苗振立 李 偉

子宮內(nèi)膜異位癥近年來的發(fā)病率明顯上升，常常導(dǎo)致不孕、慢性盆腔痛、性交痛、肛門墜痛、痛經(jīng)及月經(jīng)不調(diào)等等癥狀，其在形態(tài)學(xué)上呈良性表現(xiàn)，但在臨床行為學(xué)上具有惡性腫瘤的特點(diǎn)，如種植、侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。西醫(yī)治療采用高效孕激素或孕激素拮抗劑或促性腺激素釋放激素激動劑，但常常具有胃腸道反應(yīng)、肝功能損害及潮熱、骨質(zhì)丟失等等不良作用[1]。

中醫(yī)學(xué)把子宮內(nèi)膜異位癥歸于“痛經(jīng)”“血瘕”等癥，血瘀是其主要病機(jī)[2]。治療子宮內(nèi)膜異位癥的重要方法之一是活血化瘀軟堅散結(jié)法，其作用機(jī)理亦是目前研究熱點(diǎn)之一。桃紅內(nèi)異散是我院張會主任醫(yī)師秉承活血化瘀軟堅散結(jié)法以桃紅四物湯為基方發(fā)展而成的治療子宮內(nèi)膜異位癥的有效驗方，本實(shí)驗研究桃紅內(nèi)異散對子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠異位病灶中的mircroRNA-126表達(dá)的影響，從而為明確其作用機(jī)理奠定一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物SPF級成熟雌性未交配過的SD大鼠40只，3月齡，體質(zhì)量180～220 g，購自北京維通利華實(shí)驗動物技術(shù)有限公司，許可證編號：SCXK-(軍)2012-0004。

1.1.2 藥物桃紅內(nèi)異散藥物組成：當(dāng)歸12 g，赤芍10 g，桃仁10 g，紅花10 g，香附12 g，枳殼12 g，三棱10 g，莪術(shù)10 g，鱉甲10 g，焦山楂10 g，甘草6 g。中藥顆粒劑由江陰天江藥業(yè)有限公司提供。孕三烯酮膠囊由北京紫竹藥業(yè)有限公司有限公司生產(chǎn)。

1.1.3 試劑miRcute miRNA isolation kit(目錄號： DP501)，miRcute miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit(目錄號：KR201)，miRcute miRNA Detection Kit(SYBR Green)(目錄號：FP401)及MircroRNA-126、U6均購于天根生物科技有限公司。其中MicroRNA-126基因引物序列為ACACTCCAGCTGGGCATTATTACTTTTGG。

1.2 方法

1.2.1 模型建立及分組將大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，對40只大鼠隨機(jī)編號，采用染色法對實(shí)驗動物進(jìn)行標(biāo)記，采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)組、模型組、桃紅內(nèi)異散組、孕三烯酮組，每組10只。造模前一天在將要造模的大鼠皮下注射己烯雌酚,劑量為0.1 mg/kg,使手術(shù)時大鼠統(tǒng)一處于動情期。模型制作:將大鼠用 1 %戊巴比妥鈉按30 mg/kg劑量進(jìn)行腹腔麻醉,腹部脫毛,常規(guī)消毒、鋪巾(保持手術(shù)中的無菌條件)。于右下腹位置切開皮膚及腹壁,切口約2～3 cm,鈍鑷找到并分離出大鼠的右側(cè)子宮,在靠近輸卵管的部位,套扎約 1 cm 的一段子宮體,剪下被套扎的部分,迅速置于盛有生理鹽水的培養(yǎng)皿中。沿系膜部位剪開管狀子宮,切割成 4 mm×4 mm 大小的子宮片。在手術(shù)切口的中段,從腹肌與皮下筋膜層之間,由右向左打一隧道,將切割好的子宮片平整的置入隧道底部,使內(nèi)膜面緊貼腹肌,固定,逐層連續(xù)縫合腹部切口,常規(guī)關(guān)腹。注意觀察大鼠的呼吸、心跳,待其自然蘇醒。異位內(nèi)膜觀察:手術(shù)后每周觸摸包塊 2 次,觀察包塊有無及大小。假手術(shù)組除不進(jìn)行子宮內(nèi)膜移植外，其它操作同模型組。

1.2.2 給藥造模后4周開始給藥，共給藥4周，大鼠灌胃量為1 ml/100 g，假手術(shù)組及模型組給予0.9%氯化鈉溶液灌胃。根據(jù)文獻(xiàn)[3]中的方法進(jìn)行大鼠用藥劑量的換算(大鼠與人體的每千克體質(zhì)量劑量折算系數(shù)為6.25)，桃紅內(nèi)異散組：75 g·kg-1·d-1，孕三烯酮組0.25 g·kg-1·w-1。

1.2.3 檢測指標(biāo)及方法造模后4周，觸摸腹部包塊直徑1 cm以上，開腹觀察異位內(nèi)膜生長情況，并光鏡下觀察各移植組織病理變化，以移植組織有子宮內(nèi)膜組織的上皮細(xì)胞或間質(zhì)細(xì)胞存在為造模成功標(biāo)準(zhǔn)。模型組、假手術(shù)組、桃紅內(nèi)異散組及孕三烯酮組均存活10只。采用實(shí)時聚合酶鏈反應(yīng)檢測mircroRNA-126的表達(dá)。根據(jù)試劑盒進(jìn)行RNA提取和轉(zhuǎn)錄，按照試劑盒說明在實(shí)時PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，以U6作為內(nèi)參，分管同機(jī)進(jìn)行PCR反應(yīng)，重復(fù)試驗3次。用熒光定量PCR儀，采用2-△△CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對定量分析。

2 結(jié)果

各組中mircroRNA-126的比較：與假手術(shù)組相比，模型組 mircroRNA-126顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，桃紅內(nèi)異散組及孕三烯酮組mircroRNA-126水平顯著升高(P<0.01)；孕三烯酮組mircroRNA-126水平與桃紅內(nèi)異散組相當(dāng)(P>0.05)；提示桃紅內(nèi)異散組可有效提高異位病灶組織mircroRNA-126水平(P<0.01)，說明桃紅內(nèi)異散在改善異位病灶組織基因轉(zhuǎn)錄水平上療效顯著。見表1。

表1 各組mircroRNA-126基因轉(zhuǎn)錄水平 (只，

注：與假手術(shù)組比較，1)P<0.01；與模型組比較，2)P<0.01；與孕三烯酮組比較，3)P> 0.05

3 討論

微小RNA(microRNA，miRNA)是一龐大的高度保守的單鏈非編碼RNA家族，各家族成員由長約22 個核苷酸的內(nèi)源性單鏈非編碼型的小分子 RNA組成，其功能是通過與靶基因 mRNA 的 3＇端非翻譯區(qū)(3＇untranslated region，3 ＇UTR) 相結(jié)合，降解靶基因或者抑制靶基因翻譯而達(dá)到負(fù)性調(diào)控的作用，進(jìn)而參與調(diào)節(jié)多種生命體活動[4]。

mircroRNA-126是目前研究microRNA的熱點(diǎn)之一，由人類染色體9q34.3中EGFL7基因的第7個內(nèi)含子編碼，它能夠直接與DNA結(jié)合，從而阻止mRNA的轉(zhuǎn)錄、翻譯和降解，在不同惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中起抑癌基因或癌基因的功能,在子宮內(nèi)膜癌中也起重要作用[5～8]。mircroRNA-126還是血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)最豐富的microRNA，在整個毛細(xì)血管以及較大的血管內(nèi)皮細(xì)胞中均會表達(dá)，通過影響不同的轉(zhuǎn)錄因子從而控制血管生成[9]。有研究發(fā)現(xiàn)mircroRNA-126表達(dá)與血管內(nèi)皮黏附因子-1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，mircroRNA-126低表達(dá)時可增高血管內(nèi)皮黏附因子-1表達(dá)水平而促使白細(xì)胞粘附于血管內(nèi)皮細(xì)胞并參與新生血管的生成[10]，且有研究表明mircroRNA-126可結(jié)合在VEGF-A mRNA的3ˊUTR區(qū)域，抑制靶基因SPRED1和PIK3R2，通過絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和磷脂酰肌醇三激酶(PI3K)途徑抑制 VEGF 號徑，從而下調(diào)血管生長因子VEGF的表達(dá)水平，而血管生長因子VEGF可通過激活MAP激酶途徑調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，遷移和黏附，加強(qiáng) VEGF基因的表達(dá)對于血管發(fā)生和維持血管完整性是非常必要的[11,12]。

血管生成是子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病機(jī)制的基礎(chǔ)，子宮內(nèi)膜異位癥病灶周圍的血管化程度是影響內(nèi)膜細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移的重要因素，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是在血管生成中占首要地位的促血管生長因子。VEGF家族成員包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E及胎盤生長因子(PIGF)，Moety 等通過檢測了61例子宮內(nèi)膜異位癥患者與51例健康婦女的血清和腹腔液中VEGF-A的濃度，發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位癥患者的血清中VEGF-A濃度 [(2158.37±1026.87)pg/ml]顯著高于健康婦女[(286.83±77.07)pg/ml]，且腹腔液中的 VEGF-A 的濃度[(3174.67±2857.60)pg/mL]與健康婦女 [(214.30±68.74)pg/mL]比較，差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)[13]。而子宮內(nèi)膜異位癥患者血清中VEGF水平顯著提高，可促進(jìn)異位內(nèi)膜細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、黏附和生長，進(jìn)而破壞周圍組織，導(dǎo)致病情加重；且有研究者發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位癥的嚴(yán)重程度與患者血清中VEGF的含量成正比，r-AFS分期為Ⅲ ～ Ⅳ期患者血清VEGF 含量明顯高于Ⅰ～Ⅱ期患者[14,15]。

中醫(yī)認(rèn)為“瘀血阻滯胞宮、沖任”是子宮內(nèi)膜異位癥的基本病機(jī)，而瘀之形成，又與臟腑功能失調(diào)、氣血失調(diào)及感受外邪等因素相關(guān)。故本病治療須堅持以“活血化瘀”為主要方法，同時根據(jù)“血瘀”之因，輔以相應(yīng)的理氣、行氣、消癥諸法，當(dāng)于活血化瘀之中，配伍軟堅散結(jié)消癥之品。

桃紅內(nèi)異散以桃紅四物湯為基礎(chǔ)加減，去熟地黃，加香附、枳殼、三棱、莪術(shù)、鱉甲、焦山楂等組合而成；此方以祛瘀為核心，輔以理氣、行氣、消癥。方中以破血之品桃仁、紅花為君藥，力主活血化瘀。以甘溫之當(dāng)歸滋陰補(bǔ)肝、養(yǎng)血調(diào)經(jīng);芍藥養(yǎng)血和營，以增補(bǔ)血之力；川芎、焦山楂活血行氣、祛瘀止痛，尤其川芎不僅養(yǎng)血活血，更能行血中之氣，增強(qiáng)逐瘀之力；三棱、莪術(shù)、鱉甲增強(qiáng)活血化瘀之功，破瘀消癥；諸藥為臣藥，可使瘀血祛而不傷陰血。香附、枳殼行氣止痛，為佐藥。甘草調(diào)和諸藥，為使藥。全方配伍得當(dāng)，以逐瘀活血和行氣藥物居多，使氣帥血行，更好發(fā)揮其活血逐瘀，破癥消結(jié)之力，使瘀血祛、新血生、氣機(jī)暢，化瘀止痛。

本研究表明,異位內(nèi)膜組織中microRNA-126顯著降低，從而可上調(diào)VEGF的表達(dá)，促進(jìn)異位內(nèi)膜組織中的微血管生成與異位內(nèi)膜的轉(zhuǎn)移、黏附與生長。而桃紅內(nèi)異散可顯著上調(diào)異位內(nèi)膜組織中的microRNA-126的表達(dá)，從而可抑制VEGF的表達(dá)，減少異位內(nèi)膜組織中微血管的生成及異位內(nèi)膜細(xì)胞的生長，這可能為桃紅內(nèi)異散的作用機(jī)理之一。桃紅內(nèi)異散對異位內(nèi)膜中microRNA-126的影響與孕三烯酮無統(tǒng)計學(xué)差異，這表明桃紅內(nèi)異散在治療子宮內(nèi)膜異位癥中的效果與孕三烯酮相近，可作為一種有效的治療子宮內(nèi)膜異位癥驗方，尤其適用于不耐受孕三烯酮不良作用的患者。