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        濃香型白酒窖泥中一株產(chǎn)己酸功能菌的研究

        2020-01-08 05:07:36李俊薇劉占奇董孝元
        釀酒科技 2019年12期
        關(guān)鍵詞:己酸濃香型菌液

        張 超,李俊薇,劉占奇,孫 琳,董孝元,李 瑞

        (1.黃鶴樓酒業(yè)有限公司,湖北武漢 430050;2.武漢雅仕博科技有限公司,湖北武漢 430050)

        白酒中的有機(jī)酸可以調(diào)節(jié)白酒口味使酒體醇和爽口,不同的有機(jī)酸與醇在各種微生物酶的催化作用下生成不同的酯。其中己酸乙酯作為濃香型白酒的主體香是判定濃香型白酒質(zhì)量等級的關(guān)鍵指標(biāo)[1]。濃香型白酒采用全泥窖發(fā)酵模式,因而窖泥的質(zhì)量也就成為影響濃香型白酒質(zhì)量的關(guān)鍵因素之一,而窖泥中微生物的種類與數(shù)量又決定著窖泥的質(zhì)量,環(huán)環(huán)相扣密不可分[2]。窖泥中的微生物以細(xì)菌為主,尤其以芽孢桿菌為多,生長繁殖需嚴(yán)格厭氧環(huán)境且生長速度緩慢[3]?,F(xiàn)階段借助于一代測序技術(shù),可以從16S rDNA序列分析入手對微生物進(jìn)行種屬的鑒定,對微生物的研究更加深入。因此,開展對產(chǎn)己酸微生物的選育、培養(yǎng)及應(yīng)用研究,對于提高濃香型白酒質(zhì)量有著非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。

        本研究從黃鶴樓酒業(yè)濃香型白酒窖泥著手,篩選關(guān)鍵功能微生物,進(jìn)行單菌株發(fā)酵鑒定,并對發(fā)酵液的己酸等有機(jī)酸定量分析,為濃香型白酒生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料、試劑及儀器

        樣品:窖泥,樣本取自黃鶴樓酒業(yè)濃香窖池。

        富集培養(yǎng)基(巴氏合成培養(yǎng)基):醋酸鈉0.5%,硫酸鎂0.02 %,硫酸銨0.05 %,酵母浸粉0.1 %,磷酸氫二鉀0.04%,pH5.8~7.0,121 ℃滅菌20 min,接種前加入無水乙醇2%。

        分離培養(yǎng)基:在富集培養(yǎng)基中加入瓊脂2 %,碳酸鈣2%。

        儀器設(shè)備:DZF-6050B真空培養(yǎng)箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;顯微鏡EclipseE100;DYY-6D型電泳儀,北京市六一儀器廠;TC-96/GPCR擴(kuò)增儀;ChampGel5000凝膠成像儀。

        1.2 實(shí)驗(yàn)方法

        1.2.1 富集培養(yǎng)[4]

        樣品預(yù)處理:稱取1 g優(yōu)質(zhì)窖泥,加入裝有100 mL無菌水的三角瓶中,以180 r/min振蕩30 min后在80 ℃恒溫水浴鍋中處理10 min以消除非芽孢菌體,在預(yù)熱過程中不斷晃動三角瓶避免局部受熱[5]。冷卻至30~40 ℃,無菌條件下吸取1 mL樣品液于20 mL富集培養(yǎng)基,加入2 %(體積分?jǐn)?shù))無水乙醇進(jìn)行試管培養(yǎng),用500 μL液體石蠟封住培養(yǎng)基液面以隔絕外部空氣[6],用膠塞封口,置于真空干燥箱中,抽真空0.08 MPa左右,充入N2以此循環(huán)2次,在34 ℃下恒溫培養(yǎng)10 d,觀察試管內(nèi)菌液產(chǎn)氣情況。

        1.2.2 分離純化

        將富集培養(yǎng)后的菌液再進(jìn)行80 ℃水浴熱處理10 min。在無菌室中用無菌吸管吸取菌液1 mL,放入盛有9 mL無菌水的吸管中,依次稀釋到10-3,取10-1、10-2、10-33個(gè)稀釋度的稀釋液與50 ℃分離培養(yǎng)基混合倒板、搖勻,34 ℃培養(yǎng)3~5 d。

        將不同形態(tài)的單菌落分別接種于20 mL巴氏液態(tài)培養(yǎng)基中培養(yǎng)15 d,觀察產(chǎn)氣情況以及對培養(yǎng)液定性分析確定有己酸。反復(fù)進(jìn)行3次單菌純化工作,確認(rèn)為純種后可進(jìn)行保藏[7]。

        1.2.3 定性鑒定及鏡檢

        吸取2 mL混合均勻的己酸培養(yǎng)液,加入2%硫酸銅溶液2 mL,然后再加1 mL乙醚后充分振蕩混合均勻,靜置分層后觀察乙醚層顏色。如果乙醚層呈藍(lán)綠色,則證明菌液中含有己酸,且顏色越深己酸含量越高[8]。

        1.2.4 分子生物學(xué)鑒定

        DNA提取[9]:使用上海生工單菌株基因組試劑盒提取DNA。

        PCR擴(kuò)增[10-11]:采用引物27F/1492R對Z-1進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增。

        引物序列:27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')。

        1492R:(5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')。

        PCR反應(yīng)體系(20 μL):dH2O 3.5 μL;Primer(2 μM)5 μL,2× Direct PCR Mix 10 μL;基因組DNA 1 μL;Taq酶0.5 μL。

        PCR擴(kuò)增條件:

        取5 μL反應(yīng)液進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠(120 V,25 min)電泳,使用Marker DL2000。

        1.2.5 己酸測定

        1.2.5.1 定性分析

        方法同1.2.3。

        1.2.5.2 定量分析[12]

        GC檢測條件:檢測器:氫離子火焰檢測器;色譜柱:DB-Wax(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。

        溫度程序:50 ℃保持2 min,以15 ℃/min升至230 ℃保持2 min;檢測器溫度230 ℃;載氣He,流速1 mL/min。

        液體樣品處理:吸取3 mL發(fā)酵液樣品在10000 r/min、4 ℃條件下離心5 min,通過濾膜過濾后吸取1 mL濾液到含有100 μL 2-乙基丁酸(1.010 g/L)的10 mL容量瓶中,并用體積分?jǐn)?shù)為1%的甲酸定容至刻度,混合均勻后吸取1 μL進(jìn)行氣相色譜測定。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 產(chǎn)己酸菌分離結(jié)果

        通過多次分離純化,共分離得到2株產(chǎn)己酸菌,分別記為Z-1、Z-2,菌株特征見表1和圖1所示,均為革蘭氏陽性微生物;兩株微生物的定性顯色反應(yīng)如圖2所示;從圖1可以看出,菌株Z-1產(chǎn)己酸量高于Z-2,在試驗(yàn)中優(yōu)選Z-1做理想菌株保存。

        表1 菌落形態(tài)及顯微形態(tài)

        圖1 鏡檢圖(10×100)

        圖2 定性顯色圖

        2.2 菌種分子生物學(xué)鑒定

        提取菌株Z-1基因組DNA,然后以基因組DNA為模板對16S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增,其瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖3所示,為單一條帶、明亮條帶,1.4 kb左右。

        圖3 菌種基因組DNA PCR產(chǎn)物電泳圖

        將菌株Z-1的16S rDNA(1464bp)序列輸入美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI) 數(shù)據(jù)庫中做BLAST分析,與GenBank數(shù)據(jù)庫中同源性最高的已知分類菌株序列進(jìn)行比較,菌株Z-1與Aneurinibacillus migulanus同源性最高為99%,因此可以鑒定菌株Z-1為Aneurinibacillus migulanus[13],測序結(jié)果見表2。

        2.3 己酸測定分析

        2.3.1 定性測定

        微生物產(chǎn)己酸定性顯色反應(yīng)結(jié)果如圖4,經(jīng)3次轉(zhuǎn)接后Z-1顯色效果良好。

        2.3.2 定量測定(圖5)

        從圖5可以得出,利用氣相色譜法可以一次性測出發(fā)酵液中的己酸、丁酸等有機(jī)酸含量。Z-1發(fā)酵液樣品中檢測出己酸含量為3.5 g/L,丁酸含量1.12 g/L。

        表2 Z-1測序結(jié)果

        圖4 定性顯色圖

        圖5 Z-1發(fā)酵液色譜圖

        3 討論

        本試驗(yàn)通過對黃鶴樓酒業(yè)濃香型白酒窖泥進(jìn)行微生物分離純化,鑒定出1株高產(chǎn)己酸的硫胺素芽孢桿菌,并利用氣相色譜對單菌株發(fā)酵液進(jìn)行己酸定量測定,其產(chǎn)己酸量達(dá)3.5 g/L。

        但關(guān)于硫胺素芽孢桿菌[14-15]的生長規(guī)律方面還有待進(jìn)一步研究,根據(jù)菌株的生長規(guī)律可有針對性的應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中。在后期應(yīng)用于窖池養(yǎng)護(hù)與窖泥制作過程中,要注意其生長階段的選取,這樣可以有效縮短發(fā)酵期。

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