王 曄，趙其平，朱順海，董 輝，姜連連，薛 璞，舒凡帆，黃 兵，韓紅玉

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物寄生蟲(chóng)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200241；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642）

雞球蟲(chóng)病是由頂復(fù)門艾美耳屬（Eimeria spp.）的艾美耳球蟲(chóng)寄生于雞腸道引起的一種原蟲(chóng)病。雞感染球蟲(chóng)后會(huì)引起食欲下降、營(yíng)養(yǎng)吸收障礙、飼料轉(zhuǎn)化率下降、增重降低，甚至死亡，給養(yǎng)禽業(yè)造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。目前雞球蟲(chóng)病的防治手段主要以藥物預(yù)防為主，隨著球蟲(chóng)耐藥性的不斷增加和人們對(duì)食品安全問(wèn)題的日益關(guān)注，迫切需要一種更安全有效的防治球蟲(chóng)病的方法?；蚬こ桃呙缡俏磥?lái)防治雞球蟲(chóng)病的趨勢(shì)，也是近些年來(lái)研究的熱點(diǎn)，而能否篩選出具有免疫保護(hù)性的抗原是構(gòu)建基因工程疫苗的關(guān)鍵。

頂復(fù)門原蟲(chóng)的頂膜抗原1（apical membrane antigen 1，AMA1）是微線體分泌的一種保守蛋白，可與蟲(chóng)體的棒狀體頸部蛋白一起形成運(yùn)動(dòng)環(huán)結(jié)構(gòu)（moving junction，MJ），在蟲(chóng)體入侵宿主細(xì)胞過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，AMA1還參與了蟲(chóng)體頂體再定位（apical reorientation）[2]、蟲(chóng)體的粘附（intimate attachment）[3]、棒狀體蛋白的分泌[4]，以及為蟲(chóng)體在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制提供啟動(dòng)信號(hào)[5]。已有研究證實(shí)免疫惡性瘧原蟲(chóng)（Plasmodium falciparum）重組AMA1蛋白后的小鼠和猴可產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)[6]。近年來(lái)也確認(rèn)AMA1在其他頂復(fù)門原蟲(chóng)如巴貝斯蟲(chóng)（Babesia）、弓形蟲(chóng)（Toxoplasma）和新孢子蟲(chóng)（Neospora）中是具有免疫保護(hù)作用的蛋白[7-9]。在艾美耳球蟲(chóng)中，Jiang等[10]首次報(bào)道了柔嫩艾美耳球蟲(chóng)（Eimeria tenell）AMA1（EtAMA1）基因，并在體外用多克隆抗體抑制EtAMA1蛋白后觀察到子孢子的細(xì)胞入侵率下降了70%，表明EtAMA1對(duì)球蟲(chóng)入侵宿主細(xì)胞起重要的作用。利用重組EtAMA1蛋白免疫雞對(duì)同源蟲(chóng)株攻擊能產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)，如Li等[11]用表達(dá)AMA1抗原的重組卡介苗BCG/pMV261-AMA1和BCG/pMV361-AMA1經(jīng)三種途徑免疫雞，同源株攻蟲(chóng)后經(jīng)皮下和滴鼻途徑免疫的重組卡介苗組顯示了較好的免疫保護(hù)效果，在增重和卵囊減少率方面與未免疫攻蟲(chóng)組差異顯著。Li等[12]用可表達(dá)EtAMA1蛋白的乳酸乳球菌經(jīng)口服免疫雛雞，然后進(jìn)行同源攻蟲(chóng)的免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示具有一定的免疫保護(hù)作用。而且最近的研究顯示在柔嫩艾美耳球蟲(chóng)蟲(chóng)體上引入了巨型艾美耳球蟲(chóng)的AMA1基因，將其作為活載體疫苗免疫雛雞，在巨型艾美耳球蟲(chóng)攻蟲(chóng)后，可產(chǎn)生與單獨(dú)使用AMA1基因DNA疫苗或重組蛋白疫苗相當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)力，這不僅證實(shí)了AMA1抗原作為疫苗的潛力，也為今后研制針對(duì)艾美耳球蟲(chóng)屬多種球蟲(chóng)具有交叉保護(hù)力的多價(jià)疫苗提供了可能[13]。

雞IFN-γ是一種具有抗病毒、抗寄生蟲(chóng)和抗細(xì)菌等廣泛生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，可作為免疫佐劑與疫苗聯(lián)合使用，提高機(jī)體自身的免疫應(yīng)答能力和疫苗的免疫保護(hù)作用，而且球蟲(chóng)疫苗研究中也證實(shí)IFN-γ對(duì)疫苗具有明顯的免疫協(xié)同作用，能增強(qiáng)球蟲(chóng)疫苗的免疫保護(hù)效力[14-16]。本研究將柔嫩艾美耳球蟲(chóng) AMA1 基因和雞 IFN-γ基因分別插入pCAGGS載體的兩個(gè)多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建了兩種真核表達(dá)載體pCAGGS-EtAMA1和pCAGGS-EtAMA1-IFN-γ，以檢測(cè)其對(duì)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)人工感染的免疫保護(hù)效果。

1 材料與方法

1.1 材料柔嫩艾美耳球蟲(chóng)孢子化卵囊cDNA、兔源性抗rEtAMA1多克隆抗體，由本課題組制備保存。真核表達(dá)載體pCAGGS和真核細(xì)胞293T，由本所禽病研究室李澤君老師饋贈(zèng)。E. coli TOP10、DL2000（DNA Marker）購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司。rTaq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、XhoⅠ和NheⅠ，購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。pGEM-T Easy載體，購(gòu)自Promega公司。Lipofectamine 2000，購(gòu)自Invitrogen公司。胎牛血清、DMEM、Opti-MEM，購(gòu)自Gibco公司。Western及IP細(xì)胞裂解液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。紅色熒光標(biāo)記山羊抗兔二抗購(gòu)自Jackson Immuno Research公司。近紅外熒光羊抗兔IgG購(gòu)自LI-COR公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及所用蟲(chóng)株實(shí)驗(yàn)雞舍沖洗干凈后，用開(kāi)水燙洗和甲醛熏蒸消毒，通風(fēng)排出殘留氣味。飼養(yǎng)雞只的籠子在80℃下烘烤至少30 min，然后搬至雞舍。所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物三黃雞來(lái)自上海奉賢某種雞場(chǎng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所用球蟲(chóng)株為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所動(dòng)物原蟲(chóng)病研究團(tuán)隊(duì)保存的柔嫩艾美耳球蟲(chóng)純種蟲(chóng)株，編號(hào)為CAAS 21111601。實(shí)驗(yàn)前經(jīng)2周齡無(wú)球蟲(chóng)雛雞繁殖后備用。

1.3 EtAMA1基因的克隆以柔嫩艾美耳球蟲(chóng)孢子化卵囊cDNA為模板，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室利用RACE擴(kuò)增獲得的含一個(gè)完整開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF）的全長(zhǎng)EtAMA1基因序列設(shè)計(jì)引物[10]，擴(kuò)增該基因含完整ORF的序列，長(zhǎng)度為1439 bp。引物由上海桑尼生物技術(shù)有限公司合成，其中上游引物序列：5'-GCGAATTCATGCAGCCGCCCTAT-3'，下游引物序列：5'- GCCTCGAGGCTGGTGTTGTTG TT-3'。上游引物引入EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，下游引物引入XhoⅠ酶切位點(diǎn)。PCR反應(yīng)總體積20 μL，其中模板2 μL，上下游引物各0.5 μL，rTaq DNA聚合酶1 μL，dNTPs 2 μL，10×PCR Buffer 2 μL，滅菌水補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s，50℃退火40 s，72℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，切膠回收目的片段。將純化的目的片段經(jīng)連接酶與pGEM-T Easy載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coli TOP10感受態(tài)細(xì)胞中，培養(yǎng)過(guò)夜后挑取白色單菌落培養(yǎng)，PCR鑒定后提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定并測(cè)序。

1.4 pCAGGS-EtAMA1真核重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建利用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ分別對(duì)鑒定正確的重組質(zhì)粒pGEM-T Easy-EtAMA1和pCAGGS載體進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，用膠回收純化試劑盒分別回收目的片段，16℃連接過(guò)夜后轉(zhuǎn)入E.coli TOP10感受態(tài)細(xì)胞中，涂板培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單菌落于4 mL LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h后，進(jìn)行PCR鑒定，對(duì)鑒定為陽(yáng)性的菌液提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，將酶切和PCR鑒定后的正確重組質(zhì)粒命名為pCAGGS-EtAMA1。

1.5 雞IFN-γ基因的克隆以本研究室之前保存的雞脾臟cDNA為模板，PCR擴(kuò)增IFN-γ基因。IFN-γ上游引物：5'- GTGCTAGCATGACTT GCCAGACTTAC- 3'（NheⅠ），IFN-γ下游引物：5'-GTGCTAGCATTAGCAATTGCATCTCCT-3'（NheⅠ），上、下游引物均包含NheⅠ酶切位點(diǎn)。引物PCR擴(kuò)增片段大小為496 bp，包含完整的雞IFN-γ基因開(kāi)放閱讀框?；厥誔CR產(chǎn)物，并將目的片段連接到pGEM-T Easy載體上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞中，提取質(zhì)粒后用NheⅠ內(nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒定。鑒定為陽(yáng)性的菌株命名為pGEM-T Easy-IFN-γ并送至上海桑尼公司測(cè)序。

1.6 pCAGGS-EtAMA1-IFN-γ真核重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建將pGEM-T Easy-IFN-γ質(zhì)粒和鑒定為陽(yáng)性的pCAGGS-EtAMA1重組質(zhì)粒分別用NheⅠ進(jìn)行酶切，膠回收IFN-γ基因片段和pCAGGS-EtAMA1，然后16℃水浴中連接過(guò)夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Top10 感受態(tài)細(xì)胞中，PCR鑒定為陽(yáng)性后，對(duì)插入的IFN-γ基因進(jìn)行測(cè)序。將鑒定正確的IFN-γ基因正向插入的重組質(zhì)粒命名為pCAGGSEtAMA1-IFN-γ。

1.7 293T細(xì)胞的復(fù)蘇培養(yǎng)用含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)293T 細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前，收集293T細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以每孔5×105個(gè)細(xì)胞鋪被6孔板2塊，37℃、5%CO2培養(yǎng)過(guò)夜，按照LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染操作步驟，分別將pCAGGS空載體和重組質(zhì)粒pCAGGS-EtAMA1轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，置于37℃。5%CO2培養(yǎng)4 h，更換含有2%胎牛血清的opti-MEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后，取其中一塊6孔板進(jìn)行間接免疫熒光，收集另一塊6孔板的293T細(xì)胞用于Western blot檢測(cè)。

1.8 間接免疫熒光（indirect fluorescent assay，IFA）鑒定pCAGGS-EtAMA1的表達(dá)情況在培養(yǎng)48 h后，取轉(zhuǎn)染后的293T細(xì)胞，用2%多聚甲醛1 mL固定15 min，PBST洗滌3遍。加入1% Triton X-100 1 mL，室溫下作用15 min，用PBST洗3次。加入2%BSA/PBS 2 mL，4℃封閉過(guò)夜，PBST洗滌3遍。加入兔源性抗rEtAMA1蛋白的多克隆抗體，37℃作用1 h，PBST洗滌3次。加入1∶500稀釋的紅色熒光標(biāo)記的山羊抗兔二抗，37℃作用1 h，再用PBST洗滌6次。加入PBST 1 mL，熒光顯微鏡（Nikon 80i）下觀察，并拍照保存。

1.9 Western blot鑒定pCAGGS-EtAMA1的表達(dá)情況收集1.7中培養(yǎng)48 h的293T細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液100 μL，4℃、12 000×g離心3 min，取上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳。半干法電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉過(guò)夜，PBS洗滌3次。加入1∶100稀釋的兔抗rEtAMA1蛋白多抗血清，37℃孵育2 h，PBS洗膜3次。加入1∶10 000稀釋的近紅外熒光羊抗兔IgG，37℃孵育2 h，PBST洗膜1次，PBS洗膜3次。用Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。

1.10 動(dòng)物分組及免疫1日齡肉雞飼養(yǎng)于潔凈已消毒的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，在7日齡時(shí)進(jìn)行稱重，挑選90～106 g的肉雞隨機(jī)分組，然后進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，使各組平均初重基本相同。80只雞分為5組，每組16只。第1組為pCAGGS-EtAMA1免疫組，第2組為pCAGGSEtAMA1-IFN-γ免疫組，第3組為pCAGGS空載體免疫組，第4組為未免疫未攻蟲(chóng)組，第5組為未免疫攻蟲(chóng)組。分組后每只雞都貼好腳標(biāo)，以免混淆，每6 d更換腳標(biāo)1次。1～3組分別于7日齡、14日齡在腿部肌肉注射100 μg/只重組質(zhì)粒，兩次注射位點(diǎn)一致。注射重組質(zhì)粒前，先在每只雞腿部注射0.2 mL高滲蔗糖溶液并按摩，15～20 min后，在相同部位注射重組質(zhì)粒。未免疫未攻蟲(chóng)組和未免疫攻蟲(chóng)組注射100 μL PBS溶液。21日齡時(shí)除未免疫未攻蟲(chóng)組外，其余各組每只雞均經(jīng)口感染1×104個(gè)新鮮柔嫩艾美耳球蟲(chóng)孢子化卵囊。

1.11 免疫保護(hù)評(píng)價(jià)指標(biāo)免疫保護(hù)效果通過(guò)平均增重、盲腸病變記分和卵囊減少率進(jìn)行評(píng)價(jià)。本次實(shí)驗(yàn)共稱重4次。即在一免時(shí)、一免后第7 d、二免后第7 d、攻蟲(chóng)后第8 d進(jìn)行稱重。統(tǒng)計(jì)各組每個(gè)時(shí)期的平均增重，平均增重1（g/羽）=攻蟲(chóng)當(dāng)天平均重量-初始分組平均重量；平均增重2（g/羽）=試驗(yàn)結(jié)束后平均重量-攻蟲(chóng)當(dāng)天平均重量；相對(duì)增重率=實(shí)驗(yàn)組平均增重2/未免疫未攻蟲(chóng)組平均增重。盲腸病變記分參照文獻(xiàn)[17]的方法進(jìn)行。從攻蟲(chóng)后第5 d到攻蟲(chóng)后第8 d這段時(shí)間每天收集各組的糞便，多點(diǎn)采集糞樣，混勻后，采用麥克馬斯特法進(jìn)行卵囊計(jì)數(shù)。卵囊減少率（%）=［（未免疫攻蟲(chóng)組卵囊數(shù)-免疫組卵囊數(shù)）/未免疫攻蟲(chóng)組卵囊數(shù)］×100%。平均增重和盲腸病變記結(jié)果分運(yùn)用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用單因素方差分析（one-way ANOVA analysis）中的Duncan's multiple range test進(jìn)行多組樣本間差異顯著性分析，P＜0.05為差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EtAMA1基因的克隆以柔嫩艾美耳球蟲(chóng)孢子化卵囊cDNA為模板， PCR擴(kuò)增出一條大約1439 bp的目的條帶；將其與pGEM-T Easy載體連接，轉(zhuǎn)化E. coli TOP10感受態(tài)細(xì)胞后，菌液經(jīng)PCR鑒定出現(xiàn)與預(yù)期大小一致的片段（圖1A）；質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定，可見(jiàn)2條帶，其大小也與預(yù)期目的條帶一致（圖1B）；測(cè)序結(jié)果表明與原序列一致。以上結(jié)果表明成功克隆了EtAMA1基因。

2.2 真核重組表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS-EtAMA1的構(gòu)建和鑒定分別用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ對(duì)鑒定正確的重組克隆質(zhì)粒pGEM-T Easy-EtAMA1和空載體pCAGGS進(jìn)行雙酶切，純化后進(jìn)行連接，構(gòu)建了真核重組表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS-EtAMA1。對(duì)該重組質(zhì)粒的PCR（圖2A）及雙酶切（圖2B）產(chǎn)物進(jìn)行電泳，所獲條帶大小與預(yù)期一致。

圖1 pGEM-T Easy-EtAMA1的PCR及雙酶切鑒定結(jié)果Fig.1 Results of PCR detection and restriction enzyme analysis of pGEM-T Easy-EtAMA1

圖2 陽(yáng)性重組質(zhì)粒pCAGGS-EtAMA1的PCR及雙酶切鑒定Fig.2 Results of PCR detection and restriction analysis of recombinant plasmid pCAGGS-EtAMA1

2.3 雞IFN-γ基因PCR擴(kuò)增結(jié)果及序列分析PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示，有一條大小約為500 bp的條帶，與雞IFN-γ基因（496 bp）大小預(yù)期一致（圖3）。將PCR產(chǎn)物純化回收后與pGEM-T Easy載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEM-T Easy- IFN-γ，經(jīng)內(nèi)切酶NheⅠ酶切，出現(xiàn)大小約為500 bp的目的條帶（圖4）。陽(yáng)性重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果顯示，IFN-γ與GenBank所發(fā)表序列有一個(gè)堿基發(fā)生突變，堿基相似性為99%，氨基酸序列中第125位氨基酸由M變?yōu)镵，無(wú)移碼突變，不影響該蛋白功能，氨基酸同源性為99%。

圖3 雞IFN-γ基因 PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 3 Results of PCR amplification of chicken IFN-γ gene

2.4 重組質(zhì)粒pCAGGS-EtAMA1-IFN-γ的構(gòu)建及鑒定將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pCAGGS-EtAMA1-IFN-γ用PCR方法擴(kuò)增，結(jié)果在大小約為500 bp處有一條目的條帶（圖5），并送至上海桑尼公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示IFN-γ基因正向插入pCAGGS載體，表明pCAGGS-EtAMA1-IFN-γ構(gòu)建成功。

2.5 間接免疫熒光（IFA）檢測(cè)pCAGGS-EtAMA1在293T細(xì)胞中的表達(dá)利用兔抗rEtAMA1蛋白多克隆抗體，對(duì)重組質(zhì)粒pCAGGS-EtAMA1轉(zhuǎn)染48 h后的293T細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)。結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染pCAGGS-EtAMA1重組質(zhì)粒的293T細(xì)胞中，可以看到特異的紅色熒光（圖6A）；而在轉(zhuǎn)染pCAGGS空載體的293T細(xì)胞中，則無(wú)紅色熒光（圖6B）。

2.6 Western blot分析pCAGGS-EtAMA1在293T細(xì)胞中的表達(dá)Western blot分析結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pCAGGS-EtAMA1的293T細(xì)胞中，可以檢測(cè)到大小約為58 kDa的蛋白質(zhì)條帶；而在轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒的293T細(xì)胞中，未檢測(cè)到相應(yīng)的目的條帶（圖7）。

圖4 pGEM-T Easy-IFN-γ雙酶切鑒定結(jié)果Fig. 4 Results of restriction analysis of pGEM-T Easy-IFN-γ plasmid

圖5 重組質(zhì)粒pCAGGS-EtAMA1-IFN-γ的PCR鑒定Fig. 5 Results of PCR detection of recombinant plasmid pCAGGS-EtAMA1-IFN-γ

圖6 轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pCAGGS-EtAMA1的293T細(xì)胞的間接免疫熒光檢測(cè)Fig. 6 IFA analysis of the 293 T cell transinfected with pCAGGS-EtAMA1

圖7 EtAMA1重組蛋白Western blot分析結(jié)果Fig. 7 Western blot analysis of recombinant proteinEtAMA1

2.7 免疫保護(hù)效果每組雞在柔嫩艾美耳球蟲(chóng)攻蟲(chóng)后均未出現(xiàn)死亡。平均增重1、平均增重2、病變記分和卵囊減少率結(jié)果見(jiàn)表1。未免疫攻蟲(chóng)組相較未免疫未攻蟲(chóng)組表現(xiàn)出嚴(yán)重的盲腸病變，平均增重顯著下降（P＜0.05）。pCAGGS-AMA1和pCAGGSAMA1-IFN-γ組相比未免疫攻蟲(chóng)組平均增重2較大，但是差異不顯著（P＞0.05）。這兩組在盲腸病變記分方面相比未免疫攻蟲(chóng)組則有顯著的減輕（P＜0.05）。pCAGGS-AMA1-IFN-γ組的卵囊減少率高于其他4組，達(dá)到72.89%。

表1 2種重組質(zhì)粒對(duì)雛雞E. tenella人工感染的免疫保護(hù)效果Table 1 Protection effects of the 2 recombinant plasmids against chicken E. tenella challenge

3 討論

由于球蟲(chóng)耐藥株的出現(xiàn)、傳統(tǒng)活疫苗存在毒力返強(qiáng)以及制備成本較高等原因，越來(lái)越多的研究將重組疫苗作為控制球蟲(chóng)病的替代方法[18]。DNA疫苗是一種很好的可替代傳統(tǒng)治療的手段，其注射進(jìn)動(dòng)物體內(nèi)后可表達(dá)產(chǎn)生質(zhì)粒DNA所編碼的抗原，激發(fā)體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)[19]。DNA疫苗能夠大量制備、無(wú)感染風(fēng)險(xiǎn)、成本低且能穩(wěn)定儲(chǔ)存數(shù)月。

頂復(fù)門寄生蟲(chóng)微線體蛋白中的頂膜抗原（AMA1）近年來(lái)成為研究熱點(diǎn)，該蛋白在瘧原蟲(chóng)中被首次發(fā)現(xiàn)。AMA1為Ⅰ型跨膜蛋白，在頂復(fù)門寄生蟲(chóng)（如瘧原蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)、巴貝斯蟲(chóng)、犬新孢子蟲(chóng)）中保守。近幾年多種與艾美耳球蟲(chóng)AMA1基因相關(guān)的疫苗相繼被研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)初步研究了所構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS-EtAMA1和pCAGGSEtAMA1-IFN-γ的免疫保護(hù)效果，以觀察EtAMA1的抗球蟲(chóng)效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩種真核表達(dá)質(zhì)粒對(duì)雞柔嫩艾美耳球蟲(chóng)感染均具有一定的免疫保護(hù)力。免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與免疫劑量、免疫途徑、免疫次數(shù)及間隔時(shí)間等因素有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)參考Song等[20]篩選優(yōu)化的免疫程序，采用100μg的劑量經(jīng)肌肉注射免疫，7日齡時(shí)初次免疫，14日齡加強(qiáng)免疫?？紤]到本次實(shí)驗(yàn)是對(duì)該抗原的重組基因疫苗保護(hù)力的初步探討，攻蟲(chóng)劑量為1萬(wàn)個(gè)/羽，所用卵囊為新鮮柔嫩艾美耳球蟲(chóng)卵囊。兩次免疫后攻蟲(chóng)，免疫組均可明顯減少卵囊產(chǎn)量，其中pCAGGS-EtAMA1重組質(zhì)粒組卵囊減少率為67.43%，pCAGGS-EtAMA1-IFN-γ重組質(zhì)粒組卵囊減少率為72.89%；兩免疫組較未免疫攻蟲(chóng)組在盲腸病變計(jì)分方面下降很多，差異較顯著；在相對(duì)增重方面，pCAGGS-EtAMA1重組質(zhì)粒組相對(duì)增重率為93.95%，pCAGGS-EtAMA1-IFN-γ重組質(zhì)粒組相對(duì)增重率為97.27%，相對(duì)增重率較高，可能與攻蟲(chóng)劑量較小、飼養(yǎng)環(huán)境較好有一定關(guān)系，因?yàn)楦腥痉敲庖呓M的相對(duì)增重也達(dá)到了85.69%。Hoan等[21]用布氏艾美耳球蟲(chóng)（E. brunetti）AMA1（EbAMA1）基因DNA疫苗pVAX1-EbAMA1和AMA1重組蛋白疫苗進(jìn)行的同源攻蟲(chóng)免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)顯示，pVAX1-EbAMA1組的卵囊減少率為74.55%，AMA1重組蛋白組的卵囊減少率為47.74%，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。

真核表達(dá)載體pCAGGS含有雞的β-actin啟動(dòng)子和CMV增強(qiáng)子，被廣泛應(yīng)用于DNA疫苗的研制，已有研究[22-23]證明其有很高的表達(dá)效率。本研究采用的真核表達(dá)載體是張樹(shù)梅等[24]在pCAGGS載體的基礎(chǔ)上改造的載體，增加了SV40啟動(dòng)子和單皰疹病毒（HSV）TK基因的polyA序列，還有內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列（IRES），增加了兩個(gè)克隆位點(diǎn)。其中一個(gè)克隆位點(diǎn)位于SV40強(qiáng)啟動(dòng)子和HSV-TK-polyA終止序列之間，本研究在這個(gè)克隆位點(diǎn)插入雞細(xì)胞因子IFN-γ基因。AMA1基因則插入到原有的多克隆位點(diǎn)，在CMV增強(qiáng)子和雞β-actin啟動(dòng)子的調(diào)控下進(jìn)行高效表達(dá)。本研究中pCAGGS-EtAMA1-IFN-γ重組質(zhì)粒組的免疫效果，無(wú)論從卵囊減少率、盲腸病變記分還是相對(duì)增重率上，都要優(yōu)于pCAGGS-EtAMA1重組質(zhì)粒組，只是在相對(duì)增重率上兩者差異不顯著。這進(jìn)一步說(shuō)明雞IFN-γ與疫苗連用可提高宿主自身的免疫應(yīng)答能力和疫苗的免疫保護(hù)效果。

綜上所述，本研究評(píng)價(jià)了用EtAMA1基因的兩種真核表達(dá)質(zhì)粒免疫雞群后，對(duì)雞柔嫩艾美耳球蟲(chóng)感染的保護(hù)效果，為深入研究EtAMA1基因的功能和開(kāi)發(fā)球蟲(chóng) DNA疫苗奠定了基礎(chǔ)。