王 磊，張富春，劉 軍

（新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆生物資源基因工程重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830046）

食管癌是消化道最常見的惡性胃腸道腫瘤[1]，作為全球第六大癌癥死亡原因，每年約51萬 人因食管癌死亡，57萬食管癌病例被確診[2-4]。食管癌腫瘤發(fā)病率居我國惡性腫瘤發(fā)病率的第3位，死亡率居我國惡性腫瘤死亡率的第4位[5]。現(xiàn)代外科手術(shù)結(jié)合不同治療策略取得了一定的療效，如放療、化療以及免疫治療[6]，但近5 年食管癌患者生存率仍小于20%[3]。此外，現(xiàn)有抗腫瘤化學(xué)藥物存在價格昂貴、副作用大等弊端，因此必須尋找及開發(fā)新型有效的抗腫瘤活性藥物。飲食與癌癥化學(xué)預(yù)防已備受關(guān)注，如大蒜被廣泛應(yīng)用于食品和調(diào)味劑，而大蒜素可作為抗癌藥物[7]。有研究表明食物的生物活性物質(zhì)與降低癌癥風(fēng)險有著密切的關(guān)系[8]。

阿魏菇（Pleurotus ferulae）屬于真菌門、擔(dān)子菌綱、傘菌目、側(cè)耳屬，又名阿魏側(cè)耳，是一種大型肉質(zhì)傘菌，因寄生或腐生在干旱草原一種藥用植物阿魏上而得名，是新疆特有的一種藥食同源菌類[9]，具有抗腫瘤、抗氧化、提高免疫力、降血脂等多種功能[10-12]。這些功能普遍被認(rèn)為與阿魏菇中存在的大量活性物質(zhì)有關(guān)[10-11,13]；目前對其水提物中主要活性物成分多糖的研究較多[14]，而對其醇提物中活性成分的研究卻鮮見報道。本課題組前期研究表明，阿魏菇醇提物中含有的主要活性成分是三萜類、生物堿以及皂苷類[15]。國內(nèi)外的研究表明，三萜類化合物在抗癌方面具有較高的研究價值[16-22]，例如靈芝三萜類被報道具有良好的抗腫瘤作用[22]，萜類化合物CDDO-Im作為抗腫瘤藥物已進(jìn)入臨床實驗階段[23]。因此，本實驗以前期優(yōu)化后的阿魏菇粗三萜（Pleurotus ferulatus triterpenoid，PFTP）提取條件進(jìn)行提取并分級萃取[9]，研究阿魏菇乙酸乙酯相三萜類化合物（ethyl acetate phase of PFTP，PFTP-E）對Eca109細(xì)胞的抗腫瘤作用機(jī)制，以期為食管癌的治療提供植物源的天然抗腫瘤候選藥物。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

阿魏菇由新疆南山栽培基地提供，由新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院逯永滿老師鑒定。人食管癌細(xì)胞Eca109、人胃癌細(xì)胞BGC823、人結(jié)腸癌細(xì)胞HT29、人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480、人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116、小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞CT26由新疆大學(xué)生物資源與基因工程重點實驗室和歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司提供。

β-actin、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase）3、Caspase9、聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）、Bcl2、Bax、細(xì)胞色素c（cytochrome c，Cyt c）、真核起始因子2α（eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α）、p-eIF2α、CHOP、Cyclin B1、細(xì)胞外信號相關(guān)激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）、p-ERK、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、p-JNK、p38、p-p38、LC3 A/B抗體、二抗山羊抗鼠免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）、山羊抗兔IgG 上海生工生物工程公司；3-(4,5-二甲基噻-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT） 北京索萊寶生物科技公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 美國Sigma公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、0.25%胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素 美國HyClone公司；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測試劑盒上海翊圣生物科技公司；Hoechst 33258染液、活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒 上海碧云天生物工程公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒、電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）顯色試劑盒美國賽默飛世爾公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DK8D型電熱恒溫水浴鍋 廣州滬瑞明儀器有限公司；2200.2超聲波破碎儀 北京桑翌實驗儀器研究所；RE-1050旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 河南蘭帆實業(yè)有限公司；LGJ-10真空冷凍干燥機(jī) 北京松源華興生物技術(shù)有限公司；Heracell-150i細(xì)胞培養(yǎng)箱 美國賽默飛世爾公司；LSR Fortessa X-20流式細(xì)胞儀 美國BD公司；CMax-Plus酶標(biāo)儀 北京華泰和合商貿(mào)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 阿魏菇三萜類化合物的制備

新鮮阿魏菇子實體清洗干凈切片，真空冷凍干燥處理，粉碎過40 目篩包裝保存。稱取阿魏菇凍干粉100 g，加入2 L體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液，混勻后50 ℃超聲40 min，75 ℃水浴25 min，過濾收集上清液，提取3 次，合并濾液，濃縮至100 mL后得PFTP。將濃縮后的PFTP依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等體積萃取3 次，每次30 min，將3 個萃取相濃縮、冷凍干燥，得浸膏石油醚相提取物（PFTP-P）、乙酸乙酯相提取物（PFTP-E）、正丁醇相提取物（PFTP-B）。PFTP用DMSO溶解，貯存質(zhì)量濃度為150 mg/mL，PFTP-P、PFTP-E、PFTP-B用DMSO溶解，貯存質(zhì)量濃度均為50 mg/mL。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞培養(yǎng)于含質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% FBS、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的DMEM和RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2、相對濕度95%的無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d換液傳代1 次，取接種于培養(yǎng)板24 h后的細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.3.3 MTT法檢測細(xì)胞增殖能力

分別取對數(shù)期的Eca109、BGC823、HT29、SW480、HCT116和CT26細(xì)胞，胰蛋白酶消化，取100 μL細(xì)胞懸液（5×103個/孔）接種于96 孔板，培養(yǎng)24 h，PFTP、PFTP-P、PFTP-E、PFTP-B分別于37 ℃處理腫瘤細(xì)胞24、48、72 h，移除培養(yǎng)基，加入100 μL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）稀釋的0.5 mg/mL MTT溶液，孵育3 h，移除MTT溶液，加入200 μL DMSO，振蕩至結(jié)晶充分溶解，酶標(biāo)儀檢測490 nm波長處吸光度，以正常生長細(xì)胞為對照，重復(fù)3 次后按下式計算細(xì)胞存活率，從而得到半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

1.3.4 Hoechst 33258染色觀察細(xì)胞凋亡

取培養(yǎng)至對數(shù)期的Eca109細(xì)胞接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板（1×104個/孔），培養(yǎng)24 h，PFTP-E處理24 h，以正常生長細(xì)胞為空白對照，以順鉑（35 μg/mL，下同）處理組為陽性對照，以DMSO（與PFTP-E等體積，下同）處理組為陰性對照。移除培養(yǎng)液，體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液固定10 min，PBS清洗2 次，移除PBS，加入30 μL Hoechst 33258避光染色10 min，熒光倒置顯微鏡下觀察拍照。

1.3.5 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡、周期、胞內(nèi)ROS水平和線粒體膜電位

取培養(yǎng)至對數(shù)期的Eca109細(xì)胞接種于60 mm細(xì)胞培養(yǎng)板（2.5×105個/孔），培養(yǎng)24 h，PFTP、PFTP-E處理24 h，以正常生長細(xì)胞為空白對照，以順鉑處理組為陽性對照，以DMSO處理組為陰性對照。移除培養(yǎng)液，胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，冷PBS洗2 次。然后采用Annexin VFITC/碘化丙啶（propidium iodide，PI）雙標(biāo)記染色法流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡；采用PI單標(biāo)記法流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期；采用熒光探針2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽（2',7'-dichlorodi-hydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）標(biāo)記法流式細(xì)胞術(shù)檢測胞內(nèi)ROS水平；采用熒光探針JC-1標(biāo)記法流式細(xì)胞術(shù)檢測線粒體膜電位。用Flowjo 7.6軟件處理數(shù)據(jù)。

1.3.6 Western blot法檢測相關(guān)蛋白表達(dá)量

取培養(yǎng)至對數(shù)期的Eca109細(xì)胞接種于60 mm細(xì)胞培養(yǎng)板（2.5×105個/孔），培養(yǎng)24 h，PFTP、PFTP-E處理24 h，以DMSO處理組為陰性對照。移除培養(yǎng)液，胰蛋白酶消化后收集細(xì)胞，冷PBS洗2 次，RIPA溶液（15 mmol/L Tris-HCl、50 mmol/L NaCl、5 mmol/L乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、質(zhì)量分?jǐn)?shù)1% Triton X-100、1%脫氧膽酸鈉、0.1%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、1 mmol/L Na3VO4、10 μg/mL蛋白酶抑制劑和10 μg/mL亮抑肽酶，pH 7.4）冰上裂解提取總蛋白，BCA法測定蛋白質(zhì)量濃度，各組蛋白上樣量相同，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE），轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜，用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉的PBST溶液37 ℃封閉1 h。37 ℃一抗（β-actin、Caspase3、Caspase9、PARP、Bcl2、Bax、Cyt c、eIF2α、p-eIF2α、CHOP、Cyclin B1、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38、p-p38、LC3 A/B抗體）孵育2 h（體積比1∶200～1∶1 000），PBST洗3 次；37 ℃二抗（山羊抗鼠IgG和山羊抗兔IgG）孵育1 h（1∶2 000），PBST洗3 次，用ECL試劑盒顯色。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗數(shù)據(jù)采用 ±s表示，利用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行單因素方差分析以及t檢驗并作圖，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 PFTP對腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用

以齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線y＝3.742 4x+0.078 9計算得到PFTP的三萜質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.6%。如表1所示，PFTP對6 種細(xì)胞的生長均具有抑制作用。隨著作用時間延長，PFTP對6 種細(xì)胞的增殖抑制能力均逐漸增強，表現(xiàn)出時間依賴性。PFTP對Eca109和CT26細(xì)胞抑制作用最強，在24 h對BGC823細(xì)胞無明顯抑制作用。Eca109為人源腫瘤細(xì)胞，而CT26屬于鼠源腫瘤細(xì)胞，因此本研究選用Eca109細(xì)胞系進(jìn)行后續(xù)生物學(xué)分析。

表1 PFTP對腫瘤細(xì)胞的IC50Table 1 IC50 of PFTP againsttumor cells

2.2 PFTP對Eca109細(xì)胞凋亡的影響

圖1 PFTP對Eca109細(xì)胞凋亡和壞死的影響Fig. 1 PFTP promoted apoptosis and necrosis of Eca109 cells

1.6 mg/mL PFTP處理Eca109細(xì)胞24 h后，與空白對照和陰性對照組相比，陽性對照和PFTP組Eca109細(xì)胞凋亡率（PI和FITC雙陽區(qū)及FITC單陽區(qū)）和壞死率（PI單陽區(qū)）存在極顯著差異，說明PFTP可誘導(dǎo)Eca109細(xì)胞凋亡和壞死（圖1）。圖1B顯示PFTP誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力明顯弱于順鉑，但引起細(xì)胞壞死的能力強于順鉑。這種差異很可能由于PFTP成分復(fù)雜，主成分不單一，造成細(xì)胞不同程度的損傷，引起細(xì)胞壞死程度較高，但誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡活性成分含量低，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡能力弱于順鉑，因此對PFTP作進(jìn)一步分離提純。

2.3 PFTP各萃取相對Eca109細(xì)胞增殖的影響

以齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線y＝3.742 4x+0.078 9計算得到PFTP不同萃取相中三萜質(zhì)量分?jǐn)?shù)由高到低分別為PFTP-E（21.59%）、PFTP-P（14.22%）、PFTP-B（10.36%）。PFTP-E、PFTP-P、PFTP-B對Eca109細(xì)胞的增殖抑制能力比萃取前的PFTP有明顯提高（圖2）。PFTP-E、PFTP-P、PFTP-B在處理24、48、72 h對Eca109細(xì)胞的IC50分別為201.5、401.3、587.2 μg/mL，151.3、251.5、351.6 μg/mL和70.0、214.6、274.2 μg/mL，且處理時間越長IC50越??；相同處理時間下PFTP-E、PFTP-P、PFTP-B對Eca109細(xì)胞的IC50逐漸增大，表明PFTP各萃取相以時間和劑量依賴形式殺傷腫瘤細(xì)胞，PFTP-E對Eca109細(xì)胞的增殖抑制能力最強。由圖2E可知，PFTP-E質(zhì)量濃度在400 μg/mL內(nèi)對正常小鼠脾臟細(xì)胞處理24 h無毒副作用。如圖2D所示，400 μg/mL PFTP-E、PFTP-P、PFTP-B細(xì)胞增殖抑制能力與三萜含量具有正向劑量-效應(yīng)關(guān)系，初步猜測三萜類為PFTP中主要的抗腫瘤活性物質(zhì)。因此用PFTP-E處理Eca109細(xì)胞24 h做進(jìn)一步分析。

圖2 PFTP各萃取相對Eca109細(xì)胞增殖的影響Fig. 2 Effect of different solvent fractions of PFTP on proliferation of Eca109 cells

2.4 PFTP-E對Eca109細(xì)胞周期的阻滯作用

圖3 PFTP-E對Eca109細(xì)胞周期的影響Fig. 3 Effect of PFTP-E on cell cycle of Eca109 cells

如圖3A、B所示，PFTP-E可有效地將Eca109細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，且質(zhì)量濃度越大阻滯效果越明顯，G2/M期的細(xì)胞比例由PFTP-E 100 μg/mL的6.02%增加至300 μg/mL的18.68%。表明PFTP-E可將Eca109細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，并具有濃度依賴性。Western blot結(jié)果顯示，PFTP-E可高度顯著下調(diào)G2期向M期轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵周期蛋白Cyclin B1表達(dá)（圖3C、D），將細(xì)胞周期阻滯在G2/M期。

2.5 PFTP-E對Eca109細(xì)胞凋亡的影響

圖4 PFTP-E對Eca109細(xì)胞凋亡的影響Fig. 4 Effect of PFTP-E on apoptosis of Eca109 cells

PFTP-E將Eca109細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，導(dǎo)致細(xì)胞不能進(jìn)行正常增殖，因此進(jìn)一步檢測其是否會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。圖4A顯示PFTP-E通過誘導(dǎo)Eca109細(xì)胞凋亡而抑制其生長。圖4B顯示PFTP-E處理24 h后細(xì)胞凋亡率與空白對照組相比呈顯著性差異，并在質(zhì)量濃度為400 μg/mL時達(dá)到80%。圖4C顯示PFTP-E引起細(xì)胞毒性的原因為誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這與PFTP誘導(dǎo)細(xì)胞壞死的結(jié)果存在差異。

細(xì)胞凋亡典型特征是細(xì)胞變圓、貼壁能力降低、內(nèi)部染色質(zhì)斷裂固縮、DNA片段化斷裂、細(xì)胞膜外翻等。通過Hoechst染色觀察核形態(tài)變化，由圖4D可觀察到，隨著PFTP-E質(zhì)量濃度的增加（100～300 μg/mL），細(xì)胞數(shù)量相比于空白對照組明顯減少；空白對照組細(xì)胞為均勻藍(lán)色細(xì)胞核，PFTP-E處理組細(xì)胞核因高度固縮呈高亮藍(lán)白色（箭頭），具有顯著的濃度效應(yīng)。綜合上述結(jié)果可以說明PFTP-E通過誘導(dǎo)Eca109細(xì)胞凋亡而抑制其生長。

2.6 PFTP-E對Eca109細(xì)胞線粒體膜電位的影響

線粒體作為細(xì)胞的能量工廠，對細(xì)胞存活、生長、增殖、分化具有重要的作用。一些作為抗腫瘤藥物的植物次生代謝物通常會激活凋亡途徑中經(jīng)典的線粒體途徑[24]。圖5A顯示，PFTP-E以濃度依賴性的方式增加FITC綠色熒光強度（細(xì)胞門內(nèi)），相比于空白對照組，PFTP-E質(zhì)量濃度大于200 μg/mL時可極顯著增加JC-1單體熒光強度（圖5B），降低線粒體膜電位，導(dǎo)致線粒體膜電位崩潰。說明PFTP-E可能通過線粒體途徑誘導(dǎo)Eca109細(xì)胞凋亡。

圖5 PFTP-E對Eca109細(xì)胞線粒體膜電位的影響Fig. 5 Effect of PFTP-E on mitochondrial membrane potential of Eca109 cells

2.7 PFTP-E對Eca109細(xì)胞胞內(nèi)ROS水平的影響

由圖6A可知，PFTP-E處理組熒光峰向右偏移。圖6B顯示與空白對照相比，PFTP-E處理組DCF相對熒光強度顯著增加（表現(xiàn)為處理組峰發(fā)生偏移），表明PFTP-E以濃度依賴性顯著誘導(dǎo)Eca109細(xì)胞胞內(nèi)ROS產(chǎn)生。線粒體是ROS產(chǎn)生的主要細(xì)胞器，線粒體膜電位的降低致使線粒體膜通透性增加，導(dǎo)致ROS釋放到細(xì)胞質(zhì)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[25]。因此推測PFTP-E可能引起癌細(xì)胞線粒體損傷，導(dǎo)致大量ROS釋放到胞質(zhì)造成細(xì)胞損傷，使細(xì)胞增殖受到抑制，從而引起細(xì)胞凋亡。

圖6 PFTP-E對 Eca109細(xì)胞胞內(nèi)ROS的影響Fig. 6 Effect of PFTP-E on intracellular ROS level of Eca109 cells

2.8 PFTP-E對Eca109細(xì)胞凋亡相關(guān)因子表達(dá)量的影響

圖7 PFTP-E對Eca109細(xì)胞凋亡相關(guān)因子表達(dá)量的影響Fig. 7 Effect of PFTP-E on the expression of apoptosis-related factors in Eca109 cells

為進(jìn)一步證實PFTP-E能夠誘導(dǎo)Eca109細(xì)胞凋亡，通過Western blot法檢測胞質(zhì)中的Cyt c以及凋亡相關(guān)蛋白分子Bcl2、Bax、PARP/剪切型PARP、Caspase3/剪切型Caspase3、Caspase9/剪切型Caspase9的表達(dá)變化，以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白eIF2α、CHOP和自噬標(biāo)志物L(fēng)C3 A/B的表達(dá)情況。如圖7A所示，與陰性對照組相比，PFTP-E可以增強Cyt c、促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，并降低Bcl2蛋白的表達(dá)，且在300 μg/mL時顯著增強剪切型Caspase9、Caspase3、PARP的表達(dá)，激活經(jīng)典的線粒體凋亡途徑。同時，PFTP-E處理也顯著提高了p-eIF2α、CHOP、LC3 A/B的表達(dá)（圖7B），可能引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生。絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）信號通路可通過磷酸化來調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡及遷移，是最常見的癌癥解除管制的信號途徑之一[26]。圖7C表明不同質(zhì)量濃度PFTP-E處理Eca109細(xì)胞后可顯著提高p-JNK表達(dá)水平，表明PFTP-E可能通過影響MAPK/JNK信號通路來調(diào)控Eca109的細(xì)胞凋亡。

3 討 論

阿魏菇作為一種新疆特有藥食同源菌類，具有很高的營養(yǎng)和藥用價值。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)阿魏菇醇提物主要活性成分為三萜類、生物堿類、皂苷類等化合物[15]。三萜類物質(zhì)是一類重要的中藥化學(xué)成分，是藥用真菌的主要活性成分之一[16]。近幾年，對三萜類及其衍生物的抗腫瘤活性及其作用機(jī)制的研究成果迅速增加，大量研究表明三萜類化合物可以阻止腫瘤的發(fā)生，抑制癌細(xì)胞增殖、擴(kuò)散、血管生成，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡分化和細(xì)胞周期阻滯，并促進(jìn)化學(xué)增敏作用[27-28]。Sun Haiyan等報道從中草藥升麻中提取的環(huán)烷三萜ADCX可抑制P-gp高表達(dá)的多抗藥性細(xì)胞株HepG2/ADM增殖，并能通過抑制自噬降解進(jìn)而促進(jìn)其凋亡[18]。Zhao Yueliang也證實從澤瀉根中提取分離的澤瀉醋酸酯AB23A可以通過激活JNK途徑和抑制ROS的積累來誘導(dǎo)結(jié)腸癌SW480、HCT116細(xì)胞的自噬依賴性凋亡，且不影響正常結(jié)腸細(xì)胞CC4-841CON生長[19]。Chen Suyu等研究表明三萜類化合物可通過激活凋亡相關(guān)的分子PARP、Caspase3/9等來促進(jìn)細(xì)胞凋亡[29]?；谌祁愶@著的抗腫瘤活性，為更好地開發(fā)利用阿魏菇資源，本研究制備了PFTP三萜（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.6%），經(jīng)萃取后的PFTP-E、PFTP-P、PFTP-B三萜質(zhì)量分?jǐn)?shù)均具有較高程度的提高，分別為21.59%、14.22%、10.36%。MTT檢測結(jié)果顯示PFTP各萃取相均表現(xiàn)為時間和劑量依賴性地抑制Eca109細(xì)胞增殖，且抑制細(xì)胞增殖能力強弱順序均為PFTP-E＞PFTP-P＞PFTP-B，這與各相中三萜質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對應(yīng)，即抑制細(xì)胞增殖活性與三萜質(zhì)量分?jǐn)?shù)具有正向的劑量-效應(yīng)關(guān)系，初步推測阿魏菇抗腫瘤活性物質(zhì)可能為三萜類。

探討PFTP-E的抗腫瘤作用發(fā)現(xiàn)，PFTP-E對Eca109細(xì)胞處理24 h后的IC50由6.212 mg/mL降低至201.5 μg/mL，大幅提升抑制細(xì)胞增殖的能力。PFTP-E可將Eca109細(xì)胞周期阻滯在G2/M期而抑制細(xì)胞增殖，并降低細(xì)胞周期蛋白Cyclin B1的表達(dá)；且PFTP-E可導(dǎo)致Eca109細(xì)胞線粒體膜電位崩潰并激起胞內(nèi)ROS水平顯著升高，表明PFTP-E可能通過線粒體途徑誘導(dǎo)Eca109細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步檢測凋亡相關(guān)分子的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，PFTP-E處理后Cyt c表達(dá)量顯著升高，促凋亡因子Bax表達(dá)量增加，Bcl2表達(dá)量顯著降低，同時其能夠顯著增加剪切型PARP、Caspase3以及Caspase9的表達(dá)，表明PFTP-E可促進(jìn)線粒體凋亡分子的表達(dá)，激活Caspase蛋白酶家族，從而抑制Eca109細(xì)胞生長，即PFTP-E通過線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。據(jù)報道，三萜類化合物為多靶向性殺傷腫瘤細(xì)胞的一類化合物，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引發(fā)細(xì)胞凋亡為其機(jī)制之一[16]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是主要負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)合成、折疊、轉(zhuǎn)錄后修飾以及轉(zhuǎn)運的細(xì)胞器，GRP78是定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的一種維持胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵蛋白，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)時，GRP78結(jié)合蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（proteinkinaser-like ER kinase，PERK）并導(dǎo)致其失活；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時，PERK會從GRP78上釋放。PERK在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的主要作用是抑制mRNA翻譯，減少錯誤蛋白質(zhì)合成，引起eIF2α快速地磷酸化，抑制蛋白質(zhì)合成，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負(fù)擔(dān)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能持續(xù)紊亂將誘導(dǎo)CHOP的表達(dá)上調(diào)，CHOP作為調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘發(fā)的細(xì)胞凋亡蛋白可介導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激已被證明是有效的自噬發(fā)生誘導(dǎo)條件，eIF2α通過磷酸化可激活自噬[30-32]。由圖7可知，PFTP-E可顯著上調(diào)p-eIF2α、CHOP和自噬標(biāo)志物L(fēng)C3 A/B的表達(dá)。綜上可知，PFTP-E可能通過激活經(jīng)典線粒體途徑、細(xì)胞周期阻滯、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激以及自噬而最終導(dǎo)致的凋亡（圖8）。MAPK在抗腫瘤治療中起重要作用，激活的MAPK可轉(zhuǎn)換細(xì)胞外來刺激信號以調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、增殖和生長。MAPK包括ERK、JNK和p38。JNK是MAPK家族的一種壓力激活蛋白激酶，響應(yīng)被激活的壓力信號，其中上游的MAP激酶激酶7可以通過磷酸化來調(diào)節(jié)JNK的激活，激活的JNK能夠調(diào)節(jié)很多轉(zhuǎn)錄因子，如AFT-2、c-Jun、AP-1和p53，它們能夠被磷酸化并作為轉(zhuǎn)錄因子去轉(zhuǎn)錄激活目標(biāo)基因，引發(fā)一系列胞內(nèi)程序，如細(xì)胞增殖、凋亡、自噬及DNA修復(fù)[33-34]，圖7C顯示PFTP-E可濃度依賴性地增加p-JNK的表達(dá)，因此其可能通過激活MAPK/JNK信號通路促進(jìn)Eca109細(xì)胞凋亡。

圖8 PFTP-E誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)途徑Fig. 8 PFTP-E induces apoptosis-related pathways

PFTP-E能夠上調(diào)促凋亡相關(guān)因子、下調(diào)抑凋亡相關(guān)因子的表達(dá)，表現(xiàn)出顯著的促細(xì)胞凋亡作用，其促凋亡機(jī)制涉及MAPK/JNK信號通路，并與線粒體損傷途徑、細(xì)胞周期阻滯、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及自噬有關(guān)（圖8）?？梢酝茰yPFTP-E可通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡進(jìn)而達(dá)到治療癌癥的作用，隨著對阿魏菇三萜類物質(zhì)不斷的深入研究，開發(fā)阿魏菇三萜類組分作為新型抗癌藥物具有廣闊前景。