張維誼，姚佳玲，周珂珂，周勇志，陸金苗，陳兆國，龔海燕

（1.上海市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心 200335；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241）

在我們的生活環(huán)境中，除了夏天隨處可見的蚊子之外，還有一種隱秘存在的外部吸血寄生蟲-蜱。我國的蜱有2科、10屬，117種[1]，分布于全國各地，從北端的哈爾濱到南方的海南島，從西部西藏到東部上海，且隨著地域的變化，生存的優(yōu)勢蜱種也存在差異[2-3]。蜱不僅大量吸血，還會傳播多種病原，包括83種病毒（森林腦炎病毒、布尼亞病毒等）、14種細(xì)菌（布魯氏桿菌等）、20種立克次體、18種螺旋體（引起萊姆病）、32種原蟲（巴貝斯蟲等）、1種衣原體、1 種支原體、1種巴爾通氏體和2種線蟲[4]。2010年，河南省信陽市境內(nèi)發(fā)生多起蜱叮咬人致死事件，疑似為感染無形體或者布尼亞病毒而死[5]。此外，2018年以來，我國豬場大面積爆發(fā)非洲豬瘟（african swine fever，ASF），軟蜱則具有保存病毒的作用[6]。最近，報道的蜱傳新病原阿龍山病毒更是引起了人們的廣泛關(guān)注[7]。劉琴等[8]在上海嘉定、閔行、浦東、松江、黃浦、金山6個區(qū)的犬體表捕獲了300多只蜱，經(jīng)鑒定優(yōu)勢蜱種為血紅扇頭蜱。劉洪霞等[9]采集上海2015～2016年犬、羊體表蜱，發(fā)現(xiàn)血紅扇頭蜱和長角血蜱為上海優(yōu)勢蜱種。但是，兩則報道均未對蜱攜帶病原進(jìn)行分析。為了進(jìn)一步明確上海警犬體表的蜱所攜帶的潛在病原或者微生物，我們對警犬體表收集的蜱進(jìn)行了蜱種鑒定和高通量測序，以此明確蜱攜帶的微生物對動物或者人類可能帶來的威脅，并為蜱傳病的防控提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 蜱的收集與預(yù)處理檢查警犬耳朵、腹股溝、前后腿內(nèi)側(cè)、背部、頸部等部位，發(fā)現(xiàn)蜱后，用鑷子緊夾蜱的假頭基，順著蜱尾部對應(yīng)的方向拽下。為了減少蜱體表微生物的污染，在實驗室用75%酒精漂洗3次，然后用ddH2O漂洗3次后，保存于-80℃，待用。

1.2 蜱的形態(tài)學(xué)觀察在體視顯微鏡（Nikon SMZ25）下，觀察每只雄蜱和雌蜱的形態(tài)，重點是假頭、肛側(cè)板、副肛側(cè)板和盾板等，由此確定蜱的種屬。

1.3 蜱種的分子生物學(xué)鑒定將收集并清洗的雌蜱和雄蜱各10只以上分別放在兩只消毒滅菌的研缽中，放入液氮，研磨充分以形成雌蜱和雄蜱兩個樣本池，然后用PBS反復(fù)清洗，收集洗下來的混合物，10 000×g離心10 min，收集上清保存于-80℃用于后續(xù)病毒組研究。沉淀物采用DNA快速抽提試劑盒（FastDNATMSPIN extraction kits，MP，上海）抽提DNA，并通過0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量，同時采用紫外分光光度計對DNA進(jìn)行定量。然后根據(jù)文獻(xiàn)[10]提供的針對細(xì)胞色素c氧化酶亞單位I（COXI）基因設(shè)計的引物（表1），在50 μL反應(yīng)體系（10×ExTaq反應(yīng)緩沖液5 μL、dNTP 4 μL、ExTaq酶 0.4 μL、10 μmol/L上游引物 2 μL、10 μmol/L下游引物2 μL、DNA模板 1 μL、ddH2O 35.6 μL）中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，35個循環(huán)（94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min），72℃延長7 min。用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）純化DNA片段，送到Invitrogen公司進(jìn)行測序，測序后的序列在國際NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行核酸序列的比對（Blast），并用MEGA6.0構(gòu)建進(jìn)化樹，以明確此蜱種與其他地區(qū)獲取的蜱的親緣關(guān)系。

1.4 蜱攜帶原蟲的檢測為了檢測蜱所攜帶的原蟲，以蜱DNA為模板，擴(kuò)增巴貝斯蟲的引物為Bab1-F/Bab1-R和Bab2-F/Bab2-R，擴(kuò)增泰勒蟲引物為BT1-F/BTH1-R和BT1-F/BT1-R，均采用套式PCR，引物序列見表1。反應(yīng)體系：rTaq酶25 μL，上游引物3 μL，下游引物3 μL，ddH2O 17 μL，DNA模板2 μL。巴貝斯蟲PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，35個循環(huán)（94℃變性45 s，56℃退火35 s，72℃延伸1 min），72℃延長15 min。泰勒蟲第一輪PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性10 min，30個循環(huán)（95℃變性45 s，65℃退火加延伸90 s），72℃延長10 min；第二輪PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性10 min，30個循環(huán)（95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s），72℃延長10 min。

表1 套式PCR引物序列Table 1 Primers used in nested PCR

1.5 蜱攜帶微生物的檢測根據(jù)文獻(xiàn)[11]中提供的引物，對應(yīng)細(xì)菌的16S V3-4區(qū)（338F：5'-ACTCCTAC GGGAGGCAGCA-3'，806R：5'-GGACTACHVGG GTWTCTAAT-3'）進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增體系（25 μL）：5×reaction buffer 5 μL，5×GC buffer 5 μL，dNTP（2.5 mmol/L） 2 μL，上游引物（10 μmol/L）1 μL，下游引物（10 μmol/L）1 μL，DNA 模板 2 μL，ddH2O 8.75 μL，Q5 DNA Polymerase 0.25 μL。擴(kuò)增參數(shù)：98℃預(yù)變性 2 min，30個循環(huán)（98℃變性15 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s），最后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，其中的500 bp左右的條帶經(jīng)凝膠回收試劑盒（AXYGEN公司）純化回收，并用TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit構(gòu)建測序文庫（Illumina公司）。文庫經(jīng)質(zhì)檢和定量后，在MiSeq測序儀上進(jìn)行高通量測序。測序和分析在上海派生諾生物科技股份有限公司完成。

1.6 數(shù)據(jù)分析測序數(shù)據(jù)經(jīng)初步篩查，并用QIIME軟件識別和剔除疑問序列和嵌合體序列。此后，將序列進(jìn)行OTU（可操作分類單元）歸并劃分，每個OTU的代表序列用于分類地位鑒定以及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析。根據(jù)OTU在不同樣本中的豐度分布，評估每個樣本的多樣性水平。

2 結(jié)果

2.1 蜱的種屬鑒定警犬體表獲得的雄蜱，顯微鏡下可明顯地觀察到雄蜱假頭基呈六邊形，有明顯的肛側(cè)板。雌蜱在顯微鏡下同樣可觀察到其假頭基呈六邊形。兩者均有扇頭蜱的典型特征[12]，因此定義為扇頭蜱屬（圖1）。通過PCR擴(kuò)增，在雌、雄蜱DNA中均可擴(kuò)增得到720 bp的條帶（圖2），與預(yù)測結(jié)果一致，進(jìn)一步測序發(fā)現(xiàn)這與血紅扇頭蜱（Rhipicephalus sanguineus）的COXI序列一致。經(jīng)MEGA6分析，其序列與此前上海報道的血紅扇頭蜱序列100%同源，與其他來源的廣西株親緣關(guān)系最近（圖3）。

圖1 雄蜱和雌蜱的形態(tài)學(xué)觀察Fig.1 Morphology of male and female ticks

圖2 PCR擴(kuò)增COXI結(jié)果Fig.2 PCR amplification of COXI gene

圖3 上海警犬寄生蜱的COXI序列的進(jìn)化樹分析Fig.3 Phylogenetic tree constructed according to the COXI sequences from the ticks fed on police dogs

2.2 蜱攜帶原蟲的鑒定經(jīng)巴貝斯蟲套式PCR引物擴(kuò)增，上海警犬寄生雌蜱DNA中得到1672 bp的產(chǎn)物，測序結(jié)果為犬巴貝斯蟲（Babesia canis，圖4A），而雄蜱泳道上的擴(kuò)增條帶經(jīng)測序證明非巴貝斯蟲DNA序列，表明未攜帶巴貝斯蟲。經(jīng)泰勒蟲套式PCR擴(kuò)增，得到410 bp的條帶，測序仍然表明為巴貝斯蟲序列，而雄蜱擴(kuò)增片段則為未知的真核生物DNA序列，因此表明未攜帶泰勒蟲。

圖4 蜱體內(nèi)巴貝斯蟲(A)和泰勒蟲(B)的檢測Fig.4 Investigation of Babesia(A) and Theileria(B) in ticks

2.3 蜱攜帶微生物的分析與比較經(jīng)剔除疑問序列后，雌雄蜱分別檢出42 936和43 006個reads。根據(jù)OTU劃分和分類地位鑒定結(jié)果，可以獲得蜱樣本在各分類水平的具體組成。上海警犬體表蜱攜帶微生物總體情況，見表2。圖5顯示了雌雄蜱體內(nèi)微生物組成比例。蜱常見攜帶病原中，雌、雄蜱攜帶柯克斯體屬（Coxiella）分別占比2.9%、0.4%，而布魯氏桿菌屬（Brucella）在雌蜱和雄蜱攜帶微生物中分別占比1.0%、3.1%。其他常見病原微生物，立克次體（Rickettsia）、螺旋體屬（Spiroplasma）等在上海蜱中未檢出。

表2 上海警犬寄生蜱攜帶微生物種類Table 2 Species of microorganisms carried by ticks from Shanghai police dogs

3 討論

在本研究中，我們第一次對上海警犬體表寄生蜱攜帶的原蟲及微生物進(jìn)行了檢測。經(jīng)鑒定，上海某警犬基地的犬?dāng)y帶蜱為血紅扇頭蜱，這與之前報道的上海的優(yōu)勢蜱種一致[5]，也與2004年[13]及2008年[14]警犬體表蜱的調(diào)查結(jié)果相同。

經(jīng)PCR擴(kuò)增測序，發(fā)現(xiàn)犬體表的雌蜱攜帶犬巴貝斯蟲，但是雄蜱則未檢測到，此暗示了犬血液中有巴貝斯蟲感染，但需要對犬血液進(jìn)行血清學(xué)調(diào)查進(jìn)一步確認(rèn)。此外，雌蜱帶巴貝斯蟲而雄蜱不帶的原因，可能是與吸血過程中雌蜱吸血量較雄蜱多有關(guān)。王望寶等[15]于2007年～2011年間采集了多個警犬技術(shù)工作單位的犬體表蜱，進(jìn)行蜱種鑒定和流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)警犬感染蜱的情況在18個省、4個自治區(qū)、2個直轄市普遍存在，其中8個單位蜱體內(nèi)檢測到韋氏巴貝斯蟲（Babesia vogeli）。王華素等[16]于廣西南寧某警犬養(yǎng)殖訓(xùn)練基地采集的警犬體表蜱均為血紅扇頭蜱，并在蜱體內(nèi)擴(kuò)增到田鼠巴貝蟲（Babesia microti），陽性率為27.8%（5/18）。由此表明，巴貝斯蟲在警犬體表蜱中具有較高的感染率，需要對警犬體表的蜱進(jìn)行巴貝斯蟲感染監(jiān)測。

上海蜱攜帶的病原微生物種類相對較少。其中，柯克斯體是引起人獸共患自然疫源性疾病-Q熱的主要病原，可由攜帶病原的扇頭蜱屬、血蜱屬等叮咬傳播從而引發(fā)疾病，病程急，有高熱，頭痛，肌肉酸痛[1]等癥狀。在上海采集的雌蜱體內(nèi)，柯克斯體占總微生物含量的2.9%，且比雄蜱含量高，可見此病原經(jīng)雌蜱傳播的可能性更大。除了柯克斯體之外，在雌雄蜱中，均檢出布魯氏桿菌屬（Brucella）。早期，在南匯牧羊犬中發(fā)現(xiàn)了布魯氏桿菌[17]，實驗用比格犬中陽性率23.4%[18]，家養(yǎng)犬陽性率為10.5%[19]。此研究則通過蜱的攜帶狀況間接反應(yīng)了警犬感染布魯氏桿菌病的狀況。其他常見蜱傳病，如引起人萊姆病的伯氏疏螺旋體（Borrelia burgdorferi）、引發(fā)人粒細(xì)胞無形體病的無形體（Anaplasma）以及引起人埃立克體病的埃立克體（Ehrlichia）[1]均未被檢測到，但是柯克斯體和布魯氏桿菌的出現(xiàn)應(yīng)該引起相關(guān)部門足夠警惕。

圖5 蜱攜帶微生物所占比例與比較分析圖Fig. 5 Comparation and the composition of microbial community in ticks