張 馳，李春翼，王啟明，唐瑜婉，趙吉春,2，李富華,2，明 建,2,

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.西南大學(xué)食品貯藏與物流研究中心，重慶 400715）

花生是主要的食物致敏原之一[1]，花生過敏是血清免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）介導(dǎo)的I型超敏反應(yīng)，其造成的影響具有致命性和持久性[2]，臨床表現(xiàn)涉及皮膚、消化道、呼吸道等[3]。當(dāng)前解決花生過敏的方法主要有物理熱加工法、酶處理法、分子生物學(xué)方法等，它們?nèi)源嬖谥T多不足，如引入新致敏物質(zhì)、破壞花生其他營養(yǎng)成分、適用范圍窄等。植物多酚是一種天然植物活性物質(zhì)，來源廣、綠色安全，具有抗氧化、調(diào)節(jié)心血管疾病、抗炎、防治糖尿病等生理功能，某些與蛋白質(zhì)具有良好的結(jié)合能力[4-5]，利用植物多酚與花生致敏蛋白相互作用是解決花生過敏的一項新途徑，已有文獻(xiàn)報道植物多酚可以降低花生蛋白致敏性。本文對植物多酚與花生致敏蛋白的相互作用、脫敏的潛在機(jī)理進(jìn)行綜述，總結(jié)目前該領(lǐng)域的研究進(jìn)展，并對今后的發(fā)展進(jìn)行展望。

1 花生過敏

1.1 花生致敏蛋白

花生主要致敏原物質(zhì)是高度糖基化的致敏蛋白，多屬花生種子貯藏蛋白，微量即可導(dǎo)致過敏[6-7]。目前世界衛(wèi)生組織/國際免疫學(xué)會聯(lián)合會過敏原命名小組委員會已公布并命名了17 種花生致敏蛋白，分別為Ara h 1～Ara h 17。在所有致敏蛋白中，Ara h 1、Ara h 2、Ara h 3、Ara h 6是較為重要的致敏蛋白類型[3]。

1.2 花生過敏的一般過程

花生過敏包括致敏階段和效應(yīng)階段。1）致敏階段：胃腸道黏膜上的特化上皮細(xì)胞——M細(xì)胞（一種抗原轉(zhuǎn)運細(xì)胞）將致敏蛋白轉(zhuǎn)移至抗原呈遞細(xì)胞，后者將其加工處理成肽片段，在主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）/T細(xì)胞受體（MHC呈遞的多肽與T細(xì)胞受體特異性結(jié)合，引發(fā)后續(xù)生化反應(yīng)）作用下將肽先呈遞給T細(xì)胞，再呈遞給未成熟的輔助型T細(xì)胞2（T helper 2 cell，Th2），Th2被激活后產(chǎn)生細(xì)胞因子，刺激B細(xì)胞合成花生特異性IgE抗體[8]。2）效應(yīng)階段：致敏原與結(jié)合在肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞表面的花生特異性IgE結(jié)合，后者主要通過高親和力的表面IgE受體Fc?RI結(jié)合在相關(guān)細(xì)胞上，釋放多種炎癥介質(zhì)，如組胺、前列腺素、白三烯等，具體過程見圖1。此外，局部產(chǎn)生腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-5（interleukin-5，IL-5）和趨化因子使嗜酸性粒細(xì)胞激活與聚集[8]。劉志剛等[9]發(fā)現(xiàn)花生過敏小鼠模型體內(nèi)以嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞數(shù)目顯著增加，肥大細(xì)胞活化狀態(tài)明顯，血清中花生過敏原特異性IgE和白細(xì)胞介素-4（interleukin-4，IL-4）等細(xì)胞因子水平以及腹腔上清液組胺水平顯著增高（P＜0.05），IgG2a（免疫球蛋白G的亞類）和γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）水平極顯著降低（P＜0.01）。

圖1 食物過敏反應(yīng)的細(xì)胞機(jī)制[10]Fig. 1 Cellular mechanisms of allergic responses to food[10]

2 常見花生脫敏方法與原理

目前，食品工業(yè)中常見的花生脫敏方法主要有：物理熱加工法、基因工程方法、發(fā)芽處理法、酶處理法和輻照處理法，它們對花生產(chǎn)生脫敏作用的原理各不相同。

2.1 物理熱加工法

常見的物理熱加工法包括水煮、焙烤、油炸等[11]。熱加工引起致敏蛋白高級結(jié)構(gòu)改變，使表面抗原決定簇包埋或暴露，進(jìn)而影響蛋白的IgE結(jié)合能力，降低或增加其致敏性[12-14]。Maleki等[15]報道了烘烤花生結(jié)合特異性IgE的能力比未處理花生高出約90 倍，花生致敏蛋白的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物增強(qiáng)了其致敏性。李穎超[12]采用烘焙、油炸、水煮、高溫高壓處理花生仁，其可溶性蛋白含量減少，過敏原反應(yīng)性分別降為對照組（未經(jīng)任何處理）的92%、73%、92%和28%。

2.2 基因工程法

利用基因工程方法可在分子水平上對致敏原相關(guān)基因進(jìn)行操作，這種方法是通過改變花生內(nèi)源基因從根源上改善蛋白致敏性[7]。易海濤等[16]制備了經(jīng)點突變的花生主要致敏原Ara h 2，體外實驗表明該重組蛋白具有低致敏性潛能。Chu Ye等[17]通過沉默Ara h 2和Ara h 6基因得到了低致敏性花生。基因工程改造的花生可能存在缺乏原有花生的風(fēng)味和營養(yǎng)價值等問題[18-20]。

2.3 發(fā)芽處理法

發(fā)芽處理法是利用在種子發(fā)芽過程中，一些貯藏蛋白類致敏蛋白降解成多肽或氨基酸以供給種子生長所需的氮源，從而降低花生致敏原含量[12,21]。李穎超[12]發(fā)現(xiàn)花生發(fā)芽84 h和132 h后，致敏蛋白免疫抑制率較36 h時分別下降了6.6%和11.5%。

2.4 酶處理法

酶處理法主要包括酶交聯(lián)技術(shù)和酶分解技術(shù)。酶交聯(lián)技術(shù)通過催化蛋白質(zhì)內(nèi)部或分子間形成共價鍵而發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，改變蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)，從而引起致敏性變化，目前可用的酶有：谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶、多酚氧化酶、過氧化物酶等[22]。Radosavljevic等[23]使用酪氨酸酶處理花生全蛋白，交聯(lián)產(chǎn)物致敏性未發(fā)生改變。Chung等[24]采用過氧化物酶處理焙烤花生，其酪氨酸殘基發(fā)生了交聯(lián)，致敏性顯著降低；隨后該團(tuán)隊又證明了多酚氧化酶可使花生致敏蛋白Ara h 1、Ara h 2形成交聯(lián)，從而降低其致敏性[25]。Mihajlovic等[26]利用微生物多酚氧化酶和漆酶交聯(lián)花生致敏原，提升了花生致敏性。

酶分解技術(shù)則是通過分解致敏蛋白破壞致敏表位結(jié)構(gòu)，降低其與IgE的結(jié)合特性，進(jìn)而降低花生蛋白致敏性。目前常用的酶有胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶[12,21]等。石振鵬等[21]采用一種復(fù)合酶制劑（V（堿性蛋白酶）∶V（中性蛋白酶）∶V（木瓜蛋白酶）∶V（風(fēng)味酶）＝2∶2∶1∶1）花生仁漿，處理后花生致敏蛋白Ara h 1和Ara h 2平均消減率為92.91%。利用微生物發(fā)酵法也可分解致敏蛋白從而達(dá)到降敏效果，周陽[27]的研究表明，花生蛋白液經(jīng)枯草芽孢桿菌發(fā)酵后與IgE結(jié)合能力可下降為零，發(fā)酵液中Ara h 1幾乎被消除，Ara h 2含量明顯減低。納豆芽孢桿菌發(fā)酵可使花生蛋白液與IgE結(jié)合能力下降48%。Hazebrouck[28]和Yu Jianmei[29]等發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶能水解花生過敏原，有效降低花生過敏原性。

2.5 輻照處理法

輻照處理可以加速蛋白交聯(lián)、展開、形成碎片及生成新的反應(yīng)基團(tuán)，從而改變蛋白結(jié)構(gòu)，影響蛋白免疫反應(yīng)性[30-31]。Luo Chunping等[32]利用10 kGy的鈷-60 γ射線輻照劑量處理Ara h 6和花生蛋白總提取物，發(fā)現(xiàn)其IgE結(jié)合能力下降，蛋白質(zhì)二、三級結(jié)構(gòu)明顯改變。

以上方法在使用過程中分別具有不同優(yōu)缺點，具體如表1所示。

表1 常見花生脫敏方法優(yōu)缺點比較Table 1 Comparative advantages and disadvantages of methods commonly used for allergenicity reduction of peanuts

利用植物多酚與花生致敏蛋白相互作用是解決花生過敏的一項新途徑，已有文獻(xiàn)報道植物多酚與花生致敏蛋白相互作用可以降低花生蛋白致敏性。例如蔓越莓多酚和藍(lán)莓多酚與花生蛋白形成復(fù)合物后，在體外實驗中能降低花生蛋白與花生特異性IgE的結(jié)合能力[36]；人類臨床I期實驗證明多酚配方能降低過敏反應(yīng)中的嗜堿性細(xì)胞數(shù)量[37]；經(jīng)蔓越莓多酚強(qiáng)化的花生粉在體外實驗中誘導(dǎo)的嗜堿性細(xì)胞脫顆?，F(xiàn)象和經(jīng)口刺激花生過敏小鼠體內(nèi)肥大細(xì)胞脫顆?，F(xiàn)象均顯著減少[38]；花生蛋白與多酚結(jié)合還可降低小鼠體內(nèi)特異性IgE的含量[39]。

3 植物多酚與花生致敏蛋白的相互作用

3.1 相互作用力類型

植物多酚與花生致敏蛋白的相互作用力類型包括共價作用力（如經(jīng)多酚氧化、親核加成等形成）和非共價作用力（氫鍵、范德華力、疏水相互作用、靜電相互作用等）。對蔓越莓和藍(lán)莓果渣多酚與花生蛋白形成的復(fù)合物進(jìn)行多酚提取鑒定，發(fā)現(xiàn)多酚以游離、共價結(jié)合和非共價結(jié)合3 種形式存在，且游離多酚含量最高，共價結(jié)合多酚含量最低[36]，以苷元或糖苷形式存在的槲皮素與花生蛋白以共價形式結(jié)合，多聚和單聚原花青素則以非共價形式與花生蛋白結(jié)合[36]。

3.2 結(jié)合位點

圖2 大豆β-伴大豆球蛋白（A）和大豆球蛋白（B）的三維結(jié)構(gòu)[41]Fig. 2 Three-dimensional structures of soybean β-conglycinin (A)and glycinin (B)[41]

植物多酚與花生致敏蛋白的結(jié)合位點可能在蛋白質(zhì)中的脯氨酸富集區(qū)、二硫鍵處、蛋白質(zhì)側(cè)鏈殘基上。van Boxtel等[40]依據(jù)Ara h 1、Ara h 3的三維結(jié)構(gòu)分別與β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白相似（圖2），推測蛋白結(jié)構(gòu)中的脯氨酸富集區(qū)是原花青素與花生致敏蛋白的結(jié)合位點，Ara h 1含有脯氨酸富集區(qū)，因此易與原花青素形成交聯(lián)；Ara h 3中脯氨酸排列松散，因此對原花青素親和力小，不易形成交聯(lián)。

植物多酚與花生致敏蛋白的結(jié)合位點還可能位于二硫鍵處。分子內(nèi)的二硫鍵常使蛋白質(zhì)對熱刺激更具穩(wěn)定性，增強(qiáng)其致敏能力[30]。Ara h 2分子內(nèi)含有的4 個保守二硫鍵，可維系結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，保證與IgE結(jié)合的活性和致敏性，天然Ara h 2具有胃腸道消化酶耐受性，且酶解后仍具識別IgE能力，若二硫鍵被還原，則極易被酶解且與IgE的結(jié)合活性下降[42]。

研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)側(cè)鏈的氨基酸殘基處也可能是多酚與致敏蛋白的結(jié)合位點之一。多酚氧化產(chǎn)物醌類是高活性的親電中間體，易被氨基酸側(cè)鏈中的親核位點攻擊進(jìn)而發(fā)生親核加成反應(yīng)，半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸等氨基酸殘基上常具有親核位點[36]。Chung等[25]證明酚類化合物咖啡酸在堿性條件（pH值大于10）可以被氧化成醌類物質(zhì)，進(jìn)而與蛋白質(zhì)中的氨基、巰基或色氨酸殘基作用形成蛋白質(zhì)交聯(lián)，降低花生蛋白致敏性，反應(yīng)過程如圖3所示。

圖3 咖啡酸在pH 10.5時交聯(lián)蛋白質(zhì)[25]Fig. 3 Cross-linking of protein by caffeic acid at pH 10.5[25]

3.3 結(jié)合特征與構(gòu)象變化

表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）和花生致敏蛋白Ara h 2、Ara h 6的結(jié)合親和力、結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點的數(shù)目與EGCG和其他球蛋白結(jié)合時相似，結(jié)合后Ara h 2和Ara h 6均出現(xiàn)相似變化，即α-螺旋含量減少，β-折疊與β-轉(zhuǎn)角含量增加[43]。

3.4 影響因素

目前發(fā)現(xiàn)能降低花生蛋白致敏性的多酚種類包括原花青素[40]、以苷元或糖苷形式存在的槲皮素[36]、咖啡酸[25]、大豆異黃酮[44]、綠原酸和苯甲酸[45]等。影響蛋白和多酚相互作用的常見因素包括溫度、pH值、多酚和蛋白的類型及濃度等[5]。溫度和pH值可能通過影響反應(yīng)速率、反應(yīng)物活性、反應(yīng)物所帶電荷數(shù)等影響植物多酚與花生蛋白的相互作用，多酚和蛋白的類型及濃度產(chǎn)生的影響可能在于多酚、花生致敏蛋白本身結(jié)構(gòu)特征的差異，如某種基團(tuán)的數(shù)目和所含特征化學(xué)鍵等，但目前在植物多酚與花生致敏蛋白相互作用研究中鮮有系統(tǒng)考慮以上因素。

4 植物多酚降低花生蛋白致敏性的潛在機(jī)理

植物多酚降低花生蛋白致敏性的機(jī)理可能有兩種：1）單獨植物多酚對過敏反應(yīng)的干擾作用；2）植物多酚與花生致敏蛋白形成復(fù)合物，掩蔽或改變致敏蛋白結(jié)構(gòu)，間接調(diào)節(jié)過敏反應(yīng)。

4.1 單獨植物多酚對過敏反應(yīng)的干擾作用

單獨植物多酚可以通過抑制化學(xué)介質(zhì)釋放和抑制肥大細(xì)胞、嗜堿性細(xì)胞或T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)從而干擾過敏反應(yīng)[46]。綠茶中的EGCG及其甲基化衍生物(-)-表沒食子兒茶素-3-O-(3-O-甲基)沒食子酸酯((-)-epigallocatechin-3-O-(3-O-methyl)-gallate，EGCG3''Me)可通過抑制人外周血嗜堿性白細(xì)胞KU812中的Fc?RI受體表達(dá)從而減弱過敏反應(yīng)[47]。單獨加入蔓越莓多酚或藍(lán)莓多酚時，肥大細(xì)胞的組胺釋放量和β-氨基己糖苷酶釋放量出現(xiàn)不同程度降低[36]。植物多酚的抗過敏作用具有非特異性，如類黃酮能夠通過抑制DC的功能抑制小鼠模型中的花生過敏[44]?？煽芍械脑ㄇ嗨氐途畚锟梢源碳は忍煨院驮缙谶m應(yīng)性免疫，這種抑制DC和巨噬細(xì)胞的功能不是針對某種特異的抗原，不具有致敏原特異性[46]。

4.2 植物多酚與花生致敏蛋白形成復(fù)合物導(dǎo)致后者結(jié)構(gòu)改變，間接調(diào)節(jié)過敏反應(yīng)

花生致敏蛋白和植物多酚結(jié)合可以引起其構(gòu)象變化，進(jìn)而改變抗原表位結(jié)構(gòu)特性，最終影響抗原結(jié)合能力，改變蛋白致敏性[13,30,48-49]?；ㄉ旅舻鞍譇ra h 2、Ara h 6和EGCG結(jié)合后致敏性降低，蛋白螺旋結(jié)構(gòu)含量減少，β-折疊及無規(guī)卷曲含量增加，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性下降[44]。分別用蔓越莓多酚和藍(lán)莓多酚與花生蛋白制備含質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%多酚的復(fù)合物，與未加多酚的對照組相比，蔓越莓多酚和藍(lán)莓多酚制得的復(fù)合物與IgE結(jié)合能力分別下降38%、31%，并使離子霉素誘導(dǎo)的大鼠嗜堿性細(xì)胞白血病細(xì)胞（rat basophil leukemia cells，RBL-2H3）的組胺釋放量分別下降65.5%、65.8%，β-氨基己糖苷酶釋放量分別下降60.7%、45.4%[36]?；ㄉ鞍着c漿果多酚結(jié)合后與IgE結(jié)合能力下降，且蛋白二級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[50]。此外，大多數(shù)食物致敏原均具有高胃腸道消化酶抵抗性[48]，富含EGCG的綠茶多酚提取物與花生致敏蛋白結(jié)合后可促進(jìn)胃蛋白酶對抗消化食物過敏原的消化，從而降低致敏作用[49]。

植物多酚與花生致敏蛋白結(jié)合可抑制過敏反應(yīng)中的相關(guān)信號通路。如在速發(fā)型過敏反應(yīng)中，Ca2+內(nèi)流可引起肥大細(xì)胞脫顆粒作用[36]，花生衣中的多酚與花生蛋白形成聚合物后可抑制Ca2+誘導(dǎo)的絲裂原活化蛋白激酶信號通路引起的細(xì)胞脫顆粒[51]。植物多酚-花生蛋白復(fù)合物的致敏性降低可能包括3 個原因：1）消化酶更易于破壞復(fù)合物中IgE的結(jié)合表位；2）多酚結(jié)合的蛋白表位不能被致敏原特異性IgE識別；3）交聯(lián)蛋白使表位不能被含致敏原特異性的IgE肥大細(xì)胞和嗜堿性細(xì)胞在消化過程中識別[52]。

5 結(jié) 語

目前關(guān)于植物多酚降低花生蛋白致敏性的研究內(nèi)容主要集中于測定花生致敏蛋白與多酚結(jié)合前后的以下指標(biāo)：在體外與特異性IgE的結(jié)合能力、對肥大細(xì)胞脫顆粒作用的抑制能力（測定β-氨基己糖苷酶和組胺釋放水平）、經(jīng)胃腸道酶消化后花生蛋白的組成及含量等，對花生致敏蛋白與植物多酚的相互作用和脫敏機(jī)理的深入研究及報道較少。

未來的研究方向可能包括：1）深入探討植物多酚脫敏作用機(jī)理，關(guān)注相關(guān)信號的基因表達(dá)等；2）探究致敏蛋白和植物多酚的相互作用如作用力類型、結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點等，找到致敏蛋白中決定脫敏作用的結(jié)構(gòu)變化；3）關(guān)注不同多酚組合類型的脫敏效果；4）關(guān)注植物多酚在胃腸道消化過程中對消化酶及腸道菌群的作用；5）關(guān)注其他食物基質(zhì)對花生致敏蛋白的影響。