陳 露，朱偉峰，魏后軍，仇汝龍，胡 波，范志宇，陳萌萌，王 芳

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，南京 210014；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210014；3.國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，南京 210014）

多殺性巴氏桿菌可引起多種畜禽和野生動(dòng)物的巴氏桿菌病[1-2]，因發(fā)病程度和感染動(dòng)物不同而有不同的病名，如豬肺疫、豬進(jìn)行性萎縮性鼻炎、禽霍亂、牛出血性敗血癥、兔出血性敗血癥等。近年來多殺性巴氏桿菌在多種動(dòng)物中的臨床分離率或檢出率均位居細(xì)菌性病原的前列[3-5]，給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。多殺性巴氏桿菌同樣可以造成人類感染發(fā)病，是一種人獸共患病病原體。與動(dòng)物密切接觸的人群的血清中巴氏桿菌抗體陽性率比未接觸者高兩倍左右[6]。人類發(fā)病主要通過傷口感染?；颊邉?chuàng)口處腫脹、劇痛、發(fā)熱、形成膿腫和周圍淋巴結(jié)炎，個(gè)別病例出現(xiàn)敗血癥和腦膜炎[1-2]。目前，研究發(fā)現(xiàn)莢膜、脂多糖、外膜蛋白等毒力因子與多殺性巴氏桿菌的致病性有關(guān)[7]，但是尚不能完全清楚地解釋巴氏桿菌病發(fā)病的分子機(jī)制，也無法完全確定各毒力因子在致病中的作用[8-9]。

孔蛋白OmpH是多殺性巴氏桿菌的一種主要的外膜蛋白[10]。在多殺性巴氏桿菌的全基因組序列中，存在兩個(gè)拷貝的OmpH基因（間隔154 bp），分別編碼蛋白質(zhì)OmpH1和OmpH2[11]。過去對(duì)OmpH1（通常稱為OmpH）的研究較多，現(xiàn)有研究表明OmpH是保護(hù)性抗原并具有黏附作用[12-13]。很多病原菌的黏附因子除了可以黏附宿主細(xì)胞外還可以黏附胞外基質(zhì)成分（如纖維連接蛋白，F(xiàn)ibronectin，F(xiàn)n）或者通過結(jié)合宿主血漿纖維蛋白溶解酶原（Plasminogen，Plg）促進(jìn)細(xì)菌對(duì)宿主細(xì)胞和組織的黏附[14-15]。已經(jīng)有學(xué)者通過招募實(shí)驗(yàn)證實(shí)多殺性巴氏桿菌能夠利用Fn和Plg[16-17]。目前關(guān)于OmpH2的致病作用的報(bào)道較少，僅少量研究表明其與康復(fù)血清間存在反應(yīng)[18]。OmpH2作為多殺性巴氏桿菌一種與OmpH1同源的外膜蛋白，可能也是一個(gè)黏附因子。OmpH2是否通過結(jié)合宿主Fn和Plg促進(jìn)多殺性巴氏桿菌對(duì)宿主的黏附的研究具有重要意義。本文旨在通過研究OmpH2對(duì)Fn和Plg的黏附作用，從而初步揭示多殺性巴氏桿菌OmpH2分子致病機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 質(zhì)粒、菌種及培養(yǎng)pET28a（+）表達(dá)載體、BL21（DE3）宿主菌、多殺性巴氏桿菌C51-17株為本試驗(yàn)室保存。多殺性巴氏桿菌使用馬丁肉湯（海博，青島）添加10% 新生牛血清（Gibco）培養(yǎng)。大腸桿菌使用（LB）（海博，青島）液體或固體培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2 序列比對(duì)從PMTB2.1菌株全基因組序列[19]中找到OmpH1和OmpH2的基因序列并轉(zhuǎn)碼為氨基酸。然后使用Clustal Omega（http://www.clustal.org/omega/）進(jìn)行多序列比對(duì)，比較OmpH1和OmpH2蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)之間的相似性和差異。

1.3 OmpH2基因的克隆以多殺性巴氏桿菌 PMTB2.1菌株OmpH2的基因序列[19]為參考序列，設(shè)計(jì)克隆引物。使用SignalIP4.0找出信號(hào)肽對(duì)應(yīng)基因序列并截去，進(jìn)而設(shè)計(jì)引物OmpH2-F（5'-cagcaaatgggtcgcg gatccGCAACCGTTTTCGATAAAGAAGG-3'，小寫字母為與載體相同的同源臂，下同）和OmpH2-R（5'-gcaagcttgtcgacggagctcGAAGTGTACGCGTAAA CCAACACC-3'）。按照文獻(xiàn)[20]提取C51-17菌株基因組并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。酶切質(zhì)粒并通過同源重組克隆試劑盒（諾唯贊，南京）將OmpH2的PCR擴(kuò)增片段連接到pET28a（+）上，將陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)PCR鑒定后，將陽性克隆送南京擎科生物科技有限公司測(cè)序。

1.4 誘導(dǎo)表達(dá)并鑒定對(duì)OmpH2重組大腸桿菌進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。優(yōu)化誘導(dǎo)溫度，分別設(shè)置為37℃、28℃、16℃；優(yōu)化IPTG終濃度，分別設(shè)置為0.2、0.4、0.6、0.8、1 mmol/L。重組菌誘導(dǎo)表達(dá)后超聲波破碎，12000×g離心，分別收集上清和沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE分析，檢測(cè)表達(dá)效果。

1.5 rOmpH2與多殺性巴氏桿菌感染康復(fù)血清的反應(yīng)將rOmpH2進(jìn)行SDS-PAGE并將蛋白轉(zhuǎn)到NC膜上，同時(shí)以紅斑丹毒絲菌SpaA重組蛋白為陰性對(duì)照，多殺性巴氏桿菌GAPDH重組蛋白為陽性對(duì)照，對(duì)照組重組蛋白已經(jīng)在以前的研究[15,17]中制備。經(jīng)過5%的脫脂乳封閉后，加入本實(shí)驗(yàn)室保存的1/500稀釋的C51-17株的兔感染康復(fù)血清[21]，37℃孵育1 h；PBST漂洗5遍，加入1/5000稀釋的HRP偶聯(lián)的羊抗兔IgG，37℃孵育1 h； PBST漂洗5遍，進(jìn)行ECL（諾唯贊，南京）顯色。

1.6 Fn和Plg結(jié)合活性檢測(cè)參照文獻(xiàn)[15]進(jìn)行Far Western blot實(shí)驗(yàn)。將重組rOmpH2進(jìn)行SDS-PAGE并將蛋白轉(zhuǎn)到NC膜上。經(jīng)過5%脫脂乳封閉后，加入10 μg/mL人源Fn或 Plg（Sigma），37℃孵育2 h。對(duì)照組不與Fn及Plg進(jìn)行孵育，但同樣進(jìn)行后續(xù)操作。漂洗5遍，分別加入1/1000稀釋的兔抗人纖維連接蛋白抗體和兔抗人血漿纖維蛋白溶解酶原抗體，37℃孵育1 h。PBST漂洗5遍，加入1/5000稀釋的HRP偶聯(lián)的羊抗兔IgG，37℃孵育1 h；PBST漂洗5遍，進(jìn)行ECL（諾唯贊，南京）顯色。

1.7 rOmpH2多克隆抗體的制備將100 μg/50 μL純化的重組蛋白rOmpH2用等體積弗氏完全佐劑（Sigma）乳化后，以腹腔注射方式免疫5只小鼠，每只100 μL，14 d后，以100 μg/ 50 μL純化的重組蛋白同等體積弗氏不完全佐劑（Sigma）乳化后，采用皮下注射方式進(jìn)行二次免疫。第二次免疫10 d后采血制備多克隆抗血清，并用蛋白A抗體純化試劑盒（金斯瑞，南京）純化出血清中的IgG。

1.8 Plg和Fn的招募抑制實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[22-23]進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。以多殺性巴氏桿菌C51-17株包被ELISA板，108CFU/孔，4℃過夜；經(jīng)PBST洗滌3次，以5%脫脂乳37℃封閉1 h。以50 μL 1/10稀釋的OmpH2 IgG 37℃孵育0.5 h，并以1/10稀釋的免疫前血清IgG為對(duì)照，PBST洗滌3遍，分別與50 μL的纖維連接蛋白（100 ng）和血漿纖維蛋白溶解酶原（100 ng），37℃孵育1 h。洗滌后，每孔加入1/1000稀釋的兔源抗血漿纖維蛋白溶解酶原IgG或者1/1000稀釋的兔源抗纖維連接蛋白IgG，37℃孵育0.5 h；洗滌3次，加入1/5000稀釋的HRP偶聯(lián)的羊抗兔二抗，37℃孵育0.5 h。洗滌后，每孔加入100 μL TMB顯色液，室溫避光反應(yīng)10 min后，加入終止反應(yīng)液。在酶標(biāo)儀上讀取450 nm的吸光度。以O(shè)mpH2 IgG處理組的OD值除以免疫前血清IgG處理組的OD值計(jì)算多殺性巴氏桿菌對(duì)Fn和Plg的相對(duì)結(jié)合活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，用t檢驗(yàn)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 OmpH2和OmpH1的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果對(duì)OmpH2和OmpH1的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，其序列一致性為46.1%，相似性為78.2%。但是兩者存在若干高度相同或相似的局部區(qū)域（如OmpH2的L106～F148、L185～K204等），見圖1。

2.2 OmpH2重組蛋白的表達(dá)和純化將擴(kuò)增的OmpH2的基因連接到pET28a（+）載體上，陽性菌株測(cè)序結(jié)果顯示C51-17株的OmpH2基因序列與GenBank上PMTB2.1株OmpH2基因序列一致性為100%。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21工程菌后，通過優(yōu)化誘導(dǎo)條件，選用37℃、0.6 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，獲得較多的重組蛋白rOmpH2（～43 kDa），主要以包涵體形式表達(dá)（圖2A）。

2.3 rOmpH2與多殺性巴氏桿菌康復(fù)血清的反應(yīng)Western blot結(jié)果顯示，多殺性巴氏桿菌OmpH2能夠與多殺性巴氏桿菌康復(fù)血清發(fā)生特異性反應(yīng)。作為陰性對(duì)照的紅斑丹毒絲菌SpaA泳道未見符合預(yù)期大?。?0 kDa）的條帶，作為陽性對(duì)照的巴氏桿菌GAPDH（41 kDa）泳道和OmpH2（43 kDa）泳道均存在一條符合預(yù)期大小的條帶（圖2B）。

2.4 rOmpH2與Fn和Plg的結(jié)合活性針對(duì)Fn和Plg結(jié)合作用檢測(cè)的Far Western blot結(jié)果顯示，rOmpH2泳道上均存在一條約43 kDa的條帶，與rOmpH2大小一致，未孵育Fn或Plg的對(duì)照NC膜上未見符合預(yù)期大小的條帶（圖3），即rOmpH2具有結(jié)合Fn和Plg的能力。

2.5 rOmpH2多克隆抗體的Fn和Plg結(jié)合抑制作用ELISA結(jié)果顯示，rOmpH2 IgG孵育處理后，多殺性巴氏桿菌對(duì)于Fn和Plg的結(jié)合能力顯著下降。經(jīng)過rOmpH2 IgG孵育后多殺性巴氏桿菌對(duì)Fn和Plg的結(jié)合能力均顯著下降，分別下降了30%、20%左右（圖4）。

圖1 OmpH1和OmpH2一級(jí)結(jié)構(gòu)的比較Fig.1 Comparison of primary structure of OmpH1 and OmpH2

圖2 重組rOmpH2蛋白的表達(dá)及與康復(fù)血清的反應(yīng)Fig.2 Recombinant expression of rOmpH2 and its reactivity with recover serum

3 討論

孔蛋白OmpH是多殺性巴氏桿菌的一種主要的外膜蛋白，具有2個(gè)拷貝的基因[10]。已有研究發(fā)現(xiàn)OmpH1在巴氏桿菌致病機(jī)制中發(fā)揮黏附作用[12-13]。盡管OmpH2與OmpH1的氨基酸序列存在一定差異，但是它們之間存在高度相似的局部區(qū)域，因而OmpH2可能也具有類似的功能，因此我們對(duì)OmpH2的黏附作用開展了研究。

病原菌免疫原性較好的分子也常常在其致病過程中發(fā)揮作用[24-25]。本研究首先表達(dá)了多殺性巴氏桿菌的rOmpH2蛋白，并對(duì)其致病機(jī)理展開了初步研究。Western blot表明，rOmpH2與多殺性巴氏桿菌高免血清存在明顯的反應(yīng)。這一結(jié)果與另一個(gè)團(tuán)隊(duì)的檢測(cè)結(jié)果一致[14]，表明OmpH2可能在多殺性巴氏桿菌感染與免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

Fn是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成成分。很多病原菌通過結(jié)合該分子實(shí)現(xiàn)對(duì)宿主細(xì)胞的黏附進(jìn)而發(fā)揮致病作用[26]。結(jié)合Fn同樣也是多殺性巴氏桿菌黏附宿主細(xì)胞的重要途徑[27]。但是Fn增強(qiáng)多殺性巴氏桿菌黏附的分子機(jī)制還不完全清楚。Plg是動(dòng)物體內(nèi)重要的黏附分子，有多個(gè)可以與其他分子發(fā)生結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。很多病原菌通過結(jié)合Plg增強(qiáng)對(duì)宿主細(xì)胞的黏附作用[25,28]。本實(shí)驗(yàn)室前期報(bào)道了多殺性巴氏桿菌能夠利用Plg[29]。本研究發(fā)現(xiàn)rOmpH2能夠結(jié)合Fn和Plg，而且rOmpH2多克隆抗體能夠顯著抑制多殺性巴氏桿菌對(duì)Fn和Plg的結(jié)合。因此，OmpH2還可能在多殺性巴氏桿菌結(jié)合細(xì)胞外基質(zhì)成分Fn和宿主Plg過程中發(fā)揮作用，進(jìn)而促進(jìn)多殺性巴氏桿菌對(duì)宿主細(xì)胞的黏附作用。

圖3 Far Western blot檢測(cè)rOmpH2對(duì)宿主Fn和Plg分子的結(jié)合作用Fig. 3 Detection of binding activity of rOmpH2 to host Fn and Plg via Far Western blot

圖4 OmpH2多克隆抗體對(duì)多殺性巴氏桿菌黏附宿主Fn和Plg的抑制作用Fig. 4 Inhibition activity of OmpH2 polyclonal antibodies to binding activity of P. multocida to host Fn and Plg