譚賽娟，彭華保，陳虹亮

(南華大學(xué)附屬郴州市第一人民醫(yī)院新生兒科，湖南 郴州 423000)

肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae, Spn)為革蘭陽性雙球菌，是兒童鼻咽部常見的定值菌，屬于條件致病菌。2012年，據(jù)WHO報道發(fā)達(dá)國家兒童鼻咽部肺炎鏈球菌攜帶率為27%，發(fā)展中國家最高超過85%[1]。嬰幼兒、老年人及免疫缺陷者是Spn的易感人群。Spn常引起社區(qū)獲得性肺炎、中耳炎、腦膜炎、菌血癥等多種感染性疾病。自耐青霉素的Spn發(fā)現(xiàn)以來，耐β-內(nèi)酰胺類藥物的流行引起眾多學(xué)者的關(guān)注。

近年來Spn不敏感率明顯降低，但在臨床中分離菌對常用抗菌藥物的耐藥率仍呈增長趨勢。隨著Spn對青霉素耐藥性的提高，極大程度地影響了非青霉素β-內(nèi)酰胺類抗生素的使用，從而使得對非青霉素β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥性逐漸升高。2013年美國疾控中心發(fā)表的報告顯示常見的非青霉素β-內(nèi)酰胺類抗生素對Spn的耐藥率分別為：頭孢菌素類：<1%～29.9%，其中頭孢呋辛29.9%、頭孢曲松11.7%、頭孢洛林<1%；碳青霉烯類：亞胺培南：23.8%[2]。由此可見，Spn對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的增加已經(jīng)嚴(yán)重危害人類健康。因此，本文從以下幾個方面綜述Spn對β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥機(jī)制。

1 產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶

β-內(nèi)酰胺類抗生素最顯著的結(jié)構(gòu)特征是含有一個β-內(nèi)酰胺環(huán)，該環(huán)由三個碳原子和一個氮原子組成，與一個噻唑烷環(huán)相連。β-內(nèi)酰胺酶能夠在抗生素作用于靶點(diǎn)之前水解β-內(nèi)酰胺環(huán)中的酰胺鍵，從而使其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，β-內(nèi)酰胺類抗生素失去活性[3]。β-內(nèi)酰胺酶廣泛分布于革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌中，根據(jù)氨基酸序列可分為：A、B、C和D四個大類，A、C和D類的活性位點(diǎn)是絲氨酸殘基，稱為絲氨酸β-內(nèi)酰胺酶(Serine-β-lactamases, SBLs)；B類催化作用依賴一個或兩個金屬酶鋅離子，因此稱為金屬-β-內(nèi)酰胺酶(Metallo-β-lactamases, MBLs)。SBLs和MBLs是β-內(nèi)酰胺酶的主要組成部分[4]。2009年，印度新德里首次報道金屬β-內(nèi)酰胺酶(New Delhi Metallo-β-lactamase, NDM)幾乎可以滅活所有β-內(nèi)酰胺類抗生素，包括青霉素類、頭孢菌素類和碳青霉烯類抗生素及臨床上可用的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，如克拉維酸、舒巴坦、他唑巴坦[5]，2016年，Chang等人[3]在Spn中分離出一株鏈球菌含有L-抗壞血酸6-磷酸乳糖酶，該蛋白酶具有金屬-β-內(nèi)酰胺酶活性。在Spn中至今還未發(fā)現(xiàn)NDM，但不能否認(rèn)其存在的可能性。研究報道，編碼β-內(nèi)酰胺酶的基因主要有TEM，基因型有TEM-129和TEM-1，這些基因不僅可以通過染色體介導(dǎo)，還能由質(zhì)粒介導(dǎo)傳播[5]。由此可見，β-內(nèi)酰胺酶在細(xì)菌之間易相互傳播，導(dǎo)致微生物對β-內(nèi)酰胺類抗生素廣泛耐藥。在世界范圍內(nèi)，產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶菌株的發(fā)病率呈快速上升趨勢?，F(xiàn)已知的抑制SBLs主要有克拉維酸、舒巴坦、他唑巴坦和阿維巴坦，但還沒有批準(zhǔn)使用的MBLs抑制劑[6]，故超級耐藥細(xì)菌一般是產(chǎn)MBLs的細(xì)菌[7]。

2 基因位點(diǎn)突變

2.1 青霉素結(jié)合蛋白基因位點(diǎn)突變

青霉素結(jié)合蛋白(penicillin-binding proteins, PBPs)是位于細(xì)菌細(xì)胞膜上的膜蛋白，能與青霉素共價結(jié)合而被稱為青霉素結(jié)合蛋白。PBPs是一類參與細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖生物合成最重要的酶，包括轉(zhuǎn)肽酶、羧肽酶、內(nèi)肽酶。PBPs是細(xì)菌保持正常形態(tài)及功能的必需條件，PBPs的數(shù)量、種類或與抗生素的親和力發(fā)生變化時，會影響細(xì)菌的細(xì)胞形態(tài)及其對抗生素的敏感性。

Spn共有6種PBPs，分別為PBP1a、PBP1b、PBP2a、PBP2x、PBP2b和PBP3，是β-內(nèi)酰胺類抗生素的作用靶點(diǎn)。β-內(nèi)酰胺類抗生素通過β-內(nèi)酰胺環(huán)中的羧基競爭性地與Spn細(xì)胞壁上PBPs中的絲氨酸羥基共價結(jié)合形成絲氨酸脂，使Spn細(xì)胞壁肽聚糖合成相關(guān)酶缺乏，從而干擾細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，改變細(xì)胞壁的通透性，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞腫脹、變形，最后死亡，達(dá)到殺滅細(xì)菌的作用[8]。Spn細(xì)胞壁上的PBPs基因發(fā)生突變時，β-內(nèi)酰胺類抗生素與PBPs的親和力明顯降低，兩者之間不能共價結(jié)合，導(dǎo)致Spn對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥。Spn對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥，主要與PBP2x、PBP1a、PBP2b基因突變有關(guān)，一般單獨(dú)的PBPs基因突變只會導(dǎo)致低水平耐藥，PBP2x、PBP2b基因突變是β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥最常見的類型，PBP1a基因突變可導(dǎo)致高水平耐藥。2018年，Diawara I等[9]發(fā)現(xiàn)PBPs序列的多樣性程度與β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥性的增加呈正相關(guān)。此外，F(xiàn)iher等[10]發(fā)現(xiàn)某些革蘭氏陽性球菌，如肺炎鏈球菌、腸球菌和金黃色葡萄球菌等，它們的細(xì)胞壁肽聚糖結(jié)構(gòu)相似，且體外能夠在功能上交換肽聚糖生物合成途徑，選擇不同的PBPs機(jī)制以獲得對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥，使得細(xì)菌之間對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥性相互影響。

2.2 非青霉素結(jié)合蛋白基因位點(diǎn)突變

非青霉素結(jié)合蛋白基因主要包括MurMN、PdgA(肽聚糖GlcNAc脫乙?；?、CpoA(糖基轉(zhuǎn)移酶)、CiaH(組氨酸蛋白激酶)基因。Filipe SP等[11]研究發(fā)現(xiàn)，MurMN基因編碼的NurM和MurN蛋白可調(diào)控肺炎球菌肽聚糖中支鏈muropeptides的合成，其活性決定支鏈muropeptides的數(shù)量，MurMN在青霉素耐藥Spn中的過度表達(dá)保護(hù)細(xì)菌免受青霉素的殺菌作用，使細(xì)胞耐受青霉素，對青霉素耐藥。MurMN基因突變對β-內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生耐藥，需要與其他基因形成聯(lián)合機(jī)制才能發(fā)揮作用。Schweizer I等[12]研究發(fā)現(xiàn)，MurM基因突變后會編碼一種參與合成支鏈肽聚糖的轉(zhuǎn)移酶，使Spn對β-內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生高水平的耐藥。PdgA、CpoA基因突變也與Spn對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥相關(guān)，但其作用機(jī)制尚不清楚。CiaH基因突變后，對各種細(xì)胞壁抑制劑所致的早、晚期細(xì)胞溶解具有較好的抵抗作用，因此，可認(rèn)為肺炎鏈球菌CiaH基因突變對β-內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生耐藥性，該突變常出現(xiàn)在實驗室突變株中，在臨床株中較為少見。

3 共生鏈球菌

共生鏈球菌是指定植于人類口腔、皮膚、腸道和上呼吸道等的共生微生物群，常見的類型有Spn、米氏鏈球菌(S.mitis)、口腔鏈球菌(S.oralis)。研究發(fā)現(xiàn)β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥相關(guān)的鏈球菌是Spn對β-內(nèi)酰胺抗生素耐藥的基因儲存庫[13]。β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥相關(guān)的幾種氨基酸改變，在其他共生鏈球菌中也發(fā)生了相應(yīng)的改變，共生鏈球菌B6是種高水平的β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥和多重耐藥菌株，其染色體編碼2100多個基因，與細(xì)菌耐藥機(jī)制密切相關(guān)。Spn和共生鏈球菌的耐藥性進(jìn)化主要涉及兩個步驟：第一，選擇PBP基因點(diǎn)突變的抗藥性共生鏈球菌；第二，通過同源重組將這些抗性基因的一部分轉(zhuǎn)移到合適的Spn，這與通常從米氏鏈球菌和口腔鏈球菌到Spn的基因單向轉(zhuǎn)移是一致的[14]。MurE基因是從口腔鏈球菌到Spn對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥性轉(zhuǎn)移的決定因素[15]，產(chǎn)生耐藥鏈球菌的絕大多數(shù)基因，在米氏鏈球菌中可以被證實[16]。Shelyakin PV等[17]認(rèn)為，鏈球菌屬的成員具有高度動態(tài)、開放的全基因組，這可能賦予它們抗生素耐藥傳播的能力。

4 自溶素濃度、活性的降低

自溶素(Autolysin, Lyt)是細(xì)菌自身產(chǎn)生的可降解細(xì)菌細(xì)胞壁的內(nèi)源性蛋白水解酶，也稱細(xì)胞壁水解酶，主要參與細(xì)菌自溶、自相殘殺和青霉素誘導(dǎo)的溶解，常見的細(xì)胞壁水解酶有：LytA、LytB、LytC和磷酰膽堿酯酶。Kim GL等[18]發(fā)現(xiàn)Spn在生長進(jìn)入穩(wěn)定期后能觀測到大量細(xì)菌自溶。LytA，即N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰氨酶，是一種重要的毒力因子，在Spn使用β-內(nèi)酰胺類抗生素后的細(xì)菌溶解中起基礎(chǔ)生物學(xué)作用，也是Spn所特有、自溶活性最強(qiáng)、研究較為深入的一種自溶素，它是通過特異性作用于N-乙酰胞壁酸和肽橋之間的酰胺鍵，導(dǎo)致細(xì)胞壁肽聚糖骨架斷裂，使細(xì)胞壁坍塌，最終導(dǎo)致細(xì)胞溶解死亡。Mitchell LS等[19]報道LytA活性降低會導(dǎo)致Spn對β-內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生耐藥。Kietzman CC等[20]也發(fā)現(xiàn)當(dāng)抗菌藥物存在時，LytA通過快速清除Spn的莢膜，避免抗菌藥物的殺傷作用，其濃度、活性都影響抗菌藥物對Spn的殺傷效果，由此可見，LytA與β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥有關(guān)。

5 StkP基因的缺失或StkP磷酸化

StkP，即絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(Serine/Threonine protein Kinase)，由Spn的StkP基因編碼，StkP蛋白由一個N端激酶結(jié)構(gòu)域和一個C-末端四個青霉素結(jié)合蛋白與絲氨酸/蘇氨酸激酶連接區(qū)結(jié)構(gòu)(Penicillin-binding protein and Ser/Thr kinase-associated, PASTA)構(gòu)成，是調(diào)控Spn基因表達(dá)的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)元件，在細(xì)菌細(xì)胞毒力、細(xì)胞壁合成、細(xì)胞生長和細(xì)胞分裂中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[21]。StkP和PhpP(蛋白磷酸酶)是一對信號偶聯(lián)物，PhpP可以調(diào)節(jié)StkP活性，也可以特異性地對StkP底物進(jìn)行去磷酸化[22]。StkP作用靶點(diǎn)是參與肽聚糖生物合成第一步的磷酸葡萄糖胺變位酶GlmM，Dias R等[23]首先發(fā)現(xiàn)StkP與PBP突變無關(guān)的青霉素耐藥有關(guān)。Huang YY等[24]證實β-內(nèi)酰胺類抗生素可作為環(huán)境信號分子，肺炎鏈球菌StkP是感知β-內(nèi)酰胺類抗生素的信號傳感激酶，具有識別并結(jié)合β-內(nèi)酰胺類抗生素的能力，當(dāng)StkP基因敲除后，該Spn對β-內(nèi)酰胺類抗生素高度耐藥。此外，其課題組還發(fā)現(xiàn)當(dāng)肺炎鏈球菌的phpP基因敲除后，使得肺炎鏈球菌的StkP磷酸化，也會產(chǎn)生與PbPs無關(guān)的β-內(nèi)酰胺類抗生素高水平耐藥。

6 耐藥基因傳遞

耐藥基因傳遞包括水平基因傳遞和垂直基因傳遞，水平基因傳遞指遺傳物質(zhì)通過受精以外的過程在生物有機(jī)體基因組中的傳遞；垂直基因傳遞則指DNA從母體到后代的傳遞。有研究發(fā)現(xiàn)，由于選擇壓力導(dǎo)致不同Spn菌株之間或Spn與其他定植微生物之間可以發(fā)生β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥基因的水平傳遞[25]。細(xì)菌之間的基因傳遞主要是通過質(zhì)粒介導(dǎo)，直接轉(zhuǎn)移至另一種細(xì)菌，許多質(zhì)粒較大，可容納多種耐藥基因，是耐藥基因轉(zhuǎn)移的理想載體[26]。迄今為止，最大的Spn基因組序列的研究也證實基因重組與抗生素耐藥性之間存在關(guān)聯(lián)，使得新產(chǎn)生的肺炎鏈球菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥性增強(qiáng)。質(zhì)粒、噬菌體、外源性DNA是基因水平傳遞的三個主要驅(qū)動因子。水平基因傳遞主要有三種機(jī)制：(1)結(jié)合：基因通過可移動基因元件(MGE)編碼結(jié)合菌毛運(yùn)動，介導(dǎo)與受體細(xì)胞的相互作用。(2)轉(zhuǎn)導(dǎo)：基因以噬菌體為媒介轉(zhuǎn)入受體菌內(nèi)。(3)轉(zhuǎn)化：即通過同源重組將外源DNA導(dǎo)入基因組[27]。抗生素耐藥基因的動員是水平轉(zhuǎn)移的第一步，也是最重要的一步[28]。Wang Q等[29]研究發(fā)現(xiàn)，銅、鎘、鉛、鋅四種重金屬對質(zhì)粒介導(dǎo)的抗生素耐藥基因結(jié)合轉(zhuǎn)移有促進(jìn)作用。糞便污染、動物濫用抗生素與人類產(chǎn)生抗生素耐藥密切相關(guān)，近年來，治療動物疾病時濫用抗生素的問題越來越嚴(yán)重，Toth AG等[30]指出在動物體內(nèi)也存在β-內(nèi)酰胺類抗生素等耐藥基因，這些基因可以通過質(zhì)?；蛉旧w介導(dǎo)的方式通過水平或垂直在動物與動物、動物與人之間傳播。

7 小結(jié)與展望

細(xì)菌對抗生素的耐藥是多種耐藥機(jī)制共同作用的結(jié)果，與抗生素的使用密切相關(guān)。明確Spn對β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥機(jī)制，可以更好的指導(dǎo)臨床合理、規(guī)范地使用抗生素，同時為更有效、更有選擇性、更有針對性的新型抗生素以及酶抑制劑的研發(fā)提供理論依據(jù)。眾多研究報道，PBPs基因突變是至今研究較為深入的Spn耐藥機(jī)制之一，對產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶Spn研究也越來越引起國內(nèi)外學(xué)者的高度關(guān)注，SBLs抑制劑已較為成熟地運(yùn)用于臨床，近幾年發(fā)現(xiàn)環(huán)硼酸鹽對MBLs具有抑制作用，但處于實驗階段，需要進(jìn)一步臨床研究。如何有效地運(yùn)用細(xì)菌耐藥機(jī)制研發(fā)新的抗菌藥物、開發(fā)新型疫苗，控制耐藥現(xiàn)狀、阻斷Spn及其相關(guān)疾病的傳播等一系列科學(xué)問題，都需要進(jìn)一步探究。