黃河 黃玥 胡永仙 趙厚力 周凌輝

嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）T 細(xì)胞治療是目前最具有臨床應(yīng)用前景的細(xì)胞免疫療法。CAR是一種人工合成受體，第一代CAR由一個(gè)T細(xì)胞活化域（通常包括CD3復(fù)合物的Zeta鏈）和胞外腫瘤相關(guān)抗原結(jié)合區(qū)（常為免疫球蛋白衍生的單鏈可變區(qū)片段）組成。第二代CAR在此基礎(chǔ)上嵌合了共刺激受體，促進(jìn)T細(xì)胞的增殖和抗凋亡功能，為目前CAR-T產(chǎn)品中普遍使用的CAR結(jié)構(gòu)。CAR結(jié)構(gòu)模仿天然T細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）功能，不受人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）限制而識(shí)別腫瘤特異性抗原，模擬第一信號(hào)和第二信號(hào)的傳導(dǎo)，激活CAR-T細(xì)胞，從而表現(xiàn)出CAR依賴的細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子釋放和靶細(xì)胞直接殺傷作用。

臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)于復(fù)發(fā)/難治性急性B細(xì)胞淋巴細(xì)胞白血?。╮elapsed/refractory B-cell acute lymphoblastic leukemia，r/r B-ALL）患者，CAR-T 細(xì)胞治療的完全緩解（complete remission，CR）率為 80%～90%[1-3]，復(fù)發(fā)/難治性B細(xì)胞淋巴瘤患者的CR率達(dá)50%[4-7]。盡管CAR-T療法在治療惡性血液病中取得了顯著療效，但復(fù)發(fā)成為CAR-T細(xì)胞治療失敗的主要原因。本文總結(jié)了急性B細(xì)胞淋巴細(xì)胞白血病CAR-T細(xì)胞治療后復(fù)發(fā)的臨床特征和可能機(jī)制，并提出了相應(yīng)的治療策略。

1 CAR-T細(xì)胞治療急性B細(xì)胞淋巴細(xì)胞白血?。˙-cell acute lymphoblastic leukemia，B-ALL）后復(fù)發(fā)的臨床特征

國(guó)際上多個(gè)臨床中心中靶向CD19 CAR-T細(xì)胞治療B-ALL的臨床試驗(yàn)結(jié)果及復(fù)發(fā)情況因納入與排除標(biāo)準(zhǔn)、CAR-T細(xì)胞來(lái)源及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)不同而存在較大差異。（1）復(fù)發(fā)比例與復(fù)發(fā)類型：CAR-T細(xì)胞治療r/r B-ALL后，1年累積復(fù)發(fā)率（cumulative incidence of relapse，CIR）約50%～60%[1-2，8-11]。常見(jiàn)的兩種復(fù)發(fā)類型包括靶抗原陽(yáng)性復(fù)發(fā)和靶抗原缺失/下調(diào)復(fù)發(fā)。有研究報(bào)道，CAR-T細(xì)胞治療后2年CD19陽(yáng)性CIR達(dá)34%，2年CD19陰性CIR為14%[12]。（2）復(fù)發(fā)時(shí)間：盡管目前尚無(wú)針對(duì)復(fù)發(fā)類型及相應(yīng)復(fù)發(fā)時(shí)間的系統(tǒng)性報(bào)道，我們觀察到靶抗原陽(yáng)性復(fù)發(fā)通常因CAR-T細(xì)胞自身擴(kuò)增能力和存活時(shí)間受限而發(fā)生于治療早期的幾周至3個(gè)月內(nèi)，而靶抗原缺失/下調(diào)復(fù)發(fā)在治療中晚期更多見(jiàn)，通常為3至6個(gè)月，主要原因是CAR-T細(xì)胞壓力下腫瘤細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)。2014年Maude等[1]首次報(bào)道了應(yīng)用CD19-4-1BB-ζ CAR-T細(xì)胞治療兒童B-ALL的Ⅰ期臨床試驗(yàn)，27例獲得CR的患者中，3例患者輸注后數(shù)周至3個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)CD19陽(yáng)性復(fù)發(fā)，而3例CD19陰性復(fù)發(fā)患者中最遲的復(fù)發(fā)時(shí)間為輸注后8.5個(gè)月。（3）復(fù)發(fā)危險(xiǎn)因素：臨床數(shù)據(jù)表明，高腫瘤負(fù)荷可能是治療后復(fù)發(fā)的高危因素，高腫瘤負(fù)荷患者CAR-T細(xì)胞治療后的無(wú)事件生存（event-free survival，EFS）率和總生存（overall survival，OS）率明顯降低[8]。

2 靶抗原陽(yáng)性復(fù)發(fā)機(jī)制

抗原陽(yáng)性復(fù)發(fā)通常發(fā)生在CAR-T細(xì)胞治療誘導(dǎo)緩解后的早期，被認(rèn)為與CAR-T細(xì)胞的快速耗竭與功能障礙有關(guān)?；颊叩幕緺顟B(tài)、CAR-T細(xì)胞的免疫原性、CAR結(jié)構(gòu)的共刺激域以及初始CAR-T細(xì)胞表型均會(huì)影響CAR-T細(xì)胞在患者中的殺傷能力和持續(xù)時(shí)間。

2.1 患者基本狀態(tài)

2.1.1 年齡 兒童患者比成年患者有更長(zhǎng)的EFS中位時(shí)間，提示自體CAR-T細(xì)胞的質(zhì)量可能與年齡存在密切聯(lián)系。Kotani等[13]分析了年輕與年老B6小鼠模型的CAR-T細(xì)胞表型特征，發(fā)現(xiàn)老年CAR-T細(xì)胞盡管表現(xiàn)出更強(qiáng)的細(xì)胞毒性，但壽命短且記憶細(xì)胞表型少。進(jìn)一步的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)（RNA sequencing，RNA-Seq）分析表明老年CAR-T細(xì)胞的EOMES/TBET轉(zhuǎn)錄因子軸受到干擾，而年輕CAR-T細(xì)胞表現(xiàn)出更好的增殖和細(xì)胞分化活性。

2.1.2 CAR-T細(xì)胞治療前化療次數(shù) 曾接受多次化療的r/r B-ALL患者可能存在T細(xì)胞功能的衰竭和特定表型T細(xì)胞的減少。Singh等[14]檢測(cè)兒童急性淋巴細(xì)胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia，ALL）和非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma，NHL）患者在化療期間的T細(xì)胞擴(kuò)增潛能和記憶表型，發(fā)現(xiàn)具有豐富早期譜系細(xì)胞的T細(xì)胞群體的患者在體外擴(kuò)增效果更好。而多次化療，如使用大劑量阿糖胞苷后，早期譜系T細(xì)胞被選擇性地消耗，從而降低CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)的殺傷功能和持久性。

2.1.3 腫瘤負(fù)荷 患者的初始腫瘤負(fù)荷與CAR-T細(xì)胞治療的療效，持久性和不良反應(yīng)的發(fā)生有關(guān)。高腫瘤負(fù)荷的患者在擴(kuò)增高峰期外周血CAR-T細(xì)胞計(jì)數(shù)更高，在輸注后早期（28 d）CAR-T細(xì)胞的持久性更好[11]。然而，盡管白血病負(fù)荷低的患者體內(nèi)擴(kuò)增的CAR-T細(xì)胞數(shù)量較少，在治療后卻有更高的EFS率和OS率，以及更少的不良反應(yīng)發(fā)生率。這可能與CAR-T細(xì)胞和CD19+白血病細(xì)胞的效靶比有關(guān)[8]。治療前白血病負(fù)荷低的患者可能提示更好的生存預(yù)后，因此在治療前應(yīng)用預(yù)處理化療方案以降低腫瘤負(fù)荷、促進(jìn)CAR-T細(xì)胞體內(nèi)增殖顯得尤為重要。

2.2 CAR-T細(xì)胞的免疫原性 目前上市CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的抗CD19單鏈抗體（single-chain fragment variable，scFv）均為鼠源性抗體，其高抗原性誘發(fā)的免疫應(yīng)答易引起短期內(nèi)T細(xì)胞的迅速耗竭。鼠源性scFv與CD19或其他靶抗原表位結(jié)合，會(huì)誘發(fā)CD8+/CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)，從而降低CD19 CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)的持久性，增加治療后陽(yáng)性復(fù)發(fā)的概率[11，15]。因此，針對(duì)CAR結(jié)構(gòu)的人源化scFv改進(jìn)是目前增加CAR-T細(xì)胞持久性的新思路之一。

2.3 CAR結(jié)構(gòu)的共刺激域 共刺激域會(huì)影響CAR-T細(xì)胞的持久性，常見(jiàn)的CAR共刺激域包括CD28和4-1BB。在ALL小鼠模型中，4-1BB CAR比CD28 CAR的持久性更好；臨床試驗(yàn)表明，CD28/CD3-z CAR-T細(xì)胞在患者體內(nèi)的中位存活時(shí)間約為30 d，在輸注后68 d內(nèi)CAR-T細(xì)胞完全耗竭[10]；相比之下，4-1BB/CD3-z CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品tisagenlecleucel的外周血中位持續(xù)時(shí)間為168 d（范圍在20～617 d）[2]。本中心報(bào)道在中國(guó)人群體中4-1BB/CD3-z CAR-T細(xì)胞的存活時(shí)間最長(zhǎng)至7個(gè)月，進(jìn)一步證實(shí)以4-1BB共刺激域的CAR-T細(xì)胞有更好的持久性[3]。引起持久性差異的可能機(jī)制有：（1）共刺激域影響細(xì)胞端粒酶活性；（2）CD28序列中的天冬氨酸殘基與活化T細(xì)胞核因子（nuclear factor of activating T cell，NFAT）的過(guò)度激活密切相關(guān)，驅(qū)動(dòng)T細(xì)胞進(jìn)入衰竭和功能障礙狀態(tài)；（3）共刺激域影響CAR-T細(xì)胞的代謝特征，CD28/CD3-z CAR促進(jìn)細(xì)胞有氧糖酵解代謝，增加效應(yīng)記憶T細(xì)胞（effector memory T cell，Tem）的產(chǎn)生；而4-1BB/CD3-z CAR增加脂肪酸氧化，促進(jìn)線粒體的生物發(fā)生，促進(jìn)中央記憶T細(xì)胞（central memory T cell，Tcm）的生長(zhǎng)，比Tem擁有更強(qiáng)的記憶性和持久性。

2.4 初始的CAR-T細(xì)胞表型 T細(xì)胞表型可能會(huì)影響CAR-T細(xì)胞的擴(kuò)增能力和殺傷功能，預(yù)示不同的治療預(yù)后?？赡芴崾局委燁A(yù)后的T細(xì)胞表型包括：（1）細(xì)胞表面的功能衰竭相關(guān)標(biāo)志物，如程序性死亡受體1（programmed death-1，PD-1）、淋巴細(xì)胞活化基因-3（lymphocyte activation gene-3，LAG-3）、T 細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白 3（T-cell immunoglobulin mucin 3，TIM-3）和TNF-α。Gardner等[16]將43例年輕B-ALL患者分為無(wú)功能應(yīng)答組（疾病無(wú)緩解或緩解后疾病復(fù)發(fā)）和功能應(yīng)答組（MRD陰性緩解為持續(xù)超過(guò)63 d）。相比功能應(yīng)答組，無(wú)功能應(yīng)答組的CD8+T細(xì)胞表達(dá)更多的LAG-3和PD-1分子。研究者通過(guò)此類型免疫標(biāo)志物建立預(yù)后預(yù)測(cè)模型，證實(shí)治療失敗和短期復(fù)發(fā)與CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品在輸注前的初始細(xì)胞表型有密切關(guān)聯(lián)；（2）輸注前共表達(dá)PD-1的CD8+LAG-3+和CD8+TIM-3+CAR-T細(xì)胞與治療失敗和復(fù)發(fā)相關(guān)；（3）CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品中干細(xì)胞樣記憶性CAR-T細(xì)胞（CAR-T memory stem cell，CAR-Tscm）的比例可能是CAR-T細(xì)胞體內(nèi)擴(kuò)增的預(yù)測(cè)因素，CAR-Tscm比例越少提示CAR-T細(xì)胞可能存在擴(kuò)增不良，引起治療后復(fù)發(fā)。

3 靶抗原缺失/下調(diào)復(fù)發(fā)機(jī)制

靶抗原缺失/下調(diào)引起復(fù)發(fā)的機(jī)制是目前CAR-T領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一，目前普遍認(rèn)為在CAR-T細(xì)胞的長(zhǎng)期免疫壓力下腫瘤細(xì)胞進(jìn)行免疫逃避調(diào)節(jié)。復(fù)發(fā)機(jī)制包括靶抗原的丟失，白血病細(xì)胞的固有異質(zhì)性演化以及譜系轉(zhuǎn)化等。

3.1 抗原丟失與下調(diào) 靶抗原從基因的轉(zhuǎn)錄到蛋白質(zhì)翻譯后修飾階段均可出現(xiàn)調(diào)節(jié)性變化，從而導(dǎo)致白血病細(xì)胞表面的抗原表達(dá)缺失或下調(diào)。

編碼CD19蛋白的基因定位于16號(hào)染色體，cd19基因的1～4號(hào)外顯子編碼蛋白胞外部分，5～13號(hào)外顯子編碼蛋白跨膜部分。CD19的缺失機(jī)制包括：（1）CD19前體蛋白的加工及成熟受阻；（2）cd19基因第2外顯子（Δex2）mRNA水平的選擇性剪接。Sotillo等[17]在CAR-T細(xì)胞治療后復(fù)發(fā)的B-ALL患者樣本中發(fā)現(xiàn)mRNA水平Δex2的選擇性剪接，大量突變堆積導(dǎo)致正常CD19蛋白被N端截短的CD19同工型蛋白取代，無(wú)法觸發(fā)CAR-T細(xì)胞的殺傷從而完成抗原逃避。（3）CD19等位基因突變。Orlando等[18]在CD19-復(fù)發(fā)樣本中發(fā)現(xiàn)選擇性剪接所占頻率極低（0%～2.7%），并非抗原丟失的主要原因。結(jié)合等位基因頻率分析，他們?cè)谒?2個(gè)復(fù)發(fā)樣本的2～5號(hào)外顯子中均觀察到至少有一個(gè)獨(dú)特的移碼插入或缺失，且該突變?yōu)镃D19基因特有，進(jìn)而提出復(fù)發(fā)患者中CD19基因的功能喪失突變才是CD19丟失的主要因素。

當(dāng)白血病細(xì)胞表面抗原的密度下調(diào)至一定閾值以下時(shí)，盡管此時(shí)抗原仍為陽(yáng)性，也可造成CAR-T細(xì)胞治療的復(fù)發(fā)。一項(xiàng)CD22 CAR-T細(xì)胞治療ALL年輕患者的臨床試驗(yàn)中，88%（7/8）的復(fù)發(fā)患者白血病細(xì)胞CD22表達(dá)較前明顯下調(diào)[19]。CD22有轉(zhuǎn)錄后蛋白質(zhì)水平的降低而無(wú)基因及mRNA水平上的明顯改變。與天然T細(xì)胞受體不同，CAR對(duì)低水平靶抗原密度的識(shí)別與殺傷能力受限，這可能與CAR的構(gòu)成、與靶抗原間的親和力、免疫突觸的結(jié)構(gòu)等有關(guān)，也為進(jìn)一步改進(jìn)CAR結(jié)構(gòu)提供了思路。

3.2 白血病細(xì)胞的生物學(xué)特性 B-ALL起始階段的CD19陰性克隆可能是CAR-T細(xì)胞治療后復(fù)發(fā)的原因之一。在2例接受blinatumomab治療后復(fù)發(fā)的BCRABL陽(yáng)性的B-ALL患者中，Nagel等[20]在初診時(shí)檢測(cè)到B前體組細(xì)胞中存在CD19-亞克隆，在復(fù)發(fā)時(shí)該克隆發(fā)展為優(yōu)勢(shì)細(xì)胞群體。與CD19類似，CD22的表達(dá)也存在異質(zhì)性，CD22陰性或CD22低表達(dá)的細(xì)胞亞群在嬰幼兒ALL患者中常見(jiàn)，成為逃避靶向CD22 CAR-T細(xì)胞治療壓力的主要原因之一。

3.3 譜系轉(zhuǎn)化 淋系向髓系腫瘤細(xì)胞的譜系轉(zhuǎn)化也是B-ALL抗原缺失/下調(diào)復(fù)發(fā)的重要機(jī)制。Jacoby等[21]構(gòu)建的E2a：PBX1白血病小鼠模型在CAR-T細(xì)胞長(zhǎng)期壓力下出現(xiàn)B細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Pax5和Ebf1的丟失，以及T系和髓系基因表達(dá)的增加。弗雷德·哈欽森癌癥中心的CAR-T細(xì)胞治療成人ALL臨床試驗(yàn)[11]與西雅圖兒童醫(yī)院的CAR-T細(xì)胞治療兒童ALL臨床試驗(yàn)[22]分別報(bào)道了1例ALL向急性髓系白血病細(xì)胞亞群轉(zhuǎn)化的患者。譜系轉(zhuǎn)換常見(jiàn)于某些特定遺傳亞型，伴有混合譜系白血病（mixed lineage leukemia，MLL）基因重排的ALL具有更強(qiáng)的遺傳可塑性[23]。

4 預(yù)防CAR-T細(xì)胞治療后靶抗原陽(yáng)性復(fù)發(fā)的對(duì)策

4.1 降低免疫源性 研究者們開(kāi)發(fā)人源化CAR-T細(xì)胞以降低scFv的免疫原性[24]。Sommermeyer等[25]構(gòu)建CD19特異性人源scFv，其具有與鼠源scFv相似的結(jié)合特性，降低CAR的潛在免疫原性的同時(shí)，在NSG小鼠模型中顯示出更強(qiáng)的細(xì)胞殺傷能力。多個(gè)國(guó)內(nèi)臨床中心使用全人源CAR-T細(xì)胞治療B-ALL、B-NHL和多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）患者，均達(dá)長(zhǎng)效緩解。據(jù)統(tǒng)計(jì)，r/r B-ALL患者在人源CD19 CAR-T細(xì)胞治療達(dá)CR后，6個(gè)月無(wú)白血病生存（leukemia free survival，LFS）率約70%～90%，6個(gè)月OS率約65%～100%[26-28]。有研究報(bào)道10例r/r B-ALL患者經(jīng)人源化靶向CD19 CAR-T細(xì)胞治療后CR達(dá)100%，1年中位隨訪時(shí)間內(nèi)僅20%（2/10）患者復(fù)發(fā)[27]。

4.2 共刺激域的優(yōu)化 CD28 CAR結(jié)構(gòu)持久性不佳的部分原因是CD28結(jié)構(gòu)中的單個(gè)氨基酸殘基易導(dǎo)致驅(qū)動(dòng)T細(xì)胞衰竭。Guedan等[29]將這種天冬酰胺重新編輯為苯丙氨酸（CD28-YMFM）后，CAR-T細(xì)胞表現(xiàn)出更持久的抗腫瘤作用。其機(jī)制是CD28-YMFM減少了CAR-T細(xì)胞的衰竭，降低其向Th17細(xì)胞分化的傾向性，從而延長(zhǎng)CAR-T細(xì)胞的持久性。

目前第三代CAR-T細(xì)胞的開(kāi)發(fā)旨在構(gòu)建包含兩種及以上共刺激域的CAR結(jié)構(gòu)，促進(jìn)CAR-T細(xì)胞的激活和擴(kuò)增。Zhao等[30]在體外建立了基于CD28和/或4-1BB共刺激的7種不同CAR-T細(xì)胞結(jié)構(gòu)，研究發(fā)現(xiàn)兩個(gè)信號(hào)刺激域（CD28和CD3ζ）聯(lián)合4-1BB配體結(jié)構(gòu)，顯示出最均衡的腫瘤殺傷功能和持久性，并伴有CD4∶CD8細(xì)胞比例降低和T細(xì)胞耗竭減少。Enblad等[31]評(píng)估了第三代CAR-T細(xì)胞在11例淋巴瘤患者和4例前體BALL患者中的有效性和安全性，50%ALL患者獲完全緩解，伴隨輕度不良反應(yīng)。但這4例ALL患者均在隨訪10個(gè)月內(nèi)因疾病進(jìn)展死亡。有研究者認(rèn)為高劑量協(xié)同刺激（CD28和4-1BB）會(huì)導(dǎo)致T細(xì)胞功能障礙[32]，從而引起治療失敗或早期復(fù)發(fā)。因此第三代CAR-T細(xì)胞的治療效果仍有待進(jìn)一步研究。

4.3 調(diào)整CAR結(jié)構(gòu)的親和力 CAR結(jié)構(gòu)的親和力對(duì)于CAR-T細(xì)胞體內(nèi)的擴(kuò)增能力和細(xì)胞殺傷能力的影響目前尚有爭(zhēng)議，且可能有靶點(diǎn)特異性[33]。平衡解離常數(shù)是反映親和力的參數(shù)，值越大，親和力越低，即抗原和抗體有更快的解離率。研究顯示一種低親和力CAR（CAT）有更強(qiáng)的增殖性和細(xì)胞毒性，并增強(qiáng)體內(nèi)抗腫瘤活性。在臨床試驗(yàn)中用CAT CAR-T細(xì)胞治療兒童r/r B-ALL患者，分子緩解率達(dá)85%（12/14）。與FMC63 CAR結(jié)構(gòu)相比，CAT CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)的擴(kuò)增增強(qiáng)，11例患者表現(xiàn)出持續(xù)性緩解，1年OS率和1年EFS率分別為63%和46%[34]。因此，低親和力CAR-T細(xì)胞在促進(jìn)體內(nèi)擴(kuò)增和增強(qiáng)細(xì)胞殺傷能力方面有良好的臨床應(yīng)用前景。

4.4 中央記憶型T細(xì)胞和干細(xì)胞樣記憶型T細(xì)胞的應(yīng)用 Tcm和干細(xì)胞樣記憶型T細(xì)胞（T memory stem cell，Tscm）是兩種能夠自我更新并持久保留在體內(nèi)的T細(xì)胞類型。如前文所述，輸注前CAR-T產(chǎn)品中CAR-Tscm的占比與細(xì)胞在體內(nèi)的有效擴(kuò)增有密切聯(lián)系。Sabatino等[35]建立了可應(yīng)用于臨床的CAR-Tscm模型，篩選出CD8+CD62L+CD45RA+幼稚T細(xì)胞并進(jìn)一步修飾，產(chǎn)生CD19-CAR修飾的CD8+Tscm。這類細(xì)胞在表型和功能上均等價(jià)于天然產(chǎn)物，同時(shí)表現(xiàn)出強(qiáng)大的代謝適應(yīng)性和持久的抗腫瘤反應(yīng)。Wang等[36]開(kāi)展一項(xiàng)針對(duì)NHL的Ⅰ期臨床試驗(yàn)，8例患者在造血干細(xì)胞移植后2 d輸注了 CD4+/CD8+的 CAR-Tcm，8例患者中 6例（75%）在1年內(nèi)疾病無(wú)進(jìn)展，表明造血干細(xì)胞移植后CD19 CAR-Tcm治療的安全性和可行性。

4.5 聯(lián)合阻斷抑制性信號(hào)通路 PD-1是細(xì)胞表面重要的細(xì)胞凋亡相關(guān)分子，與免疫細(xì)胞功能衰竭相關(guān)，其配體為PD-L1。T細(xì)胞表面的PD-1分子與腫瘤細(xì)胞表面的PD-L1結(jié)合后，啟動(dòng)T細(xì)胞凋亡信號(hào)，達(dá)到腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸目的[37]。基于PD-1/PDL-1信號(hào)通路的靶向藥物在實(shí)體瘤中有廣泛應(yīng)用。在血液疾病領(lǐng)域，CAR-T細(xì)胞治療聯(lián)合對(duì)PD-1/PDL-1信號(hào)通路的抑制，正成為提高CAR-T細(xì)胞療效及持續(xù)性的重要研究方向之一。

4.5.1 基因編輯技術(shù)敲除CAR-T細(xì)胞表面PD-1 Rupp等[38]使用基于Cas9核糖核蛋白（Cas9 ribonucleoprotein,Cas9 RNP）的基因編輯方法和慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)方案產(chǎn)生有PD-1缺陷的靶向CD19 CAR-T細(xì)胞，在體外實(shí)驗(yàn)和小鼠模型中增強(qiáng)了CAR-T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞殺傷能力和腫瘤異種移植物的體內(nèi)清除率。Ren等[39]利用CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行三基因編輯，構(gòu)建了敲除TCR，HLAⅠ類分子和PD-1的同種異體CAR-T細(xì)胞。這類編輯后的細(xì)胞在體外和動(dòng)物模型中均表現(xiàn)出更有效的抗腫瘤活性和更弱的同種異體反應(yīng)，促進(jìn)了通用型CAR-T細(xì)胞治療的發(fā)展?；诖?，同團(tuán)隊(duì)的Stadtmauer等[40]開(kāi)展的一項(xiàng)Ⅰ期臨床試驗(yàn)利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除 T 細(xì)胞表面 TCRα（TRAC）和 TCRβ（TRBC）以及PD-1共3個(gè)受體基因，并利用慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)NYESO-1受體。改造后的TCR-T在2例難治性多發(fā)性骨髓瘤和1例難治性轉(zhuǎn)移性脂肪肉瘤患者中初步表現(xiàn)出安全性與有效性。Lu等[41]使用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除T細(xì)胞的PD1基因，用于治療晚期肺癌。12例接受治療的患者中位無(wú)進(jìn)展生存期（progression-free survival，PFS）為7.7周，中位OS為42.6周。

4.5.2 CAR結(jié)構(gòu)中整合抗PD1相關(guān)分泌基因 除敲除PD1基因外，在CAR基因結(jié)構(gòu)中整合抗PD1相關(guān)分泌基因也是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。Rafiq等[42]和Nakajima等[43]開(kāi)發(fā)了分泌抗PD-1 scFv的CAR-T細(xì)胞，能夠促進(jìn)T細(xì)胞的增殖和裂解能力，降低免疫抑制，增強(qiáng)小鼠模型體內(nèi)抗腫瘤功能。此外，在一項(xiàng)Ⅰ期臨床試驗(yàn)中，細(xì)胞表面裝載了顯性失活PD1分子的CAR-T細(xì)胞表現(xiàn)出增強(qiáng)的腫瘤殺傷能力。此類CAR-T細(xì)胞治療6例復(fù)發(fā)或難治性B細(xì)胞NHL患者，最佳總體響應(yīng)率為100%，所有患者均顯示出明顯的腫瘤縮小和更低的不良反應(yīng)發(fā)生率[44]。

4.5.3 CAR-T細(xì)胞治療與PD-1/PD-L1抑制劑等聯(lián)合用藥 CAR-T細(xì)胞治療與PD-1/PD-L1抑制劑等聯(lián)合使用在實(shí)體瘤治療中研究廣泛。近期研究表明，聯(lián)合使用兩種治療方式在ALL[45]和NHL患者中有顯著的治療效果。使用靶向CD19 CAR-T聯(lián)合Nivolumab治療11例r/r B-NHL患者，總體緩解（OR）率以及CR率分別為81.2%（9/11）和45.5%（5/11）。中位 PFS 6個(gè)月，有 3例患者處于長(zhǎng)期緩解狀態(tài)[46]。除PD-1抑制劑外，CAR-T細(xì)胞治療與免疫調(diào)節(jié)劑如來(lái)那度胺等聯(lián)合使用也有明顯獲益，在小鼠模型中改善CAR-T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞之間的免疫突觸形成，增強(qiáng)抗腫瘤活性并且延長(zhǎng)細(xì)胞持久性[47]。

5 預(yù)防CAR-T細(xì)胞治療后靶抗原缺失/下調(diào)復(fù)發(fā)的對(duì)策

5.1 新型CAR靶點(diǎn) 目前已上市的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品均靶向CD19，此外，CD22也普遍表達(dá)于前體B細(xì)胞的各階段，成為CAR-T細(xì)胞的潛力靶點(diǎn)。臨床研究證實(shí)靶向CD22 CAR-T細(xì)胞可用于治療r/r B-ALL，治療后總體CR率達(dá)57%（12/21），3例患者在隨訪過(guò)程中保持持續(xù)緩解。其中80%（8/10）CD19陰性患者經(jīng)靶向CD22 CAR-T細(xì)胞治療后達(dá)到CR[19]。在淋巴細(xì)胞采集階段進(jìn)行CD4/CD8篩選，CD22 CAR-T細(xì)胞能夠表現(xiàn)出更強(qiáng)的持久性和靶向殺傷能力，58例接受治療的CD22陽(yáng)性B細(xì)胞惡性腫瘤患者CR率70%，中位OS 13.4個(gè)月。其中曾CD19靶向治療失敗的兩例患者均獲得CD22 CAR-T細(xì)胞治療后的MRD陰性CR，這表明對(duì)靶向CD19 CAR-T細(xì)胞治療無(wú)反應(yīng)并不影響對(duì)CD22靶向的反應(yīng)[48]。

此外，B細(xì)胞特異性標(biāo)志物B細(xì)胞活化因子受體（B-cell activating factor，BAFF-R）是一種廣泛的B譜系標(biāo)記，表達(dá)限于祖細(xì)胞階段至漿細(xì)胞發(fā)展階段。靶向BAFF-R的CAR-T細(xì)胞表現(xiàn)出對(duì)淋巴瘤和ALL細(xì)胞的有效殺傷，其靶向性可能會(huì)阻止CD19抗原無(wú)效變體的出現(xiàn)[49]，有應(yīng)用于CD19陰性復(fù)發(fā)患者的潛力。

5.2 序貫治療及多靶點(diǎn)CAR-T

5.2.1 序貫療法 針對(duì)多種靶抗原的CAR-T細(xì)胞序貫治療成為臨床上克服CD19陰性復(fù)發(fā)的新方案。有研究通過(guò)序貫輸注抗CD19、抗CD22 CAR-T細(xì)胞治療51例r/r B-ALL患者，48例CR患者的中位PFS為13.6個(gè)月，且1年CIR僅29%[50]。另有研究報(bào)道在20例r/r ALL兒童患者中開(kāi)展序貫輸注抗CD19、抗CD22 CART細(xì)胞治療，1年LFS率為79.5%，其中17例患者保持長(zhǎng)期緩解，6個(gè)月內(nèi)無(wú)復(fù)發(fā)患者，1年CIR僅15%[51]，證實(shí)序貫療法可有效預(yù)防白血病靶抗原的丟失，降低復(fù)發(fā)率。

5.2.2 雙靶點(diǎn)CAR或多靶點(diǎn)CAR 一系列Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)證實(shí)雙靶點(diǎn)CAR-T細(xì)胞在患者中有顯著的治療緩解率和更低的復(fù)發(fā)率。有研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了CD19-CD22雙靶點(diǎn)CAR-T細(xì)胞，CD19或CD22均可激活CAR-T細(xì)胞。6例接受該CD19-CD20 CAR-T細(xì)胞治療r/r ALL患者均達(dá)MRD陰性CR[52]。隨后該團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)出CD19-CD20雙靶點(diǎn)CAR-T細(xì)胞，用于治療28例r/r NHL患者，CR率為71%，12個(gè)月PFS為64%[53]。此外，研究證實(shí)雙靶向CD19和CD123的CAR-T細(xì)胞在ALL小鼠模型中有望預(yù)防CD19缺失/下調(diào)復(fù)發(fā)。抗CD123 CAR-T細(xì)胞能夠有效識(shí)別CD19陰性白血病母細(xì)胞，建立長(zhǎng)程突觸，從而延長(zhǎng)了細(xì)胞的生存時(shí)間[54]。

CD19-CD20-CD22 3靶點(diǎn)CAR-T細(xì)胞在體外和ALL小鼠模型，尤其是CD19陰性的B-ALL中有顯著的抗腫瘤活性，相較于CD19單靶點(diǎn)CAR-T細(xì)胞顯著延緩了腫瘤進(jìn)展[55]，證實(shí)了CD19-CD20-CD22 CAR-T細(xì)胞能夠有效控制針對(duì)CD19陰性的抗原逃避。

5.3 CAR-T細(xì)胞治療后橋接異基因造血干細(xì)胞移植異基因造血干細(xì)胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT）可以重建骨髓微環(huán)境，通過(guò)發(fā)揮移植物抗宿主作用（graft versus leukemia，GVL）殺傷白血病細(xì)胞，從而長(zhǎng)期緩解疾病。接受CAR-T細(xì)胞治療后的ALL患者是否需要橋接allo-HSCT，目前國(guó)際上仍有爭(zhēng)議。Park等[8]使用靶向CD19 CAR-T細(xì)胞治療51例R/R ALL患者，部分患者（17例）MRD轉(zhuǎn)陰后橋接移植，相較于未移植者（15例）并未顯示出明顯的生存獲益。但相反地，有數(shù)據(jù)顯示CAR-T細(xì)胞治療后橋接HSCT可使患者獲得更長(zhǎng)的LFS和OS以及更低的復(fù)發(fā)率。有研究團(tuán)隊(duì)報(bào)道盡管接受allo-HSCT患者的OS與未移植者沒(méi)有差異，但allo-HSCT顯著延長(zhǎng)了EFS和無(wú)復(fù)發(fā)生存期[56]。另有研究團(tuán)隊(duì)報(bào)道了相似結(jié)論，52例CAR-T細(xì)胞治療后接受allo-HSCT的ALL患者1年CIR僅24.7%[57]。近期北京陸培華團(tuán)隊(duì)報(bào)道110例r/r ALL患者接受抗CD19 CAR-T細(xì)胞治療的臨床研究結(jié)果，102例達(dá)CR的患者有75例橋接allo-HSCT，移植組顯示出更高的1年OS率和LFS率[58]。筆者團(tuán)隊(duì)聯(lián)合國(guó)內(nèi)多中心開(kāi)展的最新臨床研究納入122例經(jīng)CAR-T細(xì)胞治療后達(dá)MRD-CR的r/r B-ALL患者，55例患者接受半相合造血干細(xì)胞移植（移植組），67例患者隨訪觀察（未移植組），相較于未移植組，移植組有更高的2年OS率和LFS率，且44例移植前MRD-患者的2年CIR僅17.3%[59]。以上研究均支持CAR-T細(xì)胞治療后橋接allo-HSCT可明顯減少r/r B-ALL的復(fù)發(fā)。因此我們認(rèn)為對(duì)于r/r B-ALL患者，經(jīng)CAR-T細(xì)胞治療誘導(dǎo)緩解后，應(yīng)盡早橋接allo-HSCT以獲得疾病的長(zhǎng)期緩解。

6 小結(jié)與展望

如今，全球正步入免疫治療的新時(shí)代，CAR-T細(xì)胞療法成為其中的重要一環(huán)。如何克服CAR-T細(xì)胞治療中的各類不良反應(yīng)，預(yù)防CAR-T細(xì)胞治療后的各類復(fù)發(fā)，獲得長(zhǎng)期緩解率和生存率，成為亟待解決的問(wèn)題。CAR-T細(xì)胞治療發(fā)展歷程尚短，有充足的拓展空間和巨大的潛力。我們相信探索新的靶點(diǎn)和CAR結(jié)構(gòu)，結(jié)合基因編輯等前沿技術(shù)，聯(lián)合多種化學(xué)治療和免疫治療手段，以及結(jié)合allo-HSCT等多種改進(jìn)手段，能夠使r/r B-ALL患者獲得更好的疾病緩解和更大的生存獲益，為人類健康做出更大貢獻(xiàn)。