何宏魁，李冬冬，劉國(guó)英，李曉歡，李 蘭，曹潤(rùn)潔，李安軍

（1.安徽古井貢酒股份有限公司，安徽亳州 236820；2.安徽省固態(tài)發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，安徽亳州 236820）

釀酒微生物在白酒生產(chǎn)過程中起著極其重要的作用，從大曲的生產(chǎn)到窖池發(fā)酵，都有釀酒微生物的參與，其中酵母菌作為主要的釀酒微生物之一存在于大曲中[1]，在白酒釀酒過程中起著至關(guān)重要的作用。隨著現(xiàn)代生物工程技術(shù)的發(fā)展，功能性酵母菌逐漸被發(fā)現(xiàn)，如釀酒酵母(Saccharomyces)、假絲酵母(Candida)、接合酵母(Zygosaccaromyces)、伊薩酵母(Issatchonkia)、扣囊復(fù)膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）和異常畢赤酵母（Pichia anomala）、檸檬形接合酵母(Zygosaccaromyces cidrci)、東方伊薩酵母(Issatchonkia orientalis)、畢赤酵母(Pich-ia burtonii)、漢遜酵母(Hanseniaspora)[2-6]等。這些酵母分別起著釀酒和生香的作用。

以從安徽古井貢酒桃花曲中分離出的1株釀酒酵母菌為研究對(duì)象，分析菌株生長(zhǎng)代謝特征，探究在白酒發(fā)酵過程中添加強(qiáng)化此菌株對(duì)白酒生產(chǎn)帶來的影響。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

菌株：從古井桃花曲中分離出的1株酵母菌。

試劑：酵母菌基因組DNA提取試劑盒（天根）、Taq酶（生工）。

儀器設(shè)備：SX-70高壓滅菌鍋，IMH400-S生化培養(yǎng)箱、MaxQ 485HP振蕩培養(yǎng)箱、PCR儀、WatersI-Class/Xevo TQD氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GCMS）、Agilent 6890A氣相色譜。

1.2 試驗(yàn)用培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，胰蛋白胨20 g，酵母膏10 g，蒸餾水1000 mL，pH5.0～5.5，115 ℃滅菌20 min。

液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：糖度為12 Bx的高粱糖化液。

固態(tài)培養(yǎng)基：新鮮干燥的麩皮、玉米粉。孟加拉紅培養(yǎng)基（成品），121 ℃滅菌30 min。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 分子生物學(xué)鑒定

根據(jù)酵母菌分類學(xué)研究標(biāo)準(zhǔn)方法做分子鑒定。酵母核基因組的提取使用酵母基因組DNA提取試劑盒，按照說明書操作。

使用引物NL1和NL4進(jìn)行26S rDNA D1/D2區(qū)的擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（50 μL）：50 mg/L模板2 μL，10 μmol/L上下游引物各1 μL，dNTP 5 μL，buffer 5 μL，Taq酶0.5 μL，最后添加ddH2O定容50 μL。反應(yīng)條件：94 ℃/3 min；94 ℃/1 min，55 ℃/1 min，72 ℃/1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃/10 min。PCR產(chǎn)物北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI的Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)。

1.3.2 酵母發(fā)酵的制備

將菌株接種到孟加拉紅固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)2～3 d活化；然后用接種環(huán)將活化后的菌株轉(zhuǎn)接到20 mL YPD培養(yǎng)基的三角瓶中，于28 ℃120 r/min培養(yǎng)24 h；取酵母菌種子液接種到裝有250 mL高粱發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，裝液量10 mL，在120 r/min，28 ℃條件下?lián)u床培養(yǎng)72 h。

1.3.3 發(fā)酵代謝產(chǎn)物分析

（1）氣相色譜分析條件

分流進(jìn)樣，分流比60∶1，進(jìn)樣口溫度：230 ℃；升溫程序：35 ℃保持3 min，然后以5 ℃/min程序升溫至100 ℃，不保持，再以10 ℃/min升溫至195 ℃，保持18 min。

（2）氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀分析條件

進(jìn)樣不分流，流速0.9 mL/min；進(jìn)樣口溫度：230 ℃；升溫程序：35 ℃保持4 min；以2 ℃/min升溫到60 ℃不保持，以6 ℃/min升溫到180 ℃保持15 min。

1.3.4 酵母曲的制備及其理化分析

（1）酵母曲的制備

將試管中的酵母菌接種到裝有250 mL的YPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃、120 r/min搖床培養(yǎng)48 h。然后將培養(yǎng)好的種子液轉(zhuǎn)接到3 L YPD液體培養(yǎng)基，28 ℃、120 r/min搖床培養(yǎng)48 h。最后轉(zhuǎn)接到固態(tài)培養(yǎng)基（麩皮與水1∶1，高壓滅菌處理），品溫控制在30 ℃，培養(yǎng)36 h。

（2）酵母曲理化分析

菌落數(shù)測(cè)定：根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.2—2010。

發(fā)酵力測(cè)定：參考企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QJ/GJ 08.01—2017。

1.3.5 酵母曲強(qiáng)化發(fā)酵釀酒試驗(yàn)

根據(jù)實(shí)際情況，制定釀酒試驗(yàn)方案，實(shí)驗(yàn)共20個(gè)窖池（實(shí)驗(yàn)組10個(gè)，對(duì)照組10個(gè)）。

實(shí)驗(yàn)一：實(shí)驗(yàn)組大米查一加1 kg釀酒酵母曲強(qiáng)化發(fā)酵；對(duì)照班組按照正常工藝操作，不添加酵母曲。

實(shí)驗(yàn)二：實(shí)驗(yàn)組大米查一、大米查二各加1 kg釀酒酵母曲強(qiáng)化發(fā)酵；對(duì)照班組按照正常工藝操作，不添加酵母曲。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵代謝產(chǎn)物分析

將酵母菌發(fā)酵液代謝的揮發(fā)性產(chǎn)物采用頂空氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用（HS-SPME-GC-MS）技術(shù)進(jìn)行分析，其總離子流圖譜如圖1所示，代謝產(chǎn)物分析結(jié)果見表1。

圖1 酵母液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物HS-SPME-GC-MS分析總離子流圖

表1 酵母菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物HS-SPME-GC-MS分析結(jié)果

由表1可以看出，該釀酒菌株發(fā)酵產(chǎn)物中，主要代謝產(chǎn)物是乙醇，代謝比例占40.24%，是白酒的主體成分。其次代謝19.89 %的3-甲基丁醇和15.33%的苯乙醇。3-甲基丁醇和苯乙醇均是白酒中重要的風(fēng)味成分。其中3-甲基丁醇具有果香，可以增加酒體的醇甜感，讓酒體更豐滿[7]；苯乙醇是米香型白酒的主體香味成分之一[8]。該酵母菌株還代謝出其他揮發(fā)性香味物質(zhì)，如辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸苯乙酯、辛酸等，這些香氣成分，在白酒香氣形成中扮演著重要角色。在濃香型白酒的主體香味成分中，辛酸乙酯的絕對(duì)含量并不高，但其香氣強(qiáng)度貢獻(xiàn)值比傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為的四大酯中的乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯均要大，僅次于己酸乙酯，呈現(xiàn)較強(qiáng)的果香味。

2.2 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

測(cè)序得到的26S rDNA基因序列，保留其可靠的587 bp序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。序列如下：

通過NCBI的BLAST比對(duì)，該菌株的序列與釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的序列相似性為100%。

2.3 酵母曲理化分析

該酵母菌株制備的酵母曲，每1 g絕干功能曲中，酵母菌數(shù)量為8.1×108～11.6×108cfu。同時(shí)對(duì)釀酒功能曲進(jìn)行發(fā)酵力檢測(cè)，將其曲浸出液稀釋1000倍后，發(fā)酵力依然為213.6 g/100 g·72 h。

2.4 酵母曲強(qiáng)化發(fā)酵釀酒試驗(yàn)

根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案，對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組窖池升溫情況進(jìn)行測(cè)量對(duì)比，結(jié)果如圖2所示。

圖2 釀酒實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組窖池溫度變化

由圖2可以看出，從窖池溫度變化曲線來看，符合濃香型白酒發(fā)酵溫度變化規(guī)律。實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組升溫較快，頂溫高出1～2 ℃，且中挺時(shí)間長(zhǎng)2 d左右，到緩落時(shí)期，實(shí)驗(yàn)組溫度下降相對(duì)較慢。

根據(jù)試驗(yàn)方案，對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組對(duì)應(yīng)窖池出酒率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析，結(jié)果如圖3所示。

圖3 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組出酒率、名酒率對(duì)比

由圖3可以看出，實(shí)驗(yàn)一組與對(duì)照一組相比較，出酒率提高了1.67%，名酒率提高了0.89%；實(shí)驗(yàn)二組與對(duì)照二組相比較，出酒率提高了2.31 %，名酒率提高了0.62 %；實(shí)驗(yàn)二組與實(shí)驗(yàn)一組相比較，其出酒率較實(shí)驗(yàn)一略高，名酒率無差異。

對(duì)酒樣進(jìn)行氣相分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖4所示。

圖4 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照酒樣成分含量

由圖4可知，實(shí)驗(yàn)組的酒樣中己酸乙酯、乙縮醛、己酸、總酸含量均高于對(duì)照組，而乙酸乙酯、乳酸乙酯含量低于對(duì)照組，尤其是乳酸乙酯降低明顯，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組的乳酸乙酯分別降低了19.3 %、21.4 %；各組實(shí)驗(yàn)之間相比較，實(shí)驗(yàn)二總酯含量最高為832.5 mg/100 mL。

取本次實(shí)驗(yàn)混合酒樣進(jìn)行專業(yè)品評(píng)，結(jié)果如表2所示。

表2 釀酒實(shí)驗(yàn)混合酒樣品評(píng)結(jié)果

由表2可知，添加優(yōu)良釀酒酵母曲的實(shí)驗(yàn)方案一和方案二的酒樣較對(duì)照組酒樣，酒質(zhì)更優(yōu)，且實(shí)驗(yàn)方案二的酒樣優(yōu)于實(shí)驗(yàn)方案一酒樣。

3 討論

利用分子鑒定技術(shù)對(duì)古井桃花曲中1株酵母菌進(jìn)行鑒定，該菌株為釀酒酵母(Saccharomyces)。對(duì)其發(fā)酵代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析結(jié)果表明，該酵母菌發(fā)酵產(chǎn)生多種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，本次共檢測(cè)出49種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，主要包括醇類、酯類、酚類、酸類等。其中醇類物質(zhì)含有10種，相對(duì)含量高達(dá)76.51%，尤其是乙醇、3-甲基丁醇、苯乙醇，相對(duì)含量為75.46%。將釀酒酵母制備成曲后，發(fā)酵力明顯強(qiáng)于大曲，并且具有一定的酯化力。將此酵母曲與大曲共同混合組配，用于釀酒生產(chǎn)，發(fā)現(xiàn)添加釀酒曲后，窖池的升溫較快，并且頂溫要比對(duì)照組高出1～2 ℃，且整個(gè)發(fā)酵過程中試驗(yàn)組的酒醅升溫都略高于對(duì)照組。試驗(yàn)組的出酒率也高于對(duì)照組2 %左右。實(shí)驗(yàn)組的酒樣中己酸乙酯、乙縮醛、己酸、總酸含量均高于對(duì)照組；乙縮醛是濃香型白酒老熟和質(zhì)量的重要標(biāo)志之一，也是有別于低檔酒的指標(biāo)之一[9]；而乙酸乙酯、乳酸乙酯含量低于對(duì)照組，尤其是乳酸乙酯降低明顯；各組實(shí)驗(yàn)之間相比較，實(shí)驗(yàn)二總酯含量最高?？梢?，添加了本株功能釀酒酵母菌株可以起到“增己降乳”的作用，使酒體酯類比例更協(xié)調(diào)，進(jìn)一步提高了基酒的品質(zhì)。