任博雯，劉 琰，劉曉雷，白 雪，丁 靜，張勝蘭，劉明遠(yuǎn)

（吉林大學(xué)人獸共患病研究所 人獸共患病研究教育部重點實驗室，長春 130062）

旋毛蟲?。═richinellosis）是由旋毛蟲（Trichinella spiralis）引起的一種危害嚴(yán)重的食源性人獸共患寄生蟲病[1]，可在包括人類在內(nèi)的多種哺乳動物之間廣泛傳播，嚴(yán)重時可以導(dǎo)致患者死亡[2]。旋毛蟲病不僅對人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅，而且給養(yǎng)殖業(yè)和肉類出口也造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，研發(fā)一種簡單、便捷、快速、特異性高的旋毛蟲病檢測方法，對保障人民身體健康、國際肉類貿(mào)易和降低畜牧業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失有重要意義。ELISA檢測法是國際獸醫(yī)局（office international des epizooties，OIE）目前唯一推薦使用的、針對旋毛蟲感染的血清學(xué)檢測方法[3]。該方法的靈敏性及特異性主要取決于診斷抗原，因此找到優(yōu)質(zhì)抗原是ELISA檢測旋毛蟲感染的關(guān)鍵。

旋毛蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑可以通過其獨特的酶抑制活性，來抵抗宿主腸道消化酶對蟲體的損傷，進(jìn)而使其成功寄生在宿主體內(nèi)。血吸蟲的絲氨酸蛋白酶抑制劑可以與凝血因子結(jié)合，抑制宿主的血液凝固，有利于血吸蟲在宿主體內(nèi)攝取營養(yǎng)[4]。除此之外，絲氨酸蛋白酶抑制劑還具有調(diào)節(jié)宿主對旋毛蟲的免疫應(yīng)答和炎性反應(yīng)等作用[5]，但是關(guān)于旋毛蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑的免疫保護(hù)性分析未見系統(tǒng)的研究。本實驗室前期對旋毛蟲不同發(fā)育時期cDNA表達(dá)文庫進(jìn)行免疫學(xué)篩選，獲得了肌幼蟲時期的高豐度強反應(yīng)原性抗原rTs-serpin（GenBank登錄號：DQ864973.2）并構(gòu)建了原核表達(dá)載體[6]，本研究中我們對該重組抗原進(jìn)行了表達(dá)純化，著重研究絲氨酸蛋白酶抑制劑的抗原性及蟲體定位，并對其免疫保護(hù)效果進(jìn)行了初步評估。

1 材料與方法

1.1 旋毛蟲及旋毛蟲感染豬血清樣本、實驗動物來源旋毛蟲（T.spiralisISS534）由吉林大學(xué)人獸共患病研究所食源性寄生蟲病研究室使用ICR小鼠傳代保存；各感染時間的豬血清樣本由實驗室前期制備。所有動物實驗流程由吉林大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)；體重為2～2.5 kg的新西蘭白兔和體重18～22 g雌性BALB/c小鼠均購自吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心。

1.2 主要試劑IPTG、卡那霉素、咪唑等購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；一次性濾器（0.45 μm）購自美國Millipore公司；弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑均購自美國Sigma-Aldrich公司；Hoechst33342購自碧云天生物技術(shù)有限公司；HRP標(biāo)記的羊抗豬IgG抗體購自美國Jackson公司，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體購自Bio World公司；多聚甲醛、甲醇均購自北京化工廠；ECL發(fā)光試劑盒購自美國Pierce公司；His-Trap純化柱購自于美國GE Healthcare公司；ELISA板購自COSTAR公司。

1.3 rTs-serpin的大量表達(dá)與純化將實驗室保存的pET-28a-Ts-serpin/BL21（DE3）活化，接種于1 L LB培養(yǎng)基（終濃度50 μg/mL 卡那霉素）中擴(kuò)大培養(yǎng)，測其A600的值在0.4～0.8時加1 mL IPTG（IPTG終濃度為1 mmol/L）進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。將誘導(dǎo)后菌液離心并超聲破碎至澄清，離心分離上清和包涵體。將包涵體用Binding Buffer溶解后用0.45 μm濾器過濾，將濾液放在4℃冰箱保存準(zhǔn)備純化。將帶有His標(biāo)簽的rTs-serpin采用AKTA purifier100（美國 GE Healthcare公司）純化系統(tǒng)純化。分別用含有30、50、100、300、500 mmol/L咪唑的Elution Buffer洗脫，取洗脫樣品進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。

1.4 rTs-serpin反應(yīng)原性鑒定將純化后的rTs-serpin進(jìn)行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉。將感染劑量為10 000條旋毛蟲肌幼蟲、感染后不同天數(shù)（days after infection，dpi）（0、20、30、45、60、90、120 dpi）的豬血清樣本稀釋400倍作為一抗，4℃孵育過夜。將HRP標(biāo)記的羊抗豬IgG用封閉液稀釋2000倍作為二抗，室溫孵育2 h。最后加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑于成像系統(tǒng)下觀察。

1.5 多克隆抗體的制備和效價測定免疫前采兔耳緣靜脈血作為陰性血清，取純化后濃度為1 mg/mL的rTs-serpin與弗氏完全佐劑按1:1的比例完全乳化后在背部皮下多點注射，第2、3、4次免疫使用弗氏不完全佐劑，兩周免疫一次。待抗體效價到達(dá)標(biāo)準(zhǔn)后加強免疫，收集并純化血清，于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩２捎瞄g接ELISA方法，測定抗體血清效價。稀釋rTs-serpin至5 μg/mL進(jìn)行包被，將免疫前收集的陰性血清作為對照，梯度稀釋后（稀釋倍數(shù)如圖4所示）的免疫血清作為一抗，將HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG稀釋10 000倍作為二抗，進(jìn)行多克隆抗體的效價測定。

1.6 多克隆抗體的Westerrn blot鑒定將旋毛蟲肌幼蟲排泄分泌產(chǎn)物（excretion secretion，ES）和肌幼蟲蟲體蛋白進(jìn)行Western blot分析，其中一抗為稀釋2000倍的多克隆抗體和稀釋2000倍的免疫前兔血清，二抗為稀釋10 000倍的HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG。

1.7 免疫熒光定位取感染后第36 d的小鼠進(jìn)行集樣消化法得到旋毛蟲肌幼蟲，免疫前兔血清作為陰性對照、兔抗rTs-serpin血清（1∶200）作為一抗，4℃孵育過夜。Alexa Flour594標(biāo)記羊抗兔IgG（1∶1 000）為二抗，室溫避光孵育45 min。隨后用Hoechst 33342室溫復(fù)染5 min，洗滌后在熒光顯微鏡下觀察。

1.8 rTs-serpin的免疫保護(hù)效果評估首次免疫將濃度為0.1 mg/mL的rTs-serpin與弗氏完全佐劑等體積混勻乳化后皮下注射小鼠200 μL，并設(shè)置佐劑對照組和PBS對照組。加強免疫兩次，兩周一次。收集免疫前和免疫后的鼠血清，并用間接ELISA方法檢測IgG抗體水平。最后一次免疫兩周后，對小鼠進(jìn)行攻蟲（200條/只），感染后第36 d后通過集樣消化法對肌幼蟲計數(shù)，計算減蟲率。肌幼蟲減蟲率（%）=1-（實驗組小鼠平均肌幼蟲數(shù)/PBS對照組小鼠平均肌幼蟲數(shù)）×100%。

2 結(jié)果

2.1 rTs-serpin表達(dá)與純化pET-28a-Ts-serpin/BL21（DE3）經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后進(jìn)行SDS-PAGE分析，在37 kDa左右位置出現(xiàn)目的帶，與預(yù)期大小相符，目的蛋白在包涵體中得到高效表達(dá)（圖1）。重組蛋白經(jīng)過不同濃度的咪唑洗脫后，SDS-PAGE結(jié)果表明300 mmol/L咪唑洗脫的蛋白濃度較高，洗脫比較完全（圖2A）。梯度透析至PBS緩沖液后，經(jīng)SDSPAGE鑒定只在37 kDa處有單一條帶（圖2B）。

2.2 rTs-serpin的Western blot鑒定rTs-serpin的Westerrn blot結(jié)果表明，純化后的rTs-serpin可被感染10 000條肌幼蟲后不同天數(shù)的豬血清特異性識別，而與豬血清呈陰性反應(yīng)（圖3）。rTs-serpin有良好的反應(yīng)原性，在感染20 dpi即可看見明顯的反應(yīng)條帶，說明rTs-serpin可作為早期檢測旋毛蟲病的候選抗原。

圖1 rTs-serpin表達(dá)與可溶性分析Fig.1 rTs-serpin expression and solubility analysis

2.3 多克隆抗體效價測定和Western blot分析用間接ELISA方法檢測多克隆抗體的效價為1∶160 000（圖4），免疫效果良好。

2.4 多克隆抗體的Western blot分析在蟲體蛋白和ES的Western blot檢測中，發(fā)現(xiàn)rTs-serpin多克隆抗體能夠同時識別旋毛蟲蟲體粗抗原和ES產(chǎn)物中的Tsserpin，且條帶大小與理論分子量相符（圖5A），而陰性兔血清對照組膜上無條帶（圖5B）。ES中存在這種抗原，說明rTS-serpin是一種分泌蛋白。

2.5 免疫熒光定位用純化的兔抗rTs-serpin血清進(jìn)行旋毛蟲肌幼蟲蟲體的免疫熒光定位，結(jié)果表明，多克隆抗體作為一抗的旋毛蟲肌幼蟲表皮有明顯的紅色熒光信號（圖6A），而陰性兔血清未見熒光信號（圖6B）。

2.6 rTs-serpin的免疫保護(hù)效果評估間接ELISA檢測免疫后各個時間點抗體IgG水平的變化（圖7），發(fā)現(xiàn)二次免疫后小鼠血清中IgG水平明顯高于對照組。將免疫后并攻蟲的小鼠采用集樣消化法消化，并計算減蟲率。rTs-serpin免疫的小鼠與PBS、佐劑對照組相比，肌幼蟲數(shù)量減少（P＜0.05），與PBS對照組相比減蟲率為32.2%（圖8）。

圖2 rTs-serpin的SDS-PAGE鑒定Fig.2 SDS-PAGE identification of rTs-serpin

圖3 Western blot分析rTs-serpin反應(yīng)原性Fig 3 Western blot analysis of rTs-serpin reaction-like

圖4 重組蛋白rTs-serpin多克隆抗體效價分析Fig.4 Analysis of titer of recombinant protein rTs-serpin polyclonal antibody

圖5 rTs-serpin多克隆抗體的Western blot分析Fig.5 Western blot analysis of rTs-serpin polyclonal antibody

圖6 rTs-serpin在旋毛蟲肌幼蟲時期蟲體定位（×100）Fig.6 Location of rTs-serpin in Trichinella spiralis muscle larvae (×100)

A: 不同咪唑濃度洗脫液SDS-PAGE. M: 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(100 kDa); 1: rTs-serpin洗滌后包涵體; 2: 30 mmol/L咪唑洗脫峰; 3:50 mmol/L咪唑洗脫峰; 4: 100 mmol/L咪唑洗脫峰; 5:300 mmol/L咪唑洗脫峰; 6: 500 mmol/L咪唑洗脫峰

B: 復(fù)性純化后rTs-serpin SDS-PAGE. M: 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)（100 kDa); 7: 復(fù)性純化后rTs-serpin

A: Different imidazole concentration eluent SDS-PAGE. M: DNA Marker(100kDa); 1: rTs-serpin washed inclusion body; 2:30 mmol/L imidazole elution peak; 3: 50 mmol/L imidazole elution peak; 4: 100 mmol/L imidazole elution peak; 5:300 mmol/L imidazole elution peak; 6: 500 mmol/L imidazole elution peak

B: Renaturation and purification rTs-serpin SDS-PAGE. M: DNA Marker(100 kDa); 7: rTs-serpin after renaturation

圖7 rTs-serpin免疫后小鼠IgG抗體水平分析Fig.7 Analysis of mouse IgG antibody levels after rTs-serpin immunization

圖8 rTs-serpin免疫后肌幼蟲減蟲率分析Fig.8 Analysis of worm reduction rate of muscle larvae after rTs-serpin immunization

3 討論

目前，Lin等[7]建立的qPCR和LAMP方法和Li等[8]建立的LF-RPA方法均可用于檢測旋毛蟲病，但是這些方法靈敏度較低，同時也受儀器和操作方式的限制，不適用于現(xiàn)場檢測。以肌幼蟲ES抗原建立的ELISA檢測方法是目前OIE推薦的血清學(xué)方法[9]，然而這種方法存在診斷盲區(qū)，只能檢測感染后30 d等的陽性血清[10]。目前以肌幼蟲ES抗原建立的方法僅應(yīng)用于流行病學(xué)檢測，因此為旋毛蟲病早期診斷和檢測找到一種優(yōu)質(zhì)抗原仍是目前ELISA方法需要解決的問題?；蚬こ炭乖幸子诖罅可a(chǎn)且成分單一有利于純化等優(yōu)點，目前已經(jīng)從旋毛蟲cDNA[11]文庫發(fā)現(xiàn)多個具有良好抗原性的基因，并利用DNA重組技術(shù)克隆表達(dá)了多種旋毛蟲不同時期的功能抗原[12]，如DNaseII-T3223-7[13]、T668定點突變蛋白[14]、重組蛋白TsSP[15]等。本試驗將表達(dá)純化后rTs-serpin與感染旋毛蟲不同天數(shù)的豬血清進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果表明rTs-serpin有良好的反應(yīng)原性，可以作為診斷豬旋毛蟲病的候選抗原。

絲氨酸蛋白酶抑制劑有抑制凝血、誘發(fā)炎性反應(yīng)和參與寄生蟲免疫逃避[16-17]等多種生物學(xué)功能。絲氨酸蛋白酶抑制劑在鉤蟲中有抗凝血作用，有助于蟲體從宿主內(nèi)攝取營養(yǎng)，可以提高鉤蟲的免疫防御能力[4]。在埃及血吸蟲中，絲氨酸蛋白酶抑制劑可與人的胰蛋白酶結(jié)合來降低蟲體的免疫原性，從而使其達(dá)到免疫逃避的目的[18]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，旋毛蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑TsAdSPI可以抑制糜蛋白酶、胰蛋白酶和彈性蛋白酶的活性，來抵御宿主的消化系統(tǒng)對蟲體的損害[19]。吳秀萍等[6]證明Ts-serpin主要存在于旋毛蟲肌幼蟲時期，少量存在于新生幼蟲時期，并在旋毛蟲生命周期發(fā)揮重要作用。在本研究中，Western blot結(jié)果顯示旋毛蟲肌幼蟲ES抗原和蟲體粗抗原均存在Ts-serpin。隨后，利用多克隆抗體進(jìn)行免疫熒光定位，發(fā)現(xiàn)Ts-serpin主要分布在旋毛蟲肌幼蟲表皮中，表明Ts-serpin是一種分泌型抗原。另一方面，劉照琨等[20]利用旋毛蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑（TsKaSPI）重組蛋白免疫小鼠，具有一定的成蟲減蟲率，使小鼠獲得免疫保護(hù)效果。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，rTs-serpin免疫后的小鼠肌幼蟲減蟲率約為32.2%，說明rTs-serpin免疫后的小鼠對旋毛蟲肌幼蟲的感染產(chǎn)生了一定的免疫保護(hù)作用，可將Tsserpin作為潛在的候選疫苗靶標(biāo)。

綜上，本研究結(jié)果表明制備的rTs-serpin具有較強的反應(yīng)原性，且可以被旋毛蟲早期感染血清識別，為下一步研發(fā)旋毛蟲的診斷方法提供了候選抗原。間接免疫熒光定位顯示Ts-serpin主要在蟲體表皮中，免疫保護(hù)試驗結(jié)果表明Ts-serpin可作為旋毛蟲基因工程疫苗研究的候選靶標(biāo)。