張玉晗，謝 晶

（上海海洋大學食品學院，上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海冷鏈裝備性能與節(jié)能評價專業(yè)技術服務平臺，食品科學與工程國家級實驗教學示范中心（上海海洋大學），上海 201306）

花鱸（Lateolabrax maculatus）屬魚綱（Pisces）、鱸形目（Perciforms）、鮨科（Serranidae）、常鱸亞科（Oligorinae）、花鱸屬（Lateolabrax），因其具有生長快、抗病強、營養(yǎng)豐富、味道鮮美特點，成為我國主要的養(yǎng)殖海水魚品種之一。花鱸捕撈后可以通過低溫誘導休眠的方式進行無水?；睿|生態(tài)冰溫零點溫度（臨界溫度）為4 ℃，經低溫無水?；钸\輸后，恢復常溫的魚體可回到正常狀態(tài)并存活一段時間。

VC既是一種具廣泛生理功能的營養(yǎng)素，又是一種具免疫作用的免疫調節(jié)因子，有明顯的抗感染作用，但許多硬骨魚類自身缺少合成VC的酶，必須通過飼料或食物獲得[1-2]。研究表明，花鱸幼魚、大黃魚血清溶菌酶活力隨著VC添加量的增加而升高[2-3]。姜（Zingiber officinale）性味辛、微溫，藥用其根莖，具有調節(jié)機體免疫功能的作用[4]。李曉璐等[5]將生姜液運用在脆肉鯇的活體運輸實驗中，有效地提高了其24 h運輸的存活率。溶菌酶是一種低分子質量、不耐熱的堿性蛋白，作為機體非特異免疫因子之一，其參與了機體的多種免疫反應，在機體正常防御功能和非特異免疫中具有保持機體生理平衡的重要作用[6-7]。研究表明溶菌酶的應用能極大延長海產品或水產品的保鮮期，可為貯藏、運輸等帶來諸多方便[8]。山梨糖醇分子可提高魚體表保水性，低溫下蛋白酶變性程度低，起到抗凍效果[9]。本實驗嘗試在花鱸暫養(yǎng)、運輸過程中加入保護液，然后進行模擬無水活運，考察采用保護液的?；钚鹿に噷|血液生化指標、鰓組織Na+/K+-ATPase活性、血清溶菌酶活性、免疫球蛋白M（immunoglobulin M，IgM）水平等魚體非特異性免疫能力指標的影響，將保護液包裝新工藝與傳統濕木屑包裝工藝運輸后魚體情況做對比，為升級無水活運包裝工藝提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花鱸魚購自上海蘆潮港水產品市場。挑選體質健康、無外傷、鱗片完整、大小基本一致（長40 cm）的活花鱸魚作為實驗材料。實驗用水：由經顆?；钚蕴窟^濾后曝氣的自來水和海鹽配制而成，實驗開始前的1 d配制，連續(xù)曝氣24 h后用于實驗。所制得水的性質：水溫22～23 ℃、鹽度16‰～17‰、溶解氧4～6 mg/L、pH 7.5～8.5[10]。

溶菌酶、純度98%山梨糖醇（14.7 kDa） 上海生工生物工程有限公司。

1.2 儀器與設備

LX-100VTR模擬運輸振動臺 上海魯軒儀器設備廠；SH-1000Lab-全波長酶標儀 北京宏昌信科技有限公司；5810R高速冷凍離心機 上海艾測電子科技有限公司；BS-200全自動生化分析儀 深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；乳酸測定試劑盒、ATP酶試劑盒、溶菌酶測試盒、IgM測試盒 南京建成生物工程研究所。

1.3 方法

1.3.1 花鱸魚的暫養(yǎng)

采用周期饑餓馴化花鱸[11]，喂食1 d饑餓3 d，兩周期；喂食早晚各一次，投喂魚體質量10%飼料；暫養(yǎng)水中加入VC（25、30 mg/L）[12]，CK組暫養(yǎng)水中不加VC，暫養(yǎng)密度1 尾/50 L；禁食暫養(yǎng)時間12 h；先暫養(yǎng)后冷馴化，冷水機按照3 ℃/h降溫速率將暫養(yǎng)箱中水溫從22～23 ℃降至臨界生態(tài)溫度4 ℃；此時，魚體呼吸頻率（24±3）次/min，呼吸不規(guī)律，魚體失去平衡、魚腹朝上，裂鰓，刺激反應遲鈍。

1.3.2 配制保護液G

保護液G包括：溶菌酶0.08%～0.10%（質量分數，下同）、山梨糖醇0.2%～0.4%、生姜液0.6%～1%，鹽度為16‰～17‰，pH 7.5～8.5，剩余為水。

姜液制備[5]：取栽種4 個月嫩姜洗凈、瀝干，此時的姜纖維細、味道微辣，不含較多姜辣素，姜辣素對花鱸的刺激??；帶皮用榨汁機榨汁（每千克原料加入約150 mL蒸餾水進行混合榨汁），并用200 目紗布過濾，收集姜汁，隔水加熱至沸騰，裝入帶蓋容器，放至常溫，蓋上蓋子冷卻至4 ℃，備用。

1.3.3 魚的處理與運輸

將暫養(yǎng)箱中觸摸應激反應十分微弱的魚撈出，將魚分為6 個實驗組和CK組，具體見表1，每組樣品30 條，實驗總數為210 條。CK組不添加保護液暫養(yǎng)12 h，降溫休眠后撈出，直接裝入帶有濕木屑（木屑事先放入4 ℃、鹽度16‰～17‰、pH 7.5～8.5的水中浸濕）的泡沫箱中。實驗組放入保護液G中浸漬2～3 s后，按1 條/箱放于泡沫箱內，注意用保護液涂抹魚身各部位（包括魚鰓）。然后將兩組魚裝入塑料袋內（1 箱/袋），充入氧氣（氧濃度監(jiān)測儀）80%、扎緊袋口[13]，放入振動臺上的大保溫箱內，保持4 ℃運輸溫度。

表1 暫養(yǎng)結合不同濃度保護液實驗組Table 1 Combinations of temporary culture and protective solutions

在振動臺上進行模擬運輸實驗，運輸過程：B級路面1 h（80 km/h）→A級路面5 h（100 km/h）→B級路面2 h（80 km/h）[14-15]。模擬運輸結束后，打開包裝，取出魚，放入養(yǎng)殖水中，以5 ℃/h升溫速率將水溫升至22～23 ℃喚醒（由預實驗確定），觀察喚醒過程中魚的反應并記錄喚醒結束后死亡率。

花鱸魚生理指標檢測時間點為：運輸開始0 h（暫養(yǎng)結束，未涂保護液）和運輸1、2 h和8 h（運輸結束時）及喚醒后。每個測試點隨機選取5 條魚進行指標測試。

1.3.4 樣品處理

木棒敲擊花鱸致死，稱質量并量體長，采用1 mL一次性醫(yī)用注射器（預先用1 g/100 mL肝素鈉溶液潤洗）尾部靜脈取血，采取血樣在4 ℃冰箱放置2 h后，4 ℃、10 000 r/min離心5 min制備血清，血清移入-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

魚采血后，取兩側第二鰓弓的鰓絲，用生理鹽水洗凈吸干水分，用生理鹽水配成10 mg/mL組織均漿，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取上清液-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 血液生化指標的測定

總蛋白、白蛋白、尿素、肌酐、尿酸、血糖質量濃度采用全自動生化分析儀測定，單位均為g/L。乳酸濃度采用乳酸測定試劑盒測定，單位為nmol/L。

1.3.6 組織指標測定

鰓Na+/K+-ATPase活力采用ATP酶試劑盒定，單位為U/mg。

1.3.7 血液非特異性免疫能力指標測定

血清溶菌酶、IgM質量濃度分別采用溶菌酶測試盒、IgM測試盒測定。

1.4 數據處理與分析

應用SPSS 19.0軟件對實驗數據進行統計分析，結果以 ±s表示，顯著性分析采用Duncan多重比較法，P＜0.05表示顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 不同處理對花鱸無水活運過程中血液生化指標的影響

2.1.1 不同處理對花鱸無水活運過程中血清總蛋白、白蛋白質量濃度的影響

表2 不同處理對花鱸無水活運過程中血清中總蛋白質量濃度的影響Table 2 Effects of different treatments on serum total protein concentration during waterless transportation of Lateolabrax maculatus

表3 不同處理對花鱸無水活運過程中血清中白蛋白質量濃度的影響Table 3 Effects of different treatments on serum albumin concentration during waterless transportation of Lateolabrax maculatus

在生態(tài)冰溫無水?；钸^程中，花鱸血清中的總蛋白、白蛋白質量濃度能準確反映機體蛋白質的吸收與代謝，以及肝功能的代謝情況。白蛋白由肝臟合成，在血液中起著載體的作用，與血液中大部分水分、膽紅素、尿酸、鈣等結合而進行運送，與代謝、營養(yǎng)關系密切，當長期處于不良狀態(tài)時，白蛋白含量會顯著下降[16]。由表2、3可知，運輸0 h，CK組花鱸血清中的總蛋白和白蛋白質量濃度顯著低于各保護液處理組（P＜0.05），這說明暫養(yǎng)水中加入VC有助于提高花鱸肝功能，降低魚類的應激反應，其中30 mg/L添加量效果明顯。喚醒后與保活過程中相比，半數以上保護液使用組花鱸血清中的總蛋白和白蛋白質量濃度沒有顯著性差異（P＜0.05），表明包裝運輸前對魚身涂抹保護液可維持花鱸魚體代謝穩(wěn)定。C2G2保護液使用組花鱸在?；钸\輸過程中血清中的總蛋白和白蛋白質量濃度保持穩(wěn)定，且高于其他保護液處理組。喚醒后，花鱸由于處于無水、缺氧狀態(tài)，總蛋白和白蛋白質量濃度都顯著下降（P＜0.05）。與?；钸\輸8 h后相比，魚體與喚醒后（水中復蘇后）總蛋白和白蛋白質量濃度變化不顯著（P＜0.05），表明運輸結束后，魚體肝功能不能在短時間內恢復正常。

2.1.2 不同處理對花鱸無水活運過程中血清尿素、肌酐、尿酸質量濃度的影響

表4 不同處理對花鱸無水活運過程中血清尿素質量濃度的影響Table 4 Effects of different treatments on serum urea concentration during waterless transportation of Lateolabrax maculatus

表5 不同處理對花鱸無水活運過程中血清肌酐質量濃度的影響Table 5 Effects of different treatments on serum creatinine concentration during waterless transportation of Lateolabrax maculatus

表6 不同處理對花鱸無水活運過程中血清尿酸質量濃度的影響Table 6 Effects of different treatments on serum uric acid concentration during waterless transportation of Lateolabrax maculatus

尿素、肌酐、尿酸水平是反映腎功能代謝情況的重要指標，尿素是氮化合物代謝的產物，也是維持血液滲透壓的主要成分[17]。由表4可看出，CK組血液中尿素水平偏高，使用保護液之后各使用組的尿素水平顯著下降（P＜0.05）。肌酐水平是腎臟機能的一個重要指標，腎臟機能發(fā)生障礙時，血液中肌酐含量會升高。由表5可知，除CK、C1G1、C1G2組外，花鱸無水活運過程中肌酐水平隨運輸時間延長而下降，喚醒后有所回升，?；钸^程中各組肌酐水平有所差異，C2G2保護液使用組肌酐水平未見明顯上升。腎功能減退時尿酸質量濃度會升高，表6顯示CK組尿酸水平在?；钸\輸過程中顯著升高（P＜0.05），添加保護液后尿酸水平上升速率減緩，喚醒后回落，C2G2組尿酸水平變化不明顯，說明在保活運輸中鰓、腎功能部分受到抑制。CK組血清尿素、肌酐、尿酸水平持續(xù)遞增，運輸8 h時出現最高值，表明隨運輸時間延長代謝廢物在血液中有積累，長時間的無水環(huán)境造成花鱸體內代謝廢物無法及時排出，這是花鱸不能長時間無水運輸的重要因素之一。使用保護液后，運輸過程也會導致3 個指標數值有所上升，其中8 h較高，喚醒后有所下調，表明花鱸在低溫無水條件下保活代謝廢物會在體內累積，并在喚醒后得到改善，但還不能確定魚體是否因此受到不可逆損傷[18]。使用保護液可有效降低花鱸鰓、腎功能損傷，綜合比較下C2G3組?；钚Ч詈?，保護液在花鱸體表形成一層保護膜的同時也有利于魚體將代謝廢物排出，保護液起到促進魚體與外界物質交換作用。

2.1.3 不同處理對花鱸無水活運過程中血清中血糖、乳酸水平的影響

表7 不同處理對花鱸無水活運過程中血清血糖質量濃度的影響Table 7 Effects of different treatments on serum glucose concentration during waterless transportation of Lateolabrax maculatus

表8 不同處理對花鱸無水活運過程中血清乳酸濃度的影響Table 8 Effects of different treatments on the concentration of lactate in serum during the waterless transport of Lateolabrax maculatus

血糖是魚體生理活動所需能量的來源之一。從表7中可看出，CK組血糖質量濃度在整個?；钸\輸0～2 h上升可能是因為應激反應；除C2G1、C2G3組外，各處理組運輸8 h后喚醒過程中血糖質量濃度下降可能是能量消耗造成的，徐中平[19]發(fā)現低溫處理后的星斑川鰈血糖濃度顯著升高。運輸0 h時，CK組與各保護液使用組相比血糖質量濃度差異不顯著（P＞0.05），這表明暫養(yǎng)過程中添加VC對花鱸血糖水平影響不大。使用保護液后，運輸1 h與0 h相比，血糖水平降低，運輸時間延長血糖水平還是會出現因積累顯示較高水平，使用保護液已經很大程度降低了花鱸運輸應激。

乳酸是葡萄糖在無氧條件下發(fā)生酵解提供能量時的產物，肌肉產生的乳酸大部分會進入血液，而乳酸濃度增加會對血液中血紅蛋白運輸氧的能力產生影響，導致血液最大氧結合量減少。從表8可以看出，各處理組血清中乳酸濃度在運輸2 h內顯著上升（P＜0.05），血液中血糖濃度上升進而造成了肌肉乳酸濃度上升，導致魚體供氧量減少。此結果與戴志遠等[20]研究的紫貽貝無水?；钸^程中乳酸濃度變化一致，這可能也是限制?；顣r間進一步延長的重要因素之一。與CK組相比，各?；钜禾幚斫M在運輸8 h時乳酸積聚量減少。運輸0 h，CK組與各保護液使用組相比乳酸濃度差異不顯著（P＞0.05），說明暫養(yǎng)過程中VC添加量對花鱸血清中乳酸濃度的影響也不明顯。

2.2 不同處理對花鱸無水活運過程中鰓組織指標的影響

表9 不同處理組對花鱸無水活運過程中鰓組織Na＋ /K＋-ATPase活力的影響Table 9 Effects of different treatments on gill NKA activity during waterless transportation of Lateolabrax maculatus

Na+/K+-ATPase的主要生物學意義在于其為逆濃度差和電位差轉運物質，即一旦膜上的離子通道開放，Na+、K+會迅速順濃度差跨膜擴散[21-22]。由表9可知，運輸0 h，暫養(yǎng)水中加入VC顯著提高了鰓組織細胞中的Na+/K+-ATPase活力（P＜0.05），且隨VC添加量增加而增加，可能是因為VC提高了花鱸的抗氧化酶活性，減少了花鱸低溫條件下的氧化應激?？紫闀萚23]低溫馴化鋸緣青蟹并研究發(fā)現其抗氧化防護與ATPase活性有關系。運輸過程中，使用保護液維持了魚鰓絲細胞內Na+/K+-ATPase的活性[24]，完成正常的離子轉運。C2G2組鰓Na+/K+-ATPase活力最強，因而可以更好地維持細胞內外離子水平的穩(wěn)定性，使鰓細胞得以保持正常生理功能。

2.3 ?；钸^程中花鱸非特異性免疫指標的分析

2.3.1 不同處理對花鱸無水活運過程中血清中溶菌酶水平的影響

溶菌酶是生物體內非特異性免疫防御體系中具有廣譜抗菌作用的堿性酶，具有抗菌、消炎、抗病毒等作用[25]。溶菌酶廣泛分布于魚體的黏液、血清和某些淋巴組織中，是魚類非特異性免疫系統的重要組成部分[26]。生態(tài)冰溫無水活運過程中花鱸持續(xù)處于低溫環(huán)境下。不同學者在對羅非魚進行低溫馴化研究中認為在低溫環(huán)境下非特異性免疫占有主導地位[27-29]。由表10可知，CK組血清中溶菌酶質量濃度明顯較低，說明在暫養(yǎng)水中添加VC可以明顯提高花鱸血清中溶菌酶活力，但降溫處理還是造成了所有處理組過低的溶菌酶活力，保護液使用組血清溶菌酶質量濃度隨運輸時間的延長不再下降，反而明顯升高。一方面可能是因為保護液中加入了溶菌酶，一定程度上補足了環(huán)境因素造成的溶菌酶消耗；另一方面可能是因為保護液中添加了生姜液，生姜可激活單核細胞的分泌功能，使溶菌酶大量釋放，促使溶菌酶質量濃度增高。研究表明生姜液可使小鼠血清溶菌酶活性顯著增高，但不同劑量引起溶菌酶活性變化的程度有所不同[30]。運輸8 h時C2G2組溶菌酶活力最高，為CK組7.68 倍，運輸8 h喚醒后，花鱸血清中溶菌酶質量濃度維持較高水平，這可能是由于水溫的升高提升了溶菌酶活力。

表10 不同處理組對花鱸無水活運過程中血清溶菌酶質量濃度的影響Table 10 Effects of different treatments on serum lysozyme concentration during waterless transportation of Lateolabrax maculatus

2.3.2 不同處理對花鱸無水活運過程中血清中IgM水平的影響

表11 不同處理組對花鱸無水活運過程中血清IgM質量濃度的影響Table 11 Effects of different treatments on serum IgM concentration during waterless transportation of Lateolabrax maculatus

IgM是硬骨魚體內一種重要免疫球蛋白，因此IgM質量濃度通常被認定為是評價魚體免疫應答反應的重要指標[31]。由表11可見，溫度對魚類免疫系統的影響非常復雜，有學者認為低溫可以減慢代謝循環(huán)因而抑制或延遲抗體的釋放[29]?；|低溫無水活運過程全程處于低溫環(huán)境，可能導致了IgM質量濃度降低。侯亞義等[32]報道了虹鱒血漿中IgM的濃度是溫度依賴型的，即高溫時它們的濃度升高，反之濃度降低。運輸0 h（暫養(yǎng)結束未涂抹保護液），IgM質量濃度隨暫養(yǎng)水中VC添加量的升高而降低，VC可增強魚體免疫應答耐受性。使用保護液一定程度上可增強花鱸細胞免疫功能和機體抗感染能力。

2.4 經不同處理的花鱸無水活運結束后的死亡率

將生態(tài)冰溫無水活運后的花鱸放入4 ℃水中以5 ℃/h速率升溫至22～23 ℃喚醒，可以觀察到魚尾擺動幅度越來越大，魚鰓開始不規(guī)律地開閉，呼吸頻率越來越大，逐漸接近正常水平，魚體恢復正常的游動。

表12 不同處理對花鱸無水活運結束后死亡率的影響Table 12 Effect of different treatments on mortality after waterless transportation of Lateolabrax maculatus

如表12所示，花鱸常溫水中喚醒后8 h各組均出現死魚現象，且隨著時間的延長，花鱸死亡率不斷升高。這是因為花鱸經過降溫、包裝、運輸、喚醒過程中的應激，體內能量不足，免疫系統紊亂。暫養(yǎng)水中加入VC可以增強花鱸免疫機能，又具有抗感染作用。保護液中的生姜、溶菌酶、山梨糖醇具有保持機體生理平衡、抗應激、抗凍的作用。研究加入保護液后花鱸死亡率呈下降趨勢，且劑量越高效果越明顯。喚醒結束后1 d死亡率數據表明，運輸期間使用保護液能延長花鱸運輸后存活時間，為商業(yè)銷售提供時間保障。

3 結 論

花鱸通過低溫誘導休眠的方式進行無水保活，禁食暫養(yǎng)12 h后冷馴化至臨界冰溫4 ℃，包裝后振動臺模擬無水?；顣r間可達到8 h，以5 ℃/h速率升水溫至22～23 ℃喚醒后魚體可回到正常狀態(tài)并存活一段時間?，F有的包裝運輸技術花鱸喚醒1 d之內的死亡率高，并沒有為?；钸\輸后的銷售爭取時間。本實驗研究以保護液包裝取代現的濕木屑包裝，可節(jié)省更多運輸空間，提高花鱸無水活運效果，花鱸無水活運后死亡率降低了1%～5%，延長了銷售期，可獲得更高的經濟效益。

研究結果表明，無水保活花鱸魚暫養(yǎng)水中加入30 mg/L VC，暫養(yǎng)12 h，冷馴化后包裝前浸入G2（溶菌酶0.09%+山梨糖醇0.3%+生姜液0.08%）保護液中涂抹，取出后獨立包裝進行無水活運效果最好。保護液中的生姜可使花鱸血清溶菌酶質量濃度顯著增高，保護液中不同生姜劑量可引起溶菌酶活性變化的程度不同。暫養(yǎng)和運輸過程中加入保護液可增強花鱸肝、腎功能及能量代謝，維持鰓組織正常離子運轉，一定程度上可增強花鱸細胞免疫功能和機體抗感染能力。