李輝莉 方廠云 蘇征

1.廈門醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院兒童口腔科 廈門 361003；2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院口腔科 長(zhǎng)沙 410078；3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京口腔醫(yī)院牙體牙髓病科 北京 100050

目前研究[1]已證實(shí)，檳榔是世界第四廣泛流行的精神成癮物質(zhì)，僅次于咖啡因、尼古丁及酒精，在亞洲地區(qū)，如中國(guó)湖南、臺(tái)灣地區(qū)及印度流行范圍較廣，并有擴(kuò)展趨勢(shì)。大量調(diào)查[2-3]顯示咀嚼檳榔不僅與口腔疾病緊密聯(lián)系，如：口腔黏膜下纖維性變（oral submucous fibrosis，OSF）、白斑、口腔癌，還與食道癌、肝腎疾病等有關(guān)。檳榔含有大量生物堿，其中檳榔堿是其主要成分。大量研究[4-5]證實(shí)，檳榔堿重要的致病機(jī)制為影響細(xì)胞增殖周期、刺激細(xì)胞分化、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但也有研究[6-7]觀察到檳榔堿對(duì)某些特定細(xì)胞有促進(jìn)其細(xì)胞增殖及遷移的作用。本研究以體外原代培養(yǎng)的頰黏膜成纖維細(xì)胞為對(duì)象，觀察不同濃度檳榔堿導(dǎo)致頰黏膜成纖維細(xì)胞增殖、移行能力及微絲形態(tài)的變化，為進(jìn)一步探明OSF病理途徑改變提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

檳榔堿粉劑、改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco’s modification of Eagle’s medium，DMEM）、甲噻唑四唑氮（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）（Sigma公司，美國(guó)），二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（北京Solarbio公司），異硫氰酸熒光素（f l uorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記鬼筆環(huán)肽（Fluka公司，瑞士），細(xì)胞刮刀（Greiner bio-one公司，德國(guó)），6、24、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（Costar公司，美國(guó)），激光共聚焦掃描顯微鏡（ZEISS公司，德國(guó)）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)鑒定及實(shí)驗(yàn)分組

經(jīng)志愿者知情同意后，上皮組織取自無(wú)煙酒及咀嚼檳榔習(xí)慣的健康自愿者頰黏膜，組織塊法培養(yǎng)頰黏膜成纖維細(xì)胞，細(xì)胞免疫組織化學(xué)法染色進(jìn)行細(xì)胞鑒定。

按照培養(yǎng)液檳榔堿的含量分為6組：對(duì)照組成纖維細(xì)胞加入含10%胎牛血清DMEM完全培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組成纖維細(xì)胞分別加入含5、10、20、40、80 μg·mL-1檳榔堿的10%胎牛血清DMEM完全培養(yǎng)液。

1.3 檳榔堿對(duì)頰黏膜成纖維細(xì)胞增殖的影響

MTT比色法：將第4代成纖維細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液后，以每毫升1×104的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入200 μL細(xì)胞懸液。

置于細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸除上清液，分別加入6組培養(yǎng)液，每濃度檳榔堿設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分別在培養(yǎng)12、24、48、72 h時(shí)加入MTT溶液（5 g·L-1，pH=7.4）20 μL繼續(xù)孵育4 h，棄上清液。每孔加150 μL DMSO液10 min，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)490 nm波長(zhǎng)處各孔吸光度值。

1.4 檳榔堿對(duì)頰黏膜成纖維細(xì)胞遷移的影響

劃痕試驗(yàn)：將第4代成纖維細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液后，以每毫升2.5×104的密度接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入2 mL細(xì)胞懸液。置細(xì)胞培養(yǎng)板于細(xì)胞培養(yǎng)箱24 h，單層細(xì)胞層融合至90%后換不含血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，細(xì)胞刮刀在板底制造橫行無(wú)細(xì)胞帶，寬度為4 mm，磷酸緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）沖洗培養(yǎng)板2遍，每孔分別加入6組培養(yǎng)液，每個(gè)濃度組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。12 h后在光學(xué)顯微鏡下（× 200）觀察，每孔隨機(jī)抽取10個(gè)視野，計(jì)算遷移入劃痕區(qū)的細(xì)胞數(shù)量，分別取各組數(shù)量平均值。

1.5 檳榔堿對(duì)微絲形態(tài)及分布的影響

將第4代成纖維細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液后，以每毫升1×105的密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中（置有多聚賴氨酸的滅菌蓋玻片），每孔加入2 mL細(xì)胞懸液。置于細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，吸除上清液，PBS沖洗2遍，加入6組培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。

取出細(xì)胞爬片后，使用4%的多聚甲醛固定15 min，PBS沖洗2次，每次3 min，0.2%聚乙二醇辛基苯基醚破膜10 min，加入FITC標(biāo)記鬼筆環(huán)肽工作液（5 μg·mL-1，含1% DMSO）每孔50 μL，在室溫下于濕盒內(nèi)染色40 min，再用PBS沖洗2次，每次5 min，50%緩沖甘油封固。激光共聚焦掃描顯微鏡觀察各組細(xì)胞，鏡下顯示綠色熒光（激發(fā)波長(zhǎng)為494 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為518 nm）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，單因素方差分析比較多組之間差異，Dunnett t檢驗(yàn)比較兩組間差異，P＜0.05記為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞鑒定結(jié)果

光鏡下可見(jiàn)成纖維細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形或星形，伸出細(xì)長(zhǎng)胞質(zhì)突，為典型成纖維細(xì)胞形態(tài)。免疫組織化學(xué)法染色：抗波形絲蛋白染色呈陽(yáng)性代表細(xì)胞具有成纖維細(xì)胞特征，抗角蛋白染色陰性顯示未見(jiàn)上皮細(xì)胞成分，證實(shí)細(xì)胞為成纖維細(xì)胞（圖1、2）。

2.2 不同濃度檳榔堿對(duì)頰黏膜成纖維細(xì)胞增殖能力的改變

各濃度檳榔堿作用頰黏膜成纖維細(xì)胞12 h，相對(duì)于對(duì)照組來(lái)說(shuō)，MTT值的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。作用24 h后，濃度為10、20 μg·mL-1的檳榔堿促進(jìn)了細(xì)胞的增殖（P＜0.05），而40、80 μg·mL-1的檳榔堿則抑制細(xì)胞增殖（P＜0.05）；作用48 h后，濃度為5、10 μg·mL-1組的檳榔堿促進(jìn)細(xì)胞增殖（P＜0.05），而20、40、80 μg·mL-1的檳榔堿組明顯抑制細(xì)胞增殖（P＜0.05）；作用72 h后，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖均受到了抑制（P＜0.05）（表1、圖3）。

圖1 抗角蛋白陰性 免疫組織化學(xué)染色 × 100Fig 1 Negative expression of anti-keratin immunohistochemical staining × 100

圖2 抗波形絲蛋白陽(yáng)性 免疫組織化學(xué)染色 × 100Fig 2 Positive expression of anti-fibroin immunohistochemical staining × 100

表1 不同濃度檳榔堿對(duì)頰黏膜成纖維細(xì)胞增殖活性的影響Tab 1 Effect of arecoline on the proliferation of human buccal mucosal fibroblasts

圖3 不同濃度檳榔堿對(duì)頰黏膜成纖維細(xì)胞增殖活性的影響Fig 3 Effect of arecoline on the proliferation of human buccal mucosal fibroblasts

2.3 檳榔堿對(duì)頰黏膜成纖維細(xì)胞遷移能力的改變

各組移行細(xì)胞數(shù)分別為：對(duì)照組（12.07±3.56）個(gè)，5 μg·mL-1組（19.47±5.58）個(gè)，10 μg·mL-1組為（21.90±8.54）個(gè)，20 μg·mL-1組為（8.23±3.43）個(gè)，40 μg·mL-1組為（5.70±2.42）個(gè)，80 μg·mL-1組為（5.27±2.63）個(gè)（圖4），各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖4 不同濃度檳榔堿對(duì)頰黏膜成纖維細(xì)胞遷移能力的影響Fig 4 Effect of arecoline on the migration of human buccal mucosal fibroblasts

2.4 檳榔堿對(duì)頰黏膜成纖維細(xì)胞微絲形態(tài)的改變

通過(guò)激光共聚焦掃描顯微鏡，成纖維細(xì)胞微絲呈現(xiàn)綠色熒光。對(duì)照組頰黏膜成纖維細(xì)胞呈現(xiàn)多角形或星形，有長(zhǎng)短不一偽足突出，應(yīng)力纖維呈束狀平行排列，形成網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)，布滿整個(gè)胞漿、伸入偽足中（圖5A）。5、10 μg·mL-1檳榔堿孵育頰黏膜成纖維細(xì)胞24 h，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，極性增強(qiáng)，胞體寬大，偽足明顯增長(zhǎng)，應(yīng)力纖維粗大，沿細(xì)胞及偽足長(zhǎng)軸平行排列（圖5B、C）。20、40、80 μg·mL-1檳榔堿實(shí)驗(yàn)組，隨著濃度增大，細(xì)胞形態(tài)變圓形或橢圓形，偽足縮短或消失，應(yīng)力纖維紊亂，部分缺如。大量斑點(diǎn)樣熒光染色亮點(diǎn)聚集于細(xì)胞皮層（圖5D、E、F）。

3 討論

OSF是一種以膠原代謝紊亂為特征的纖維化疾病，成纖維細(xì)胞是病變過(guò)程中主要細(xì)胞成分，具有增殖，合成分解、黏附、遷移等功能。近年來(lái)，關(guān)于檳榔堿影響成纖維細(xì)胞增殖活性存在較多不同的說(shuō)法：有學(xué)者[8-10]證實(shí)不同濃度的檳榔堿可濃度依賴性抑制牙齦、牙周、頰黏膜成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖及膠原合成；也有學(xué)者[11]發(fā)現(xiàn)較低濃度的檳榔堿在較短的持續(xù)時(shí)間內(nèi)，對(duì)成纖維細(xì)胞具有促進(jìn)增殖的作用；還有研究[12]證實(shí)，檳榔堿對(duì)人成纖維細(xì)胞在72 h內(nèi)增殖并無(wú)明顯抑制。檳榔堿改變成纖維細(xì)胞增殖能力的差異來(lái)自于藥物濃度區(qū)間、作用時(shí)間、細(xì)胞亞群、細(xì)胞分化程度的差異。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)檳榔堿的研究多集中于高濃度區(qū)間檳榔堿對(duì)細(xì)胞的毒性研究。Cox等[13]在檢測(cè)健康志愿者咀嚼檳榔時(shí)，唾液檳榔堿含量均超過(guò)10 μg·mL-1，最高濃度介于5.66～97.39 μg·mL-1，且在45 min之內(nèi)降到1 μg·mL-1。故本研究所選取實(shí)驗(yàn)組檳榔堿濃度主要集中于10～80 μg·mL-1，更具有合理性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：檳榔堿作用12 h，各組細(xì)胞未發(fā)生明顯增殖，推測(cè)細(xì)胞未達(dá)到倍增時(shí)間；72 h后，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖均呈明顯抑制狀態(tài)，應(yīng)為檳榔堿長(zhǎng)時(shí)間作用造成細(xì)胞毒性累積所致細(xì)胞凋亡；24及48 h細(xì)胞增殖趨勢(shì)相似，低濃度組細(xì)胞增殖率輕微升高、高濃度組細(xì)胞增殖率明顯降低。提示在纖維化病變?cè)缙?，檳榔堿促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖及膠原合成，造成膠原堆積；晚期細(xì)胞毒性導(dǎo)致成纖維細(xì)胞數(shù)量減少，吞噬降解膠原能力下降，進(jìn)一步加劇膠原堆積。在纖維化病變過(guò)程中，病變成纖維細(xì)胞的遷移有促進(jìn)作用[14]。OSF患者的非咀嚼摩擦區(qū)，如前庭溝、軟腭及舌底常出現(xiàn)同等程度甚至更為嚴(yán)重的纖維化病變，推測(cè)可能是由于病變成纖維細(xì)胞移行導(dǎo)致。

曾有文獻(xiàn)[10]報(bào)道，濃度大于62.4 μg·mL-1的檳榔堿可顯著抑制牙齦成纖維細(xì)胞移行能力，但對(duì)于較低濃度檳榔堿對(duì)細(xì)胞遷移的研究較少見(jiàn)。

圖5 免疫熒光染色后的細(xì)胞微絲 × 200Fig 5 The filament actin of cells after immunof l uorescence stain × 200

在遷移實(shí)驗(yàn)中，為了避免細(xì)胞增殖的影響，計(jì)算各組細(xì)胞在12 h遷移細(xì)胞數(shù)目。結(jié)果表明5、10 μg·mL-1檳榔堿可以刺激頰黏膜成纖維細(xì)胞移行，20、40、80 μg·mL-1檳榔堿明顯抑制細(xì)胞移行能力。這種改變和微絲的改變具有一致性。微絲主要由肌動(dòng)蛋白組成，廣泛存在于各類細(xì)胞。微絲通過(guò)聚合及解聚狀態(tài)的轉(zhuǎn)化，影響細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路、細(xì)胞周期及基因表達(dá)的改變，進(jìn)而影響細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、運(yùn)動(dòng)、吞噬能力[15]。已有報(bào)道[16]顯示，不同濃度檳榔堿作用肝癌細(xì)胞24 h可顯著刺激細(xì)胞形成應(yīng)力纖維，但目前檳榔堿對(duì)于成纖維細(xì)胞微絲影響的報(bào)道較少。本研究中低濃度檳榔堿可刺激微絲聚合，出現(xiàn)束狀應(yīng)力纖維；而較高濃度檳榔堿導(dǎo)致細(xì)胞變形，應(yīng)力纖維紊亂消失，細(xì)胞皮層出現(xiàn)大量熒光斑點(diǎn)，大量微絲解聚。推測(cè)成纖維細(xì)胞微絲改變可能是OSF致病途徑之一。

綜上所述，觀察到檳榔堿對(duì)頰黏膜成纖維細(xì)胞的增殖、遷移及微絲形態(tài)的影響具有雙向性，推測(cè)檳榔堿通過(guò)影響微絲狀態(tài)、數(shù)量間接導(dǎo)致成纖維細(xì)胞增殖、遷移能力發(fā)生變化，可能是OSF的致病途徑之一，但還需要進(jìn)一步研究闡明具體作用機(jī)制。