(lián)系，對疾病發(fā)病機(jī)理研究有重要意義。有研究表明，ANXA2 作為J 亞群禽白血病病毒（ALV-J）的受體結(jié)合蛋白，顯著抑制ALV-J 感染和復(fù)制[9]。ANXA2 作為一種新的抗病毒生物標(biāo)志物，提示其可作為分子靶標(biāo)，進(jìn)行疾病早期診斷。研究結(jié)果為進(jìn)一步對雞ANXA2基因功能及深入研究其抗病毒機(jī)制奠定基礎(chǔ)。